Skip to content

Institutul Cantacuzino

Profesionalismul si experienta noastra pentru sanatatea dumneavoastra !
Articole in aceasta categorie:
  • Proiect 42-150
  • Proiect 42-125
  • Proiect 61-026
  • Proiect 62-052
  • Proiect 42-106
  • Proiect 61-021
  • Proiect 42-164
  • Proiect 42-116
  • Proiect 61-019
  • Proiect 41-021

  • Cod identificare proiect: CNMP 42-150/2008-2011

    Titlul proiectului: Cercetari interdisciplinare privind solutionarea unor noi aspecte de antibiorezistenta cu implicatii majore in patologia chirurgicala cardiovasculara si gastroenterologica.

    Coordonatorul proiectului: INCDMI Cantacuzino, Bucuresti, Director de proiect: Dr. Israil Michaela-Anca CS I Institut Cantacuzino Bucuresti

    Parteneri de consortiu:

    P1- Clinica I Chirurgicala a Spitalului Universitar Bucuresti, Responsabil de proiect: Prof. dr. Radu Palade

    P2- Institutul de Boli Cardiovasculare Prof. C.C.Iliescu, Responsabil de proiect dr. biol. Otilia Banu

    P3- Catedra de Microbiologie de la Facultatea de Biologie a Universitatii Bucuresti, Responsabil de proiect: prof. dr. Grigore Mihaescu

    Scopul proiectului: investigarea cu ajutorul  metodelor  complexe fenotipice si molecular genetice a unor mecanisme noi de AR de importanta globala pentru stabilirea si validarea unor metode optimizate de detectare corecta si cit mai precoce a AR in laboratorul clinic, in scopul implementarii finale a antibioterapiei tintite in infectiile chirurgicale abordate.


    Obiective generale si specifice ale proiectului:

    Obiectiv general: studiul complex la nivel fenotipic, genotipic si clinic al unor aspecte noi de AR semnalate in practica medicala chirurgicala,  in scopul optimizarii si eficientizarii antibioterapiei  in serviciile de chirurgie  gastroenterologica si cardiovasculara

    Obiective specifice:

    Obiectiv specific 1. Stabilirea paletei de etiologii si a frecventei tulpinilor microbiene implicate in etiologia infectiilor bacteriene in chirurgia gastroenterologica si cardiovasculara;

    Obiectiv specific 2. Determinarea frecventei unor mecanisme noi de AR la tulpinile aerobe si respectiv anaerobe, izolate din infectii abdominale, si respectiv hemoculturi si dispozitive cardiovasculare;

    Obiectiv specific 3. Reactualizarea break-points-urilor (CMI, zone de inhibitie a cresterii microbiene) si cut-off-urilor tulpinilor bacteriene implicate in patologia infectioasa chirurgicala in scopul instituirii unor metode optimizate de detectare corecta si precoce a AR la nivel de laborator clinic;

    Obiectiv specific 4. Implementarea rezultatelor obtinute in clinicile de chirurgie partenere si analiza oportunitatilor de extrapolare a rezultatelor obtinute in alte unitati spitalicesti cu profil similar

    Etapele de realizare

    ETAPA I- febr.  2009

    • Demararea recoltarii intraoperatorii
    • Demararea izolarii si identificarii
    • Demararea determinarii fenotipice a factorilor de virulenta
    • Demararea determinarii experimentale a rezistentei fenotipice (recalcitranta) a biofilmelor

    ETAPA II- dec. 2009

    • Continuarea recoltarii intaoperatorii
    • Continuarea izolarii si identificarii
    • Caracterizarea fenotipica a factorilor de virulenta si antibiorezistenta
    • Determinarea CMI, break points si a cut-off-urilor
    • Urmarirea evolutiei clinice a bolnavilor

    ETAPA III- dec. 2010

    • Determinarea fenotipica de AR si a factorilor de virulenta
    • Determinarea experimentala a rezistentei fenotipice (recalcitranta) a biofilmelor
    • Biologie moleculara AR si factori de virulenta
    • Determinarea CMI, break points si cut-off-uri
    • Baza de date electronica si portal web

    ETAPA IV- august 2011

    • Continuarea recoltarii
    • Continuarea izolarii si identificarii
    • Determinarea fenotipica AR si a factorilor de virulenta, inclusiv determinarea experimentala a rezistentei fenotipice (recalcitranta) a biofilmelor
    • Biologie moleculara AR
    • Determinarea CMI si break points si cut-off-uri
    • Urmarirea evolutiei clinice a bolnavilor sub tratament
    • Baza de date electronica si portal web


    Rezumatul proiectului

    Proiectul a studiat aspecte fenotipice si moleculare  ale factorilor de virulenta(FV)  si  de antibiorezistenta(AR), la  tulpinile bacteriene izolate din infectii asociate chirurgiei cardiovasculare si respectiv cazurilor clinice de urgente chirurgicale abdominale .

    In cazul infectiilor asociate chirurgiei cardiovasculare a fost demonstrat  riscul inalt al colonizarii cu tulpini nozocomiale de origina duala: exogena (comunitara) si endogena cu predominanta  Gram (-) nonfermentativi (Ps.aerug) urmati de Enterobacteriaceae, flora microbiana  dublata permanent de  prezenta  infectiilor cu Candida. A fost evidentiata o incidenta crescuta a rezistentei (R) la beta-lactamice, aminoglicozide, quinolone. S-a demonstrat experimental  AR crescuta a celulelor bacteriene din biofilme fata de celulele planctonice, patternele de colonizare fiind influentate de structura suprafetelor si compozitia chimica a materialelor protetice cit si de specia de bacterii colonizatoare.

    In cazul infectiilor asociate cu urgentele chirurgicale abdominale s-au izolat predominant bacterii de origina endogena cu frecventa cea mai inalta fiind Enterobacteriaceaele si  tulpinile anaerobe Gram (-).

    Prevalenta tulpinilor bacteriene cit si a FV in cazuri clinice apartinind grupurilor cu nivel de risc ridicat a demonstrat  ca agresiunea bacteriana este influentata  evident  de virsta pacientilor, status-ul  imunitar, co-morbiditati, contactul cu mediu spitalicesc si antibioterapiile  repetate ce au favorizat selectarea de tulpini rezistente, toate aceste aspecte conducind la procese infectioase complexe severe.

    Studiul gradului de eficienta a antibioticelor  cu spectru larg, din trusele de terapie empirica pre-operatorie a demonstrat o departajare evidenta,  in aceasta trusa,  a unui grup de  antibiotice ramase eficiente si a unui al doilea grup de antibiotice  fata de care a fost evidentiata emergenta  unei populatii bacteriene  rezistente , aspect ce reprezinta un semnal de alarma si care pledeaza pentru necesitatea instituirii in viitor, a unui  control  periodic  al eficientei antibioticelor din respectiva  trusa de tratament empiric preoperator cu reajustarea acesteia in conformitate cu noile aspecte de AR semnalate.

    Valorificarea si diseminarea rezultatelor 2009-2010:

    1. 1. Lucrari  prezentate  la Congrese Internationale:

    C.Delcaru (Larion), C.M.Chifiriuc, C.Bleotu, R.S.Palade, D.Vasile, D.Voiculescu, D.Davitoiu, T.Nastasescu, H.Roman, I.Caplan, A.Ilco, M.Tomescu, A.M. Israil. Hallmarks of some bacterial strains isolated in surgical abdominal emergencies. FEMS 2009 3-rd Congress of European Microbiologists, Gothenburg Sweeden, 28 July, 2, p 84, P 17

    .Lucrari publicate in volume de conferinte internationale cu cenzori:

    Otilia Banu, Carmen Mariana Chifiriuc, Veronica Lazǎr, Tatiana Sesan, Coralia Bleotu. Study of the relationship between infectious agents of cardiovascular diseases, prosthetic devices and eukaryotic cell. SOMED Congress, Greece, 3-12 Sept 2010

    2. Articole acceptate pentru publicare in reviste medicale ISI:

    Anca –Michaela Israil, Cristina Delcaru, R.S. Palade, Carmen Chifiriuc, Carmen Iordache, D.Vasile,

    M.Grigoriu, D. Voiculescu. Bacteriological Aspects Implicated in Abdominal Surgical Emergencies.    Articol  acceptat la revista “ Chirurgia” nr.6,  2010 (in press)

    Study of the relationships between bacterial strains isolated from biofilm associated cardiovascular infections, prosthetic devices and the eukaryotic cell. Otilia Banu, Carmen Mariana Chifiriuc, Coralia Bleotu, Veronica Lazǎr. (in press- Anaerobic).

    3. Lucrari publicate in volume de conferinte nationale cu cenzori:

    3.a. Delcaru Cristina, Carmen-Mariana Chifiriuc, Anca Israil.Optimizarea unor metode de testare a sensibilitatii la antibiotic la bacteriile anaerobe implicate in patologia tubului digestiv. Sesiunea Biologilor din Romania, 24-25 octombrie 2009, si publicata in Revista Romana de Laborator Clinic anul IV, nr.16, nov.2009, p.36

    3.b. Cristina Delcaru, Carmen-Mariana Chifiriuc, Anca Israil. Aspecte privind standardizarea metodelor de testare a sensibilitatii la antibiotic a bacteriilor anaerobe implicate in patologia tubului digestiv. Simpozionul thematic 18 noiembrie 2009, Ziua Europeana a Informarii despre Antibiotice p.17

    4. Comunicari:

    Cristina Delcaru (Larion), Anca Israil. Izolarea, identificarea si caracterizarea spectrului de antibiosensibilitate la antibiotice a bacteriilor anaerobe implicate in patologia tractului digestiv.

    Sesiunea de Comunicari Stiintifice a Facultatii de Biologie 22 mai 2009.

    1. 5. Referate sustinute  in cadrul stagiului de doctorat:

    Delcaru (Larion) Cristina:

    1. a. Principalele specii bacteriene oportuniste implicate in patologia infectioasa a tractului digestiv (referat sustinut 24 febr.2010)
    2. b. Factori de patogenitate si virulenta  implicati in mecanismul de patogeneza a principalilor

    agenti infectiosi anaerobi enterali (referat sustinut 22 septembrie 2010)

    Lucrare doctorat in stiinte biologice (in lucru)

    Ani Ioana Cotar- teza de doctorat sustinuta la 13 Nov. 2009- Implicatiile fenomenului de QS si raspuns in exprimarea coordonata a factorilor de patogenitate si virulenta la tulpini de S. aureus si Ps. aeruginosa

    Otilia Banu- teza de doctorat sustinuta la 27 mai 2010- Studiul interrelatiilor agentilor infectiosi – celula eucariota si dispozitivele protetice in patologia infectiilor cardiovasculare

    Delcaru (Larion) Cristina: Patologia infectioasa a tractului digestiv; aspecte  noi privind

    proprietatile de virulenta si antibiorezistenta ale agentilor infectiosi implicati.

    Carmen Iordache:  Studiul interactiunii mediatorilor solubili produsi de Ps. aeruginosa cu celula gazda eucariota

    Proiect PNII, Parteneriate in Domenii Prioritare, Sanatate, Proiect 42-125/2008.


    Titlul complet al proiectului:

    Elaborarea strategiilor nationale multidisciplinare de avertizare timpurie, monitorizare si control al bolilor re-emergente transmise de tantarii vectori (Diptera: Culicidae), arondate la spatiul european de operare.

     

     

    Acronim:

    VECBOLEM

     

     

    Rezumatul proiectului:

    In ultimii ani s-a produs (re)-emergenta si raspandirea globala a unor boli transmise de vectori cu consecinte majore socio-economice, politice si asupra mediului. Majoritatea epidemiilor sunt rezultatul schimbarilor globale si locale de origine antropica ale mediului in general dar mai ales climatice. A aparut necesitatea de a anticipa, preveni si controla aceste epidemii pentru a evita crize majore, sociale si economice. Proiectul propune pentru prima data explorarea multidisciplinara a riscului de re-emergenta a malariei si a infectiilor umane cu virusul West Nile (VWN), transmise de culicide (tantari), care reprezinta probleme extrem de  importante de sanatate publica in Romania. Obiectivul principal al proiectului este de a evalua acest risc in functie de evolutia conditiilor de mediu care influenteaza prezenta, distributia spatiala si temporala si dinamica agentilor patogeni, a gazdelor vertebrate si a vectorilor. Zonele model de studiu,  Delta Dunarii cu aria lagunara si Zona Metropolitana Bucuresti (ZMB) reunesc atat ecosisteme naturale foarte variate cat si ecosisteme antropice in continua si rapida schimbare care ofera conditii extrem de favorabile de desfasurare a ciclurilor de transmitere vectoriala a agentilor patogeni. Delta Dunarii este zona in care pasarile migratoare introduc VWN, iar in ZMB s-a inregistrat 60 % din numarul total de cazuri in timpul epidemiei de infectii neurologice umane cu acest virus din sudul Romaniei in 1996;  aria lagunara a inregistrat endemia malarica cea mai puternica din cauza prezentei vectorului Anopheles sacharovi iar ZMB a fost puternic endemica pentru malarie in tot teritoriul sau rural si periurban. Proiectul propune pentru prima data utilizarea integrata a unor metode si tehnici entomologice, ecologice, imunologice, virusologice, moleculare, spatiale (teledetectie din sateliti, GIS) in scopul stabilirii elementelor ciclurilor de transmitere a agentilor patogeni (VWN, Plasmodium sp.) in diferite tipuri de ecosisteme naturale si antropice. Investigatiile vor viza speciile de culicide vectoare ale acestor patogeni, gazdele principale (pasari domestice si salbatice) si tangentiale (mamifere, inclusiv omul) pentru VWN, modul de introducere si circulatie a agentilor patogeni intre diferite tipuri de ecosisteme si factorii ecologici de relevanta in aceste procese. Se vor stabili nivelurile diferitilor parametrii ecologici care pot constitui elemente de prognoza si avertizare timpurie privind aparitia infectiilor la om in conditiile diferitelor ecosisteme. Proiectul va dezvolta metodologia elaborarii prognozelor privind aparitia acestor boli in diferite tipuri de ecosisteme cu conditii de mediu in schimbare si va elabora strategiile la nivel national de avertizare timpurie, supraveghere si control al infectiilor, arondate la spatiul european de operare, raspunzand necesitatii de protectie a populatiei prin imbunatatirea politicilor de sanatate publica.

    Proiectul, prin caracterul sau multidisciplinar, integreaza activitati ale cercetatorilor din 7 institutii de prestigiu din domenii esentiale pentru prognoza impactului schimbarilor de mediu asupra sanatatii publice, cu experienta necesara realizarii obiectivelor propuse.

    Structura manageriala include un Steering Committee cerut de diversitatea partenerilor si de  complexitatea proiectului.

     

     

    Obiectivele generale si rezultatele estimate a fi obtinute:

    Proiectul VECBOLEM aduce o contributie deosebita la dezvoltarea cunostintelor privind fenomenul global de re-emergenta a bolilor transmise de vectori, prin volumul investigatiilor si mai ales prin noutatea si complexitatea abordarii lor. Noutatea absoluta pentru Romania a proiectului rezulta din urmatoarele doua noi abordari: investigarea multidisciplinara a unui fenomen din domeniul sanatatii publice in corelatie cu schimbarile globale de mediu (abordare sanatate-mediu); introducerea in proiect a utilizarii de ultima ora a tehnicilor spatiale (teledetectie prin imagini satelitare si tehnici GIS) in domeniul epidemiologiei. Aceaste noi modalitati ale abordarii cercetarii unor boli de mare impact pentru sanatatea publica corespund obiectivelor lansate prin PC6 pentru cercetarea epidemiologica pe plan european, care continua in PC7. Aceasta abordare a fost lansata prin Proiectul integrat din FP6 – Contract no. GOCE-CT 2003-010284 / 2004 – 2009 „EDEN – Emerging Diseases in a Changing European Environment” la care echipa din Inst. Cantacuzino care coordoneaza proiectul VECBOLEM a participat alaturi de alte 48 echipe din 21 tari europene si 3 tari din nordul Africii. De altfel, proiectul VECBOLEM a fost elaborat pe baza conceptiei, modelului si metodologiei lansate prin proiectul EDEN si continua investigatiile efectuate asupra virusului West Nile si malariei in Romania in cadrul acestui proiect. Proiectul VECBOLEM include o mare diversitate de metodologii si tehnici de investigare din domenii diferite si un important volum de munca atat pe teren si in laborator cat si la prelucrarea datelor, ceea ce confera proiectului un mare grad de complexitate. Rezultatele vor aduce noi cunostinte deosebit de importante privind determinantii ecologici ca factori de risc pentru emergenta bolilor transmise de culicidele vectoare in Romania. Ele se vor concretiza in elaborarea metodologiilor de prognoza si a strategiilor eficiente de avertizare timpurie, supraveghere si control al acestor boli, pe modelul celor ce se vor generaliza in spatiul european de operare, strategii ce vor fi puse la dispozitia factorilor de decizie din sanatatea publica pentru a fi aplicate la nivel national in Romania..

    Obiectivul general al proiectului este solutionarea la nivel national a problemei actuale globale, re-emergenta bolilor transmise de vectori din cauza schimbarilor de mediu,  prin:

    – evaluarea riscului de re-emergenta a infectiilor cu VWN si malariei, transmise de culicide, prin investigatii multidisciplinare complexe in ZMB si Delta Dunarii cu aria lagunara, ca zone model de studiu;

    elaborarea inovativa a metodologiilor de prognoza si a strategiilor de avertizare timpurie, supraveghere si control al acestor boli pentru aplicarea lor de catre reteaua nationala de supraveghere, arondata retelei operative europene.

     

    Rezultatele estimate sustin scopul proiectului si se concretizeaza prin:

    – Detectia si catalogarea tipurilor de ecosisteme si a conditiilor de mediu considerate sau prognozate cu risc pentru (re)-emergenta malariei si a infectiilor cu VWN transmise de culicide.

    – Cunostinte stiintifice noi despre ecologia agentilor patogeni in mediul in schimbare (ciclurile de transmitere in diferite tipuri de ecosisteme), nivelul impactului mediului si posibilitatile de a prognoza si diminua acest impact.

    – Cunostinte noi privind biologia, ecologia si implicarea vectoriala a culicidelor vectoare in conditiile de mediu in schimbare.

    – Modalitati de prognoza a riscului de emergenta a malariei si infectiilor cu VWN incluzand tehnici si metodologii generice pentru evaluarea riscului si elaborarea deciziilor constand in harti, indicatori de risc, scenarii, care sa permita imbunatatirea politicilor de sanatate publica la nivel  national.

    – Strategii de avertizare timpurie, monitorizare si control al malariei si infectiilor cu VWN incluzand seturi de tehnici si metodologii utilizabile de catre specialistii din reteaua nationala de supraveghere.

     

    Institutia coordonatoare:

    Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie”Cantacuzino”, cu sediul in Bucuresti, Splaiul Independentei nr. 103, sector 5.

     

     

     

    Componenta consortiului:

    • Coordonator: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie ”Cantacuzino”;
    • Partener 1: Universitatea din Bucuresti;
    • Partener 2: Administratia  Nationala de Meteorologie;
    • Partener 3: Institutul National de  Cercetare-Dezvoltare Imbunatatiri Funciare  INCDIF “ISPIF”Bucuresti;
    • Partener 4: Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor a Municipiului Bucuresti;
    • Partener 5: Parcul Natural Comana ;
    • Partener 6: Directia Sanitara Veterinara si pentru Siguranta Alimentelor Tulcea.

     

    Autoritatea contractanta:

    Unitatea Executiva pentru Finantarea Invatamantului Superior, Cercetarii, Dezvoltarii si Inovarii (UEFISCDI) cu sediul in Bucuresti, str. Mendeelev, nr. 21-25.

     

    Durata proiectului:

    01.10.2008 – 30.09.2011.

     

    Schema de realizare a proiectului include 4 etape in 36 de luni. Prima etapa din 2008 se va axa pe cunoasterea datelor de mediu, inclusiv climatice, cu schimbarile lor si datelor epidemiologice, istorice si prezente, privind bolile transmise de culicide. In doua etape din 2009 si 2010 se vor desfasura investigatii complexe in teren si laborator asupra ciclurilor de transmitere in diferite tipuri de ecosisteme si conditii de mediu. Vor rezulta modalitatile de prognoza a circulatiei agentilor patogeni re-emergenti. In 2011 se fac investigatii de teren numai daca apar schimbari de mediu ce modifica conditiile de transmitere fata de cei doi ani precedenti sau va fi necesara completarea unor date. Etapa si proiectul se incheie cu elaborarea strategiilor de avertizare timpurie, monitorizare si control al bolilor transmise de culicide, la nivel national, arondate la spatiul european de operare.

     

     

     

    Activitatile si responsabilitatile aferente fiecarui participant pe etape:

    Etapa I: Tipuri de ecosisteme si evolutia istorica a schimbarilor de mediu si a prezentei bolilor transmise de culicide

    Activitatea I.1: Caracterizarea ecosistemelor si habitatelor din zonele de  studiu

    CO – Selectarea si descrierea habitatelor de lucru, factori de mediu favorabili vectorilor si patogenilor (documentare si investigatii de teren)

    P1 – Date geografice, geologice, pedologice, de vegetatie si fauna (documentare si investigatii de teren)

    P2 – Caracterizarea climatica a zonelor de studiu (documentare)

    P3 – Localizarea geografica a siturilor de lucru selectate (teledetectie, GIS). Schimbari in utilizarea pamantului in zonele studiate si fostele zone endemice (teledetectie satelitara SPOT si Landsat TH de rezolutie fina, tehnici GIS)

    P4 – Selectare si descriere habitate de lucru in Bucuresti si suburbii

    P5 – Selectare si descriere habitate de lucru in Parcul Natural Comana

    P6 – Selectare si descriere habitate de lucru in Delta Dunarii si aria lagunara

    Activitatea I.2: Schimbari de mediu in timp si spatiu in zonele studiate si corelarea cu datele istorice de prezenta a bolilor transmise de culicide

    CO – Datele istorice privind malaria si infectiile cu VWN la om si animale in corelatie cu schimbarile factorilor de mediu care au influentat populatiile de vectori si epidemiile (documentare)

    P1 – Schimbari de mediu in zonele de studiu si foste endemice (documentare)

    P2 – Schimbari climatice in zonele de studiu si foste endemice (documentare)

    P3 – Localizarea geografica a datelor epidemiologice istorice (date de joasa rezolutie multi-temporale de la satelitii heliosincroni NOOA si de la satelitul geostationar european Meteosat, tehnici GIS)

    Activitatea I.3: Managementul proiectului

    CO – Comitet Directie: Centralizare date stiintifice si documente financiare

    Etapa II: Investigatii complexe asupra circulatiei agentilor patogeni transmisi de culicide in diferite tipuri de ecosisteme si corelarea cu evolutia factorilor de mediu.

    Activitatea II.1: Investigatii de teren si colectarea probelor

    CO – Investigarea complexa a ciclurilor de transmitere in diferite ecosisteme a patogenilor vizati, date de biologie si ecologie a vectorilor de malarie si ai virusului West Nile. Colectarea ritmica a probelor de culicide prin metode adecvate tipurilor de habitate si a probelor de sange de la pasari domestice

    P1 – Parametrii ecologici din habitatele studiate. Date de biodiversitate. Investigatii de teren, inregistrarea factorilor de mediu, capturare pasari salbatice cu plase ornitologice japoneze, colectare probe de sange

    P2 – Inregistrarea datelor meteorologice curente in zonele investigate

    P4 – Colectarea probelor de sange de pasari si cai din ecosistemele urbane si rurale din ZMB. Depistarea pasarilor si cailor bolnavi cu simptome neurologice. Investigatii de teren, colectare probe de la pasari si animale sanatoase si bolnave.

    P5 – Capturarea pasarilor salbatice, colectarea probelor de sange si inregistrarea factorilor de mediu in Parcul National Comana. Investigatii curente de teren.

    P6 – Colectarea probelor de sange de pasari si cai din ecosistemele urbane si rurale din judetul Tulcea. Depistarea pasarilor si cailor bolnavi cu simptome neurologice. Investigatii de teren, colectare probe de la pasari si animale sanatoase si bolnave

    Activitatea II.2: Procesarea in laborator a probelor  biologice din teren

    CO – Identificarea speciilor de vectori (taxonomie clasica si moleculara, obtinerea si identificarea pontelor de anofeli), varsta fiziologica (disectie) si preferinte de hranire la anofeli (ELISA), detectarea (RT-PCR, RAMP test) si/sau izolarea VWN (pe soricei sugari sau celule Vero) din culicide si/sau gazde vertebrate, investigarea seroprevalentei anticorpilor fata de VWN la pasari si cai (teste ELISA); confirmarea cazurilor umane de malarie (diagnostic microscopic – examen hematologic in picatura groasa si pe frotiu).

    Activitatea II.3: Prelucrarea preliminara a datelor obtinute in primul an de studii in teren si corelarea cu datele istorice

    CO: Prelucrarea preliminara a datelor privind ciclurile de transmitere a agentilor patogeni transmisi de culicide in corelatie cu factorii de mediu

    P1: Prelucrarea datelor ecologice

    P2: Prelucrarea datelor meteorologice

    P3: Descrierea sezonalitatii habitatelor in indici spatiali termici, precipitatii si vegetatie, care determina si arata distributia si abundenta atat a vectorilor cat si a bolilor (Imagini satelitare de la NOOA, Meteosat si Meteosat Generatia a doua -MSG utilizate complementar cu datele Terra/MODIS, tehnici GIS)

    Activitate II.4: Diseminare rezultate

    CO – Comunicarea rezultatelor partiale impreuna cu partenerii

    Activitatea II.5: Managementul proiectului

    CO – Comitet Directie: Centralizare date stiintifice si documente financiare

    Etapa III: Investigatii complexe asupra circulatiei agentilor patogeni transmisi de culicide in diferite tipuri de ecosisteme si corelarea cu evolutia factorilor de mediu in al doilea an de studii in teren. Elaborarea prognozelor privind circulatia in conditiile de mediu specifice zonelor de risc din Romania prin integrarea datelor actuale si istorice.

    Activitatea III.1: Investigatii de teren si colectarea probelor in anul al doilea de studii de teren – idem et. II

    Activitatea III.2: Procesarea in laborator a probelor biologice din anul al doilea de studii de teren – idem etapa II

    Activitate III.3: Elaborarea modelelor descriptive de prognoza prin coroborarea datelor actuale si istorice privind circulatia patogenilor transmisi de culicide

    CO: Dezvoltarea modelelor descriptive de prognoza ale distributiei, nivelului de risc, zonelor de risc si conditiilor de introducere, re-emergenta si raspandire a bolilor.

    P1: Contributie cu datele de mediu la elaborarea modelelor de prognoza

    P3: Elaborarea hartilor de prognoza (integrarea datelor de teledetectie spatiale de inalta rezolutie si a celor temporale de joasa rezolutie de la satelitii heliosincroni NOOA si de la satelitii geostationari Meteosat cu datele complementare Terra/MODIS, tehnici GIS)

    Activitate III.4: Diseminare rezultate

    CO – Comunicarea rezultatelor partiale impreuna cu partenerii

    Activitatea III.5: Managementul proiectului

    CO – Comitet Directie: Centralizare date stiintifice si documente financiare

    Etapa IV: Elaborarea strategiilor de avertizare timpurie, de supraveghere si control al malariei si infectiilor cu VWN transmise de culicide

    Activitatea IV.1: Investigatii de teren si colectarea probelor  in cazul  aparitiei unor schimbari de mediu diferite de cele din cei doi ani de studiu anterioari, cu noi consecinte epidemice sau pentru completarea unor date anterioare. Idem et. II si III pentru toti partenerii din proiect

    Activitatea IV.2: Procesarea in laborator a probelor  biologice din teren

    CO – idem etapele II si III + identificarea si cartacterizarea moleculara (secventiere) a tulpinilor de virus West Nile izolate din vectori

    P4 – Detectia VWN la gazde in tesuturi tinta prin metode imunohistochimice (imunofluorescenta indirecta), imunoenzimatice (peroxidaza, fosfataza alcalina)

    Activitatea IV.3: Analiza si sinteza tuturor datelor din proiect in vederea elaborarii strategiilor

    CO: Prelucrarea datelor privind ciclurile de transmitere a agentilor patogeni transmisi de culicide in ecosistemele investigate, evaluarea incadrarii lor in modelele de circulatie si definitivarea acestora. Corelarea cu datele de mediu.

    P1: Prelucrarea si evaluarea datelor privind parametrii ecologici esentiali in cadrul modelelor de circulatie

    P2: Prelucrarea, evaluarea si corelarea datelor meteorologice cu modelele de circulatie

    P4: Contributie la prelucrarea si evaluarea datelor  din ZMB

    P5: Contributie la prelucrarea si evaluarea datelor  din P.N. Comana

    P6: Contributie la prelucrarea si evaluarea datelor  din judetul Tulcea

    Activitatea IV.4: Elaborarea strategiilor de avertizare timpurie, monitorizare si control al malariei si infectiilor cu VWN.

    CO – Selectarea setului de tehnici si metodologii si includerea lor in strategiile de avertizare timpurie, monitorizare si control

    P3 – Elaborarea hartilor cu zonele de risc de re-emergenta a infectiilor (teledetectie, tehnici GIS)

    Activitate IV.5: Diseminare rezultate

    CO – Comunicarea rezultatelor impreuna cu partenerii

    Activitatea IV.6: Managementul proiectului

    CO – Comitet Directie: Centralizare date stiintifice si documente financiare

     

    Bugetul proiectului:

    • 2 000 000 lei de la bugetul de stat;
    • Cofinantare: 0 lei .

     

    Descrierea/ prezentarea diferitelor evenimente derulate in cadrul proiectului:

     

    Date obtinute in cadrul proiectului in etapele din 2008 – 2010 au fost diseminate astfel:

     

    Publicatii in reviste nationale si internationale cu Indexare Thomson Reuters.

    1. Elena Falcuta, Celine Toty, Liviu-Florian Prioteasa, Gabriela Nicolescu, Valeria Purcarea-Ciulacu , Irina Teodorescu, Didier Fontenille ( 2010). Blood-meal preferences for the Anopheles maculipennis complex species in Comana, Giurgiu county (Romania). Romanian Journal of Biology-Zoology, (2010), 55, 1: 49-55, Ed. Academiei Romane, Bucuresti, ISSN:1843 -7761 http://scientific.thomsonreuters.com/cgibin/jrnlst/jlresults.cgi?PC=MASTER&ISSN=1843-7761

     

    1. Florian L. Prioteasa, Elena Falcuta, Gabriela Nicolescu, Irina Teodorescu, Paul  Reiter. 2010. Confirmation of the presence of Ochlerotatus zammitii (Diptera: Culicidae) in Romania. Romanian Journal of Biology – Zoology, (2010), 55, 1: 43-48. Ed. Academiei Romane, Bucuresti. ISSN: 1843 -7761 http://scientific.thomsonreuters.com/cgibin/jrnlst/jlresults.cgi?PC=MASTER&ISSN=1843-7761

    1. Cheval S., Baciu M., Dumitrescu A., Breza T., Legates D. R. & Chendes V. (2010). Climatologic adjustments to monthly precipitation in Romania. International Journal of Climatology, (2010), DOI: 10.1002 / joc.2099. http://www.homogenisation.org/files/private/WG1/Bibliography/Applications/Applications%20(C-E)/cheval_etal_2010.pdf

     

    Publicatie carte:

     

    –          Busuioc A., Caian M., Cheval S., Bojariu R., Boroneant C., Baciu M. & Dumitrescu A. (2010). Variabilitatea si schimbarea climei in Romania. Editura Pro Universitaria, 2010, ISBN 978-973-129-549-7

     

    Publicatii in alte reviste recunoscute CNCSIS cu ISSN sau ISBN:

     

    1. Baltesiu L., Mudura R., Mihai D., Nicolescu G. & Purcarea-Ciulacu V. 2009. GIS – a tool for monitoring and management of epidemics. RevCAD – Journal of geodesy and Cadastre, 8: 167 – 174. ISSN 1583-2279, Cod CNCSIS 634

     

    1. Nicolescu G., Purcarea-Ciulacu V., Tanasuica R. & Popovici A. (2010). Circulatia enzootica a virusului West Nile pe teritoriul Romaniei. Jurnal Medical Veterinar, XVI, 98: 8

     

    Prezentare in cadrul unei manifestari stiintifice internationale cotata ISI:

    Nicolescu G., Vladimirescu A., Purcarea-Ciulacu V., Falcuta E., Prioteasa L., Coipan E.C., Alexse A., Ciolpan O. 2009. Evaluation of the risk of malaria re-emergence in Romania. 5th MIM Pan-African Malaria Conference, 2-6 November 2009, Nairobi, Kenya, Book of abstracts, no. 414, page 115 (www.mimalaria.org) ISSN 1821-5823

     

    Prezentari in cadrul manifestarilor stiintifice internationale:

     

    1. Nicolescu G., Purcarea-Ciulacu V., Prioteasa L., Vladimirescu A.F., Falcuta E, Coipan E. C., Dumitrescu G., Popescu D., Ionescu L., Bicheru S., Kiss J. B., Marinov M. & Alexse A. (2009). West Nile virus in Romania. The 4th EDEN  Meeting –Emerging Diseases in the Changing European Environment, 11-18 ianuarie 2009, Marrakech, Maroc

     

    2. Prioteasa L., Falcuta E, Purcarea-Ciulacu V., Nicolescu G. & Peiter P. (2009). WNV in Danube Delta: What was done? What’s next? The 4th EDEN  Meeting –Emerging Diseases in the Changing European Environment, 11-18 ianuarie 2009, Marrakech, Maroc

     

    3. Busuioc A., Baciu M. & Dumitrescu A. (2009). Future changes in the precipitation regime over southeastern Romania and associated uncertainties. Climate Prediction: Models, Diagnostics and Uncertainty Analysis. European Geosciences Union, General Assembly 2009, Vienna, Austria, 19 – 24 April 2009

    http://meetings.copernicus.org/egu2009/index.html

    http://meetingorganizer.copernicus.org/EGU2009/poster_programme/316

     

    4. Busuioc A., Cazacioc L. & Dumitrescu A. (2009). Seasonal prediction for temperature anomalies in Romania using a statistical downscaling model applied to the ECMWF outputs.

    Monthly, seasonal and decadal forecasting (including Outstanding Young Scientist Lecture). European Geosciences Union, General Assembly 2009, Vienna, Austria, 19 – 24 April 2009. http://meetingorganizer.copernicus.org/EGU2009/oral_programme/2009

    5. Dana I. F., Badea A., Moise C., Olteanu V. G., Jivanescu I. E. & Mamulea A. (2009). Synthetic Aperture Radar Interferometry Coherence Analysis. The 20th DAAAM World Symposium on Intelligent Manufacturing and Automation: Theory, Practice & Education. 24-29 November 2009, Vienna, Austria

    6. Dana I. F., Poncos V. & Teleaga D. (2009). Comparative Analysis of InSAR Digital Height Models for Test Area Bucharest. European Space Agency Conference “Advances in the Science and Applications of SAR Interferometry”, 30 November – 4 December 2009, Frascati, Italia

     

    7. Dana I. F. (2010). Digital Height Models Generation by Means of Optical Stereoscopy and Interferometry – Case study. 30th FARSeL Symposium 2010 – Remote Sensing for Science, Education and Natural and Cultural Heritage, 29 May – 4 June 2010, Paris, France

    8. Savin E., Masselli F., Chiesi M. & Poenaru V. (2009). Analysis of different methods to estimate forest production using satellite data. Al 29lea Simpozion ERASel “Imagine EUROPE”, Institutul Agronomic Mediteranean, Chania, Grecia, 14-21 iunie 2009.

     

    9. Falcuta E., Prioteasa L. & Nicolescu G. (2009). Is there a real risk of malaria re-emergence in Romania? Poster. The 5th International Congress of the Society of Vector Ecology, Belek-Antalya, Turkey, 12 – 16 October 2009

     

    10. Ciolpan O., Nicolescu G., Falcuta E., Prioteasa L., Coipan E. C. & Vladimirescu A. F. (2009). Some considerations on adult mosquito populations in Comana forest (Romania). The 5th International Congress of the Society of Vector Ecology, Belek-Antalya, Turkey, 12 – 16 October 2009

     

    11. Nicolescu G., Vladimirescu A., Purcarea-Ciulacu V., Falcuta E., Prioteasa L., Coipan E. C., Alexse A., Steriu-Ianule D. A. (2010). Evaluation of the risk of malaria re-emergence in Romania. Oral communication.Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France, 40

     

    12. Nicolescu G., Vladimirescu A., Purcarea-Ciulacu V., Prioteasa L., Falcuta E., Coipan E. C., Boroneant C., Petrisor A. I., Dumitrescu G., Popescu D., Ionescu L., Bicheru S. & Alexse A. (2010). West Nile virus circulation in Romania – the past and the present. Oral communication.Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 54

    13. Vicente J. L., Sousa C. A., Silva T. L., Alves R., Toty C., Barre H., Falcuta E., Latorre J. M., Bargues M. D., Mas-Coma S., Boccolini D., Di Luca M., Toma L., Romi R., Alten B., Demirci B., Caglar S. S., Ozer N., Nicolescu G., Rosário V. E., Fontenille D. & Pinto J. (2010). Population structure of the European malaria vector Anopheles atroparvus. Oral communication.Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 57

     

     

    14. Falcuta E., Prioteasa L. & Nicolescu G. (2010). Entomological studies on anopheline mosquito (Diptera: Culicidae) fauna belonging to two former endemic malaria areas in order to assess the possibility of malaria re-emergence in Romania. Poster. Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 138

     

    15. Falcuta E. (2010). Studies on the anopheline fauna (Diptera: Culicidae) in order to evaluate the risk of malaria re-emergence in Romania. Poster. Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 146

     

    16. Marinov M., Kiss J. B., Alexe V., Nicolescu G., Prioteasa L., Falcuta E., Alexse A. & Reiter P. (2010). Serologic survey of wild birds for West Nile virus in the Danube Delta Biosphere Reserve and Dobrogea tableland (Romania). Poster. “Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 156

     

    17. Prioteasa L. (2010). Mosquitoes (Diptera: Culicidae) from the Danube Delta Biosphere Reserve and the involvement in West Nile virus (Flaviviridae) circulation. Poster. “Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 159

     

    18. Alexse A., Purcarea-Ciulacu V., Popescu D., Dumitrescu G., Ionescu L., Popovici A., Arsene M., Kiss J. B., Marinov M., Petrisor A. I. & Nicolescu G. (2010). Domestic birds – main vertebrate hosts of West Nile virus in anthropic ecosystems in Romania. Poster. “Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment” International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France. 160

     

    19. Purcarea-Ciulacu V., Alexse A., Popescu D., Dumitrescu G., Kiss J.B., Marinov M.,   Chisamera G., Petrisor A.I., Coman C. & Nicolescu G. ( 2010) The  involvement  of  wild   birds in  enzootic  circulation  of  West  Nile  virus  in Romania. Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France, 161

     

    20. Purcarea-Ciulacu V., Alexse A., Popescu D., Dumitrescu G., Tanasuica R., Popovici A., Arsene M., Kiss J. B., Marinov M., Petrisor A. I. & Nicolescu G. ( 2010). The  horses – indicators  of  the  level of  West  Nile  virus  circulation  in  anthropical  ecosystems. Emerging Vector-borne Diseases in a changing European Environment International Conference, 10-12 mai 2010, Montpellier, France, 162

     

    Prezentari in cadrul manifestarilor stiintifice nationale cu participare internationala:

    1. Baltesiu L., Mudura R., Mihai D., Purcarea-Ciulacu V. & Nicolescu G. (2008). GIS – a tool for monitoring and management of epidemics. The 17th National Conference of Parasitology with international participation. Cluj-Napoca, November 2008. Romanian Journal of Parasitology, XVIII, Supplement, 11. ISSN 1221-1796, Cod CNCSIS 616

     

    2. Ciolpan O., Nicolescu G., Coipan E. C. & Vladimirescu A. (2008). The importance of permanent monitoring of vector mosquito populations for their control in Romania. The 17th National Conference of Parasitology, Cluj-Napoca, November 2008. Romanian Journal of Parasitology, XVIII, Supplement, 46

     

    3. Falcuta E., Toty C., Prioteasa L., Teodorescu I., Nicolescu G. & Fontenille D. (2008). Identification of Anopheles maculipennis group species from Comana area (Giurgiu county, Romania) by PCR and determination of feeding preferences of females by ELISA. Oral communication. The 17th National Conference of Parasitology with international participation, Cluj-Napoca, Romania, 6–8 November 2008. Romanian Journal of Parasitology, XVIII, Supplement, 93

     

    4. Nicolescu G., Purcarea-Ciulacu V., Vladimirescu A., Prioteasa L., Falcuta E., Coipan E.C., Dumitrescu G., Popescu D. & Alexse A. (2008). Evaluation of the re-emergence risk of mosquito-borne diseases in Romania: West Nile virus infections and malaria” Oral presentation. The 17th National Conference of Parasitology with international participation, Cluj-Napoca, Romania, 6–8 November 2008. Romanian Journal of Parasitology, XVIII, Supplement, 160-161

     

    5. Purcarea-Ciulacu V., Alexse A., Prioteasa L., Falcuta E., Coipan E.C., Vladimirescu A., Popescu D., Dumitrescu G. & Nicolescu G. (2008). The transmission cycles of West Nile virus in Romania and the detection of virus presence. Poster. The 17th National Conference of Parasitology with international participation, Cluj-Napoca, Romania, 6 – 8 November 2008. Romanian Journal of Parasitology, XVIII, Supplement, 200

     

    6. Falcuta E., Prioteasa L., Teodorescu I. & Nicolescu G. (2009). Identification of malaria vectors by PCR technique to assess the possibility of the appearance of some alien anopheline species in Romania. The 6th Symposium for European Freshwater Sciences, 17 – 21 August 2009, Sinaia, Romania

    7. Purcarea-Ciulacu V., Alexse A., Cristea I. & Nicolescu G. (2009). The involvement of  wild birds in the transmission cycles of West Nile virus in Romania. Simpozionul National cu participare Internationala “Forest Ecology, mapping and sustainable management: progress and perspectives”, 6-7 November, 2009, Bucharest, Romania. http://test.icas.ro/downloads/Book%20of%20abstracts.pdf. Annals of Forest Research Journal, 51, 1: 53-54. ISSN: 1844-8135 (printed) / 2065-2445 (online). Revista categoria B+, cod CNCSIS 542, http://www.editurasilvica.ro/,  si indexata in Thomson Reuters Master Journal List.  http://www.thomsonscientific.com/cgibin/jrnlst/jlresults.cgi?PC=MASTER&Word=ICAS ,

    http://www.cabi.org/ForestScience/Default.aspx?site=155&page=1065&LoadModule=IRSearchResults&ab=1&term=%22annals%20of%20forest%20research%22

    8. Prioteasa L., Falcuta E. & Nicolescu G. (2009). A checklist of the mosquito (Diptera: Culicidae) fauna of the Danube delta Biosphere Reserve. Poster. The Annual Zoology Congress of “Grigore Antipa” Museum of Natural History, Bucharest, 12 – 13 November 2009. ISBN 978-606-8015-40-8

     

    9. Nicolescu G., Vladimirescu A., Purcarea-Ciulacu V., Falcuta E., Prioteasa L., Coipan E. C., Alexse A., Ciolpan O. & Steriu-Ianule D. A. (2009). Evaluation of the re-emergence risk of malaria in Romania. Oral presentation. The 18th National Conference of Parasitology with international participation, Constanta, Romania, 26 – 28 November 2009. Romanian Journal of Parasitology, XIX, Supplement, 66 – 67

    http://asocparazitol.ro/2010/02/cuprins-nr-19-no-19-contents/

    10. Nicolescu G., Purcarea-Ciulacu V., Vladimirescu A., Prioteasa L., Falcuta E., Coipan E. C., Dumitrescu G., Popescu D. & Alexse A. (2009). Evaluation of the re-emergence risk of mosquito-borne diseases in Romania: West Nile virus infections and malaria. Oral presentation. The 18th National Conference of Parasitology with international participation, Constanta, Romania, 26 – 28 November 2009. Romanian Journal of Parasitology, 2009. XIX, Supplement, 68 – 69

    http://asocparazitol.ro/2010/02/cuprins-nr-19-no-19-contents/

    11. Manea A., Dragota C. S., Ralita I., Baciu M. & Irimescu A. (2010). Estimarea potentialelor modificari ale peisajului geografic din S-E Campiei Olteniei, din perspectiva parametrilor climatici. The 2nd international symposium of geography „Landscapes: perception, understanding, awareness and action”, 16-18 April 2010, Bucharest, Romania. Book of abstracts, 74-75, Editura Fundatiei Romania de Maine, ISBN 978-973-163-538-5

    12. Dana I. F. (2010). 3D Exploitation of Satellite Images for DEM Generation. GeoCAD Scientific Conference with international participation, 14-15 May 2010, Alba Iulia, Romania

     

    13. Manea A., Orzan A., Toma E., Ralita I. & Cotariu R. (2010). Dezvoltarea de aplicatii pentru gestionarea si exploatarea metadatelor. Sesiunea anuala de comunicari stiintifice a Administratiei Nationale de Meteorologie, 10-11 noiembrie 2010, Bucuresti, Volum de rezumate publicat de ANM, ISBN 978-973-0-09341-4

     

    14. Nicolescu G., Vladimirescu A., Purcarea-Ciulacu V., Prioteasa L., Falcuta E., Coipan E. C., Boroneant C., Petrisor A. I., Dumitrescu G., Popescu D., Ionescu L., Bichesu S. & Alexse A. (2010). West Nile virus in Romania. Annual Zoological Congress of “Grigore Antipa” Museum with international participation. 17 – 19 November 2010. Book of Abstracts, 110

     

    15. Purcarea-Ciulacu V., Alexse A., Popescu D., Dumitrescu G., Kiss J. B., Marinov M., Chisamera G., Petrisor A. I. & Nicolescu G. (2010). Wild birds and West Nile virus in Romania. Annual Zoological Congress of “Grigore Antipa” Museum with international participation. 17 – 19 November 2010. Book of Abstracts, 114

    Date obtinute in cadrul proiectului sunt diseminate pentru rezolvarea unor probleme din domeniul sanatatii publice:

     

    – In cadrul Programului national “Supravegherea infectiilor cu virusul West Nile” la care participam, am trimis catre Centrul pentru Prevenirea si Controlul Bolilor Transmisibile si catre Ministerul Sanatatii – Directia Generala de Sanatate Publica, date privind circulatia virusului West Nile: speciile de vectori, detectia virusului si izolarea sa din vectori din zonele de risc si din cele in care au aparut cazuri umane, seroprevalenta anticorpilor fata de acest virus in gazdele vertebrate principale (pasari domestice si salbatice) si tangentiale (cai – ca indicatori ai nivelului de risc de aparitie a cazurilor umane) in zonele de risc. Datele sunt utilizate pentru luarea masurilor de prevenire a aparitiei imbolnavirilor la om.

     

    – In octombrie 2010, am prezentat date obtinute in acest proiect (impreuna cu date din proiecte anterioare proprii, inclusiv din proiectul EDEN din PC6) privind circulatia endemica a virusului West Nile in Romania, in cadrul analizei si evaluarilor privind epidemia din anul 2010 de infectii cu acest virus in Romania, efectuate cu delegati de la ECDC, OMS si de la organismele implicate in supravegherea acestui virus in Franta si Italia.

     

    – Dr. G. Nicolescu a participat in 2010 in echipa care a elaborat “Risk Assessment Tool for West Nile virus infection in humans” la cererea de oferte facuta de ECDC, care a selectat propunerea Romaniei. Materialul respectiv este un ghid practic destinat intaririi capacitatii Statelor Membre ale UE de a utiliza datele si indicatorii proveniti din surse multidisciplinare (legate de om, gazde vertebrate, vectori si de factorii de mediu care influenteaza circulatia virusului West Nile) pentru a evalua riscul de transmitere a acestui virus in populatia umana din orice zona a UE.     

    Date diseminate in cadrul activitatilor de perfectionare a personalului medical:

    Nicolescu G. (2010). Consideratii epidemiologice asupra bolilor transmise prin vectori. Prezentare la Scoala de vara “Medicina calatorului”, organizata de Universitatea Ovidius Constanta, Facultatea de Medicina, 26 – 31 iulie 2010, Constanta

    Link-uri catre diverse alte pagini de interes pentru vizitator.

     

    www.cantacuzino.ro

    www.meteoromania.ro

    www.ispif.ro

    www.ansvsa.ro

    www.comanaparc.ro

     

    Datele de contact ale directorului de proiect:

     

    CS III, Dr. Purcarea-Ciulacu Valeria,

    Colectiv Entomologie Medicala din INCDMI”CANTACUZINO”

    Telefon: 0729305152; 0763800107.

    e-mail:valeria_purcareaciulacu@yahoo.com

     

    Atragerea tinerilor cercetatori in proiect:

    Doctoranzi: 14 la inceperea proiectului, dintre care 7 au obtinut titlul de doctor pana in prezent ;

    Participanti in proiect cu varsta sub 35 de ani au fost 20, reprezentand 37,7 % din personalul proiectului.

    17 dintre ei au obtinut grade stiintifice de cercetare : asistenti cercetare, cercetatori stiintifici sau cercetatori stiintifici III.

    Rezultate finale ale proiectului:

    – Detectia si catalogarea tipurilor de ecosisteme si a conditiilor de mediu considerate sau prognozate cu risc pentru (re)-emergenta malariei si a infectiilor cu VWN transmise de culicide.

    – Cunostinte stiintifice noi despre ecologia agentilor patogeni in mediul in schimbare (ciclurile de transmitere in diferite tipuri de ecosisteme), nivelul impactului mediului si posibilitatile de a prognoza si diminua acest impact.

    – Cunostinte noi privind biologia, ecologia si implicarea vectoriala a culicidelor vectoare in conditiile de mediu in schimbare.

    – Modalitati de prognoza a riscului de emergenta a malariei si infectiilor cu VWN incluzand tehnici si metodologii generice pentru evaluarea riscului si elaborarea deciziilor constand in harti, indicatori de risc, scenarii, care sa permita imbunatatirea politicilor de sanatate publica la nivel  national.

    Parteneriate in domenii prioritare , contract PAR 61/026

    Titlul: Realizarea unui nou test tuberculinic cutanat pentru revelarea hipersensibilitatii de tip intirziat prin tehnologii avansate, cu utilizarea antigenelor recombinante specifice pentru diagnosticul tuberculozei latente si active

    Coordonatorul proiectului: INCDMI Cantacuzino, Bucuresti, are experienta cea mai bogata in acest domeniu. Incepind din 1965, Institutul Cantacuzino produce PPD IC-65, reactiv biologic de uz uman, aprobat de Agentia Nationala a Medicamentului care este utilizat de intreaga retea nationala de penumoftiziologie.

    Partenerul 1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, Bucuresti, coordoneaza reteaua de tuberculoza din Romania. Toti participantii la proiect au activitate in proiecte de colaborare internationale privind controlul si managementul tuberculozei.

    Partenerul 2, Spitalul Clinic de Boli Infectioase si tropicale Victor Babes, Bucuresti, are cea mai mare competenta in domeniul clinic referitoare la infectiile HIV/SIDA asociate cu tuberculoza, la copii si la adulti.

    Partenerul 3, Catedra de Microbiologie a Universitatii de Medicina si Farmacie Carol Davila, Bucuresti, are experienta practica si didactica in domeniul tuberculozei, a cercetarii si implementarii de proiecte la nivel national si international.

    Proiectul se refera la realizarea unui nou test tuberculinic cutanat, un reactiv biologic, de uz uman, pentru evidentierea hipersensibilitatii de tip intirziat prin intradermoreactie ( IDR), pentru diagnosticul tuberculozei latente si active, aplicind tehologii avansate.

    Obiectivul I : Prepararea PPD recombinant :

    • cautarea secventelor de gene care codifica proteinele specifice doar pentru Mycobacterium tuberculosis;
    • cultivarea M.tuberculosis H37Rv si M. bovis BCG;
    • clonarea si supra-exprimarea proteinelor in E.coli ;
    • purificarea proteinelor recombinante;
    • formularea noului PPD

    Etapa I: 15.09.2007- 15.12.2007

    Activitatea I. Prepararea PPD recombinant (I)

    • A fost efectuata documentarea referitoare la secventierea genelor codificatoare doar pentru proteinele specifice pentru M.tuberculosis ( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68)
    • A fost initiata obtinerea unui PPD nedenaturat termic. La momentul raportarii, cultura de M.tuberculosis H37Rv pe mediul lichid Sauton, este incubata la 37 C.
    • Cultivarea M.tuberculosis H37Rv (tulpina de referinta) si M.bovis BCG.                     Tulpinile, liofilizate, au fost cultivate pe mediul solid Lowenstein-Jensen, si incubate la 37ºC , 28 zile ( fiind lent crescatoare); au fost recoltate celulele bacteriene de M.tuberculosis H37Rv si M.bovis BCG crescute pe mediul Lowenstein-Jensen si au fost stocate la -80C; a fost initiata obtinerea  M.bovis BCG de pe suprafata mediului lichid Sauton. La momentul raportarii, cultura M.bovis BCG  era incubata la 37 ºC

    .

    Partnership in prioritary fields. contract PAR 61/026

    Title : Development of a new reagent for TB skin testing, in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity by advanced technologies, using specific recombinant antigens for the diagnosis of latent and active tuberculosis

    Project coordinator “Cantacuzino” Institute, Bucharest, possesses extensive experience in this field. Since 1965, PPD IC-65, biological reagent for human use, produced by “Cantacuzino” Institute, approved by National Agency of Drugs and it is used by all the medical and TB network.

    Partner 1, “ Marius NastaPneumophtisiology Institute, Bucharest, is dealing with TB network management in Romania. All the project participants are active in international collaborative research concerning TB control and management

    Partner 2, „Dr. Victor Babes” Infectious and TropicalDiseasesClinicalHospital Bucharest, has the highest competence in the clinical field, of AIDS infections associated with tuberculosis, on children and adults.

    Partner P3, Microbiology Chair of “Carol Davila “ University of Medicine and Pharmacy , Bucharest, has practical and teaching experience on TB, research and project implementation at national and international level.

    The project deals with the development of a new reagent for tuberculosis (TB) skin test in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity (DTH), applying advanced technologies.

    Objective I. Preparation of recombinant PPD :

    • Search for gene sequences coding for proteins specific only to Mycobacterium tuberculosis,
    • culture of M.tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG,
    • cloning and over-expression of proteins in E.coli,
    • purification of recombinant proteins,
    • new PPD formulation

    Stage I. 15.09.2007- 15.12.2007

    Activity I Preparation of recombinant PPD ( I)

    • Documentation for gene sequences coding for proteins specific only to M. tuberculosis( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68) was performed.
    • The preparation of PPD  from unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv was started. At the end of the first stage, the culture of M. tuberculosis H37Rv on Sauton medium, was incubated at 37 ºC.
    • Culture of M. tuberculosis H37Rv (reference strain) and M. bovis BCG (Romanian “daughter” strain) was started. M. tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG, freeze dried, were cultivated on solid Lowenstein-Jensen media, 28 days, at 37°C, being slow growers: the cells were stored at -80°C. M. bovis BCG culture on liquid Sauton medium was incubated at 37 ºC at the end of the first stage.


    Etapa II : 15.12.07- 15.06.08

    A fost continuat Obiectivul 1, prin:

    Activitate I.2 continuare: Preparare PPD nedenaturat termic si obtinere corpi bacterieni din Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG si Activitate I.3  Clonarea si supra-exprimarea proteinelor existente doar in M. tuberculosis


    Rezultate:

    1. Testele de control (identificare, profilul biochimic si de contaminare bacteriana si fungica) au demonstrat puritatea si conformitatea culturilor de M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, subtulpina romaneasca.
    2. Au fost preparate doua tipuri de PPD, PPD-ul obtinut din filtratul de cultura de M. tuberculosis H37Rv nedenaturat termic ( prin filtrare sterilizanta cu filtre cu diametrul porilor de 0.2 mµ) si PPD din filtratul culturii autoclavate de M. tuberculosis H37Rv.
    3. Vectorii pET24a si pET28a au fost obtinuti ca stoc plasmidic folosind Qiagen Plasmid Maxi Kit.
    4. Insertul (gena de interes) s-a obtinut prin amplificare enzimatica (PCR) folosind ca matrita ADN genomic preparat anterior si primerii (amorsele).
    5. Testarea coloniilor care contin plasmidele corecte s-a facut prin miniprep si restrictie enzimatica sau prin PCR, folosind primeri complementari cu secvente din T7 Promotor si T7 Terminal. Pentru obtinerea plasmidelor prin miniprep s-a folosit kitul Qiagen (QIAprep).

    Etapa III : 16.06.08-15.01.2009

    A fost continuata prepararea PPD recombinant (2) si initiata realizarea obiectivului II al proiectului si anume:

    Testarea in vivo a PPD recombinant (pe cobai si oameni, comparare cu PPD IC-65,de referinta si cu metoda cu IFN- γ).

    In aceasta etapa, au fost prevazute urmatoarele activitati, care vor fi efectuate  pina la finalizarea proiectului:

    Activitatea II.1. Testarea PPD recombinant pe cobai.

    Activitatea II.2. Alegerea PPD recombinant cu un singur antigen sau cu un amestec multiantigenic.

    Rezultate:

    1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea proteinelor recombinante specifice M. tuberculosis, CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09). Continutul proteic al CFP10 purificat, determinat prin metoda Bradford, a fost de 0,41 mg/ml.

    2.  Testarea pe cobai  a PPD r (CFP10) :

    • Varianta 6, 500 UT/0,1 ml din PPD r (CFP 10 recombinant) ,a dat rezultatul cel mai bun. Dat fiind ca animalele imunizate raspund uneori aberant, cobaii sensibilizati cu 200 UT/ 0,1 ml, nu au prezentat nici o arie de eritem la PPDr, iar la cei sensibilizati cu 10 UT/0,1 ml, deci concentratia cea mai mica de proteina, aria de eritem a fost vizibila si potenta PPD r a reprezentat 31,26 % din aceea a PPD de referinta, IC 65 2 UT.
    • Ca urmare a rezultatelor obtinute prin intradermoreactia la cele 6 variante de PPD recombinant , s-a initiat testarea hipersensibilitatii de tip intirziat pe 2 serii de cobai sensibilizati cu suspensii de M.tuberculosis si M.bovis BCG.
    • Datele din literatura confirma faptul ca atunci cind se foloseste un singur antigen, chiar daca acesta este specific, intradermoreactia este mai slaba decit in cazul utilizarii unui amestec de mai multe antigene.

    3.    In acest scop, in etapa III am inceput prepararea altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

    Etapa IV : 16.01.09- 15.12.09

    Preparare PPD recombinant (2):

    Activitate I.3 :Supraexprimare proteine specifice M. tuberculosis. Supraexprimare si extragere proteine recombinante

    Activitate I.4 Purificarea proteinelor recombinante; Obtinere proteine recombinante purificate specifice

    A fost continuata  activitatea, inceputa in etapa anterioara, de preparare a altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

    Obiectivul prevazut a fi realizat de Partenerul 1, in colaborare cu Coordonatorul de proiect,  a fost Activitatea II.2 Alegere antigen sau amestec multi-antigenic (a). Participantii la realizarea proiectului, din partea Partenerului P1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, au colaborat la studiile premergatoare, care trebuie efectuate vederea testarii unui PPD recombinant.


    Rezultate:

    1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea unei proteine recombinante specifice M. tuberculosis , MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64.

    Din 500 ml cultura E.coli, s-au obtinut 97 mg proteina totala solubila si 0,8 mg MPT 64 purificat.

    2.  Testarea pe cobai  a PPD r.

    • In 3/4 experiente, CFP 10 a fost specific.
    • In 2/4 experiente ESAT 6 a fost specific.
    • In 2/3 experiente MPT 64 nu a fost specific.
    • In viitoarea serie de experiente, dupa ce se imunizeaza cobaii cu M. tuberculosis si Mycobacterium bovis BCG, dupa 6-7 saptamini, trebuie testat un nr minim de cobai/antigen recombinant, iar in saptamina urmatoare se va face testarea pe un numar semnificativ.

    3. Au fost stabilite conditiile de testare comparativa a PPD IC-65 fata de etalonul international OMS, si anume PPD RT 23, 2 UT, produs de Staatens Serum Institut, Copenhaga, Danemarca, la copii cu tuberculoza.

    In urma calculelor statistice,se poate trage concluzia ca dimensiunile reactiilor locale in cazul Seriei experimentale  09-02 TC, 2 UT/ 0,1 ml pot fi   considerate ca fiind echivalente cu cele produse de  tuberculina de referinta, PPD RT 23, 2 UT.


    Stage II. 15.12.2007 – 15.06.2008

    The Objective I was pursued, by

    Activity I.2. Preparation of non-thermally denaturated PPD and obtention of bacterial cells from Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG

    Activity I.3. Cloning and overexpression of proteins uniques for M. tuberculosis

    Results

    1. Control assays (identification, biochemical profile, bacterian and fungical contamination) proved the purity and conformity of M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, Romanian sub-strain.

    2. Two PPDs were prepared : PPD from the unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv (by sterilization through filters with 0.2 mµ pore size) and  PPD from heated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv.

    3. The plasmids pET24a and pET28a were obtained using Qiagen Plasmid Maxi Kit.

    4.The insert  was obtained by enzymatic amplification ( PCR) using as matrix the genomic DNA , previously prepared and the primers.

    5. The screening of plasmid containing colonies was performed by miniprep and enzymatic restriction or PCR, using  complementary primers with T7 Promotor and T7 Terminal sequences. Qiagen (QIAprep) kit was utilized in order to obtain the plasmids by miniprep.


    Stage III : 16.06.08-15.01.2009

    Recombinant PPD preparation (2) was continued and initialized the  Objective II, namely:

    In vivo testing of recombinant PPD (on guinea pigs, human, comparison with reference PPD IC-65 and IFN- _ assays)

    The following activities, from this point till the completion of the project, were planned:

    Activity II.1 Testing of recombinant PPD on guinea pigs

    Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD

    Results.

    1. The overexpression and extraction of M. tuberculosis , CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09) specific recombinant proteins was performed. The protein content of purified CFP10, determined by Bradford assay , was 0.41 mg/ml.

    2. PPDr ( CFP 10) guinea pigs testing

    • 500 UT / 0.1 ml PPDr concentration  proveded the best result. Because sometimes the animals gave an abherant response, the 200 UT/0.1 ml sensitized guinea pigs, didn`t present any eritem area when PPDr was injected, while on those sensitized with 10 UT/0.1 ml, the lowest protein concentration, the eritem area was visible and PPDr potency represented 31.26 % from that of the reference PPD, IC 65 , 2 UT/0.1ml.
    • Due to skin test results obtained with 6 different PPDr ( single or cocktails of recombinant antigens), the delayed type  hypersensitivity  was initiated, on two guinea pigs groups, immunized with M.tuberculosis and M.bovis BCG.
    • Published data confirm the fact the, when using a single antigen, even if it is specific, the skin test is weaker then when using a multi-antigenic cocktail.

    3. Therefore, in stage III, we started preparing other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

    Stage IV : 16.01.09- 15.12.09

    Preparation of recombinant PPD (2)

    Activity I.3. Overexpression and extraction of recombinant proteins, uniques for M. tuberculosis

    Activity I.4. Purification of specific recombinant proteins

    We continued the preparation of  other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

    The Objective, planned to be performed by Partner 1, in collaboration with Project coordinator, was Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD (a). The participants, from Partner P1, Marius Nasta Pneumophtisiology Institute, collaborated to the mandatory studies, in order to test a recombinant PPD.


    Results

    1. The overexpression and extraction of a specific M. tuberculosis recombinant  protein, MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), using the recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, was accomplished.

    97 mg of soluble total protein and 0,8 mg purified MPT 64 were obtained from 500 ml E.coli culture.

    2.  PPDr guinea pigs testing

    • In 3 out of 4 experiments, CFP10, proved to be specific.
    • In 2 out of 4 experiments, ESAT 6, proved to be specific.
    • In 2 out of 3 experiments, MPT 64, proved not to be specific.
    • For the next series of experiments, 6-7 weeks after the guinea pigs immunization with M. tuberculosis and M. bovis BCG, a low number of animals/ recombinant antigen must be tested, followed by a next week testing on a significant number of animals

    3. The conditions for comparative testing of PPD IC 65 against the WHO international tuberculin standard, PPD RT23, 2 TU/0.1ml, produced by Staatens Serum Institut, Copenhaga, Denmark, on children with tuberculosis,   were established.

    Following statistic calculations, the conclusion was that tuberculin skin test reactions for experimental series 09-02 TC, 2 TU/ 0.1 ml could be equivalated with those evidentiated  by reference tuberculin, PPD RT23, 2 TU/0.1ml.


    Acronim: HMGB

     

     

    Titlu:

    NOI COMPUSI NATURALI IMPLICATI IN MODULAREA ACTIVITATII HMGB-1, CITOKINA PROINFLAMATOARE TINTA IN TRATAMENTUL SOCULUI SEPTIC SI IN TERAPIA BOLILOR NEOPLAZICE MALIGNE

     

     

    Director Proiect: Dr. Lidia Cremer

    Proiectul este coordonat de Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

     

     

     

    Parteneri :

    1. Donatur GmbH, Germania (partener extern)
    2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica, Bucuresti
    3. Universitatea de Medicina din Craiova
    4. Universitatea “Titu Maiorescu”, Bucuresti

    Partenerul extern (Donatur GmbH din München, Germania) este o firma cu o experienta profesionala foarte vasta in izolarea si caracterizarea unor noi substante medicamentoase din extracte naturale.

     

     

    Rezumatul proiectului:

    Socul septic este un proces inflamator sistemic indus de infectii bacteriene severe. Mortalitatea mare este determinata in parte de endotoxine si de alte componente bacteriene, care prin activarea monocitelor, macrofagelor produc citokine proinflamatoare precum factorul de necroza tumorala-a (TNF-a), interleukina-1b (IL-1b), interleukina-23 (IL-23), dar si radicali toxici de oxigen sau azot, High-Mobility-Group Box-1 (HMGB-1) sau alti mediatori ai inflamatiei. HMGB-1 este o proteina cromozomiala, abundenta, conservata, fiind atat un factor de transcriere cat si o citokina intracelulara cu activitate proinflamatoare. Ipoteza ca HMGB-1 are un rol decisiv atat in socul septic cat si in alte procese inflamatoare cronice (artrita reumatoida) a fost confirmata de concentratia puternic crescuta a acestei citokine. Observatiile experimentale au relevat ca inhibarea activitatii HMGB-1 sau blocarea secretiei ei extracelulare este benefica pentru tratarea socului septic sever si a artritei reumatoide.

    In ultimii ani au fost cercetate mecanismele moleculare prin care HMGB-1 participa la inducerea si evolutia socului septic, inclusiv la instalarea starii de sepsis si moarte. Cercetari mai recente au evidentiat faptul ca in socul endotoxic produs la animale se remarca in primele ore o crestere brusca a exprimarii citokinelor proinflamatoare (TNF-α sau IL-2), pe cand concentratia de HMGB-1 creste abia dupa 24 de ore si este maxima la 36 de ore cand se instaleaza faza de sepsis. Rezultatele slabe in tratarea socului septic cu  anticorpi anti-TNFα, respectiv cu receptor pentru IL-2 (IL-2R) au confirmat ipoteza ca blocarea actiunii acestor citokine proinflamatoare nu este o tinta decisiva. Astfel, atentia celor care cauta remediu pentru socul septic s-a orientat asupra HMGB-1, un posibil factor decisiv in “inflammatory over-reaction” a sistemului imun cu consecinte patologice dramatice.

    O alternativa promitatoare pentru terapia socului septic sau a inflamatiei cronice (ex. artrita reumatoidă) ar fi găsirea unor produşi naturali capabili să moduleze exprimarea, transportul membranar, respectiv actiunea HMGB-1. Avantajul substantelor naturale mici in comparatie cu anticorpii monoclonali este evidentă, deoarece eficienta proteinelor monoclonale este limitata in timp din cauza formarii de anti-anticorpi, precum si din cauza altor efecte secundare alarmante. Identificarea unor substante naturale noi obtinute din plante, organisme marine sau surse bacteriene si obtinerea lor pe scara mai mare este o problema dificila, cu solutii diferentiate in fiecare caz. Autoritatile de omologare a medicamentelor au pretentii foarte exigente pentru validarea procesului tehnologic de obtinere, pentru controlul analitic al continutului, pentru dozarea sensibila a impuritatilor si limitarea stricta a tuturor acestora. Rezolvarea acestor probleme complexe conform prescriptiilor Agentiei Europene de Medicamente (EMEA) este o tinta cheie a prezentului proiect, in vederea asigurarii reproductibilitatii rezultatelor ce urmeaza a fi obtinute.

    Pe de alta parte, s-a demostrat că in cazul bolilor neoplazice maligne, eliberarea proteinei HMGB-1 de catre celulele transformate malign este obligatorie pentru activarea celulelor dendritice ale gazdei, in vederea procesarii si prezentarii antigenelor tumorale. S-a evidentiat faptul că HMGB-1 interactioneaza cu receptorii Toll-like-4 (TLR-4) de pe celulele dendritice, care sunt implicati selectiv in activarea limfocitelor T antitumorale in vivo. In privinta corelatiei dintre raspunsul la chimioterapie si expresia HMGB-1, s-a demonstrat recent că celulele maligne HMGB-1 negative („deficiente”) sunt de 3-10 ori mai rezistente la acţiunea chimioterapicelor, comparativ cu celulele maligne pozitive pentru HMGB-1. Celulele HMGB-1 deficiente se caracterizeaza prin compromiterea inhibarii ciclului celular si prin reducerea activarii caspazelor. Aceste date au impus HMGB-1 ca proteina tinta pentru modularea chimioterapiei.

    Datele de literatura relatate mai sus au determinat elaborarea propunerii acestui proiect de cercetare care va urmari:

    –        identificarea şi tehnologia de obţinere a unor compusi naturali obtinuti din plante care, prin modularea activitaţii sau prin inhibarea eliberării extracelulare a HMGB-1, ar deveni o opţiune terapeutică pentru socul septic sever sau pentru posologii in inflamatii acute sau cronice;

    –        identificarea unor compusi obtinuti din extracte bacteriene, compusi cu  acţiune de agonist ai TLR, cu capacitate de a eficientiza chimio- si radioterapia bolilor tumorale.

    Rezultatele stiintifice obtinute vor constitui baza dezvoltarii unor biotehnologii performante in domeniul produselor naturale bioactive, in scopul obtinerii de bioproduse de inalta selectivitate.

     

     

    Obiectivele generale ale proiectului vizeaza dezvoltarea de terapii medicale şi eficientizarea sistemului de sănătate publică si urmaresc:

    –      izolarea prin biotehnologie extractiva de noi compusi naturali capabili sa moduleze producerea sau inhibarea HMGB-1 de catre celulele mieloide sau tumorale;

    –      identificarea si obtinerea prin tehnologiile elaborate a unor compusi naturali cu potential de utilizare ca medicamente cu actiune antiinfectioasa, antiiflamatoare sau antitumorala.

     

     

    Obiective specifice ale proiectului:

    I.     Adaptarea unor tehnologii pentru obtinerea din extracte de plante sau bacteriene a unor compusi naturali cu activitate de modulare a producerii HMGB-1;

    II.     Caracterizarea analitica a fractiunilor si/sau a compusilor naturali obtinuti;

    III.     Elaborarea de modele experimentale in vivo si in vitro si aplicarea acestora in vederea caracterizarii fractiunilor si/sau compuslor naturali obtinuti, ca agenti antiinfectiosi, antiinflamatori sau antitumorali;

    IV.     Obtinerea de fractiuni sau compusi naturali adecvati unor teste farmacologice si efectuarea acestor teste; elaborarea tehnologiei de obtinere la nivel de laborator a unui compus natural promitator.

     

     

     

    Etapa I (raportare 6 februarie 2009): Analizarea tehnologiilor  de  obtinere  si  a  metodelor

    de testare a extractelor de plante sau bacteriene cu capacitate de modulare a producerii HMGB-1

    Rezumatul Etapei 1:

    In prima etapa de derulare a proiectului de cercetare s-au realizat studii documentare privind modelele experimentale in vitro si in vivo aplicabile pentru evidentierea activitatilor imunologice si farmacologice ale extractelor de plante, potential utilizabile in tratamentul antiinflamator, cel al socului septic sau in chimio si radioterapia bolilor neoplazice maligne.

    Pentru identificarea extractelor naturale cu prezumtiva actiune de modulare a factorului HMG1, au fost alese cateva plante care au actiune antiinflamatoare confirmata de date farmacologice si imuno-farmacologice controlate.

    S-a procedat la prepararea unor extracte primare, fractionarea lor prin extractii selective, apoi caracterizarea compozitiei extractelor.

    In vederea studierii activitatii antiinflamatoare si/sau imunomodulatoare a compusilor izolati, au fost selectate si precizate urmatoarele modele experimentale in vitro si in vivo:

    – stimularea monocitelor/macrofagelor umane cu LPS la nivel de TLR-4 si cuantificarea expresiei Dectin-1 prin tehnica citometriei in flux;

    – modularea producerii de TNFa si NO in macrofage murine activate la nivel de TLR-4;

    – testarea capacitatii antioxidante si modularea producerii speciilor reactive de oxigen din macrofage murine si celule polimorfonucleare umane;

    – modularea producerii de citokine in vitro (TNFa, IL-10, IL-12p40 etc) de catre macrofage murine si celule PMN umane activate la nivelul receptorilor TLR si Dectin-1;

    – modularea socului endotoxic in vivo (soareci Balb/c);

    – modularea secretiei extracelulare a HMGB-1 din celule mieloide activate;

    – inhibarea cresterii celulelor tumorale utilizand modele experimentale in vitro si in vivo;

    Pentru studierea activitatii farmacologice, au fost elaborate si precizate urmatoarele modele experimentale in vivo:

    – peritonita septica indusa prin ligaturarea si perforarea cecului;

    – metode farmacologice de testare a activitatii antiinflamatorii: modelul edemului urechii de soarece sau sobolan; modelul edemului labei de sobolan (prin diferiti agenti iritanti).

    Oiectivele primei etape de executie a proiectului au fost realizate in intregime, ceea ce va permite ca in final sa putem identifica compusi antiinflamatori eficienti.

     

     

     

    Etapa 2 (raportare 15 decembrie 2009): Obtinerea de substante active, caracterizarea capacitatii lor antiinflamatoare si de ameliorare a socului septic

     

    Rezumatul Etapei 2:

    In a doua etapa de derulare a proiectului de cercetare au fost purificate o serie de extracte naturale si s-au realizat studii privind capacitatea antioxidanta a acestora si potentialul lor de a inhiba SRO si NO.

    Utilizand metode cromatografice performante (HPFC, HPLC preparativa), partenerul Donatur GmbH a obtinut extracte naturale pe care le-a testat din punct de vedere al activitatii lor biologice. Unele dintre acestea au inhibat semnificativ maturarea celulelor dendritice in vitro, proliferarea limfocitelor T alogenice, dovedind astfel posibila eficacitate in boli autoimune. Dintre fractiunile cu efect de suprimare a maturarii celulalor dendritice, unele s-au dovedit toxice. Examinarea influentei extractelor purificate analizate asupra ATP-azei de sodiu/potasiu, respectiv de calciu, a dovedit ca actiunea lor asupra ATP-azelor de ioni alcalini are o semnificatie redusa.

    Sase extracte izolate si purificate de catre partenerul Donatur GmbH au fost investigate in cadrul Laboratorului Imunomodulare in ceea ce priveste capacitatea antioxidanta si potentialul de a inhiba SRO si NO.

    Utilizand modele experimentale atat in sistem acelular (ORAC, capacitatea antioxidanta totala, Griess acelular), cat si in sistem celular (chemiluminometrie cu luminol) s-a demonstrat ca:

    – Extractul purificat MCS A213 (1, 5 si 10μg) este un potential epurator al radicalilor de oxigen;

    – Extractele MCS Db213, MCS De213, OCS CD154 si OCS D155 manifesta proprietati imunomodulatorii;

    – MCS Ab213 reprezinta un potential agent terapeutic antiinflamator, scazand (dependent de doza) productia de SRO in celule PMN umane nestimulate sau stimulate cu Pam3Cys;

    – Compusii testati nu si-au dovedit calitati de epuratori ai speciilor reactive de azot.

    Consideram ca prin aplicarea modelelor experimentale elaborate si precizate in aceasta faza de derulare a proiectului se vor putea selecta compusi bioactivi eficienti in tratamentul proceselor inflamatorii, in special cronice, stiut fiind ca acestea favorizeaza dezvoltarea bolilor neoplazice maligne.

     

     

     

    Etapa 3 (raportare 15 decembrie 2010): Optimizarea tehnologiilor de obtinere a substantelor active si testarea actiunii lor imunomodulatoare si anticanceroase. Testarea imunologica a compusilor naturali noi obtinuti

     

    Rezumatul Etapei 3:

    In a treia etapa de derulare a proiectului de cercetare au fost identificate procedee tehnologice adecvate pentru obtinerea de fractiuni active din extracte de Helleborus purpurascens (extracte cu dovedita activitate biologica); aceste tehnologii pot fi aplicate pe scara pilot si vor putea fi transpuse pe scara industriala (prin inca o marire de 10 ori) cu scopul de a obtine substante active cu activitate farmacologica.

    Dintre extractele cu activitate biologica semnificativa a fost selectat extractul inalt purificat MCS Ab21. Cu ajutorul acestui compus au fost realizate studii (in vitro si in vivo) care au condus la obtinerea unor rezultate importante, atat pentru indeplinirea obiectivelor etapei de executie, cat si pentru continuarea cercetarilor.

    Modele experimentale adecvate ce au fost aplicate au avut in vedere urmatoarele:

    –        Modularea secretiei extracelulare a HMGB-1 de catre celule mieloide activate, utilizand compusul biologic activ selectat (teste in vitro);

    –        Testarea capacitatii compusului selectat de inhibare a socului septic indus experimental la soareci (in vivo) ;

    –        Investigarea capacitatii compusului biologic activ de a modula  (in vitro) eliberarea de HMGB1 din celule tumorale (in absenta sau in prezenta substantelor citostatice) ;

    –        Studiu privind eficacitatea tratamentelor aplicate in clinici oncologice utilizand teste specifice imunologice.

    Rezultate obtinute sunt semnificative si au condus la urmatoarele concluzii:

    – Extractul inalt purificat MCS Ab21 a fost selectat pentru studii (in vitro si in vivo) in ceea ce priveste efectul acestuia asupra eliberarii HMGB1, atat in sepsis, cat si in maladii neoplazice.

    – Cand este utilizat in doze mici (5ug), MCS Ab21este capabil sa inhibe eliberarea de HMGB1 din celulele monunulceare umane activate cu LPS. La concentratii superioare, cantitatea de HMGB-1 eliberata creste, dar testul de citotoxicitate a demonstrat ca MCS Ab21 (5, 10 si 25μg) nu are capacitate citotoxica asupra populatiilor de celule mononucleare normale.

    – La inducerea socului septic cu ajutorul metodei ligaturii cecale cu punctie, MCS Ab21 este capabil sa creasca rata de supravietuire a soarecilor C57BL/6 cu sepsis, comparativ cu animalele din lotul martor negativ (animale cu sepsis, mortalitate 100%).

    – Utilizat in doze de 5 si 10ug, MCS Ab21 este capabil sa inhibe eliberarea de HMGB1 in celulele tumorale SK-OV (cancer de ovar). Aceste date argumenteaza ideea unei posibile utilizari a MCS Ab21 (dupa efectuarea unor cercetari suplimentare) ca agent terapeutic adjuvant in tratamentul cancerelor de ovar.

    – Studiul efectuat cu privire la eficacitatea tratamentelor aplicate in practica medicala evidentiaza faptul ca in cazul pacientelor cu cancer ovarian care au beneficiat de o monitorizare corecta si completa, care au acceptat toate metodele terapeutice in momentele optime, s-a constatat o rata de supravietuire semnificativ crescuta, in conditii bune de viata, putand concluziona ca in general aceste cancere sunt chimiorespondente iar citoreductiile reprezinta o manevra terapeutica importanta in evolutia cancerogenezei, influentand si ele raspunsul terapeutic. Se suspicioneaza ca exista modalitati neelucidate sau cel putin neintelese inca prin care aceste raspunsuri sunt semnificativ crescute la unele grupuri de paciente, cu toate ca s-a folosit acelasi protocol terapeutic. Cercetarea actuala cauta sa clarifice tocmai aceste posibile cai ale cancerogenezei si sa identifice modalitati de augmentare a raspunsului terapeutic.

    – Cercetarile efectuate au urmarit si evidentierea rolului diferitilor markeri moleculari identificati la pacientele cu cancer ovarian utilizand teste specifice imunologice. In acest scop a fost deja creata o baza de date cu toate pacientele luate in considerare pentru studiu si au fost efectuate 25 de teste IHC din totalul de 76 (determinarile continua si in prezent si se vor finaliza in martie 2011).

    Aceste date sustin importanta si necesitatea continuarii studiilor prin testarea in vitro a unor inhibitori ai HMGB1 deja aprobati ca agenti terapeutici (ex. etilpiruvatul), paralel cu produsul natural MCS Ab21; loturi semnificative statistic de paciente cu cancer ovarian vor fi tratate cu un medicament aprobat in acest sens.

    Consideram ca prin realizarea in intregime a obiectivele acestei etape de executie a proiectului si luand in considerare rezultatele obtinute, la terminarea studiilor se va putea identifica cel putin un compus bioactiv eficient cu proprietati antiinflamatoare si/sau antitumorale.

     

     

    Etapa 4 (raportare 10 decembrie 2011): Valorificarea rezultatelor si a tehnologiei de obtinere a compusului natural cu potential optim pentru aplicare terapeutica

     

     

    Rezumatul Etapei 4

     

    In a patra etapa de derulare a proiectului de cercetare s-a definitivat tehnologia pentru izolarea si purificarea din extractul de Helleborus purpurascens a compusului cu actiune imunomodulatoare – MCS Ab21, selectat in etapa precedenta. Pentru indepartarea unor impuritati proinflamatoare identificate in primele sarje pilot, s-au aplicat procese de ultrafiltrare pe membrane selective si precipitare / recristalizare repetata, cu control analitic riguros al impuritatilor inclusiv prin teste biologice.  Au fost identificate astfel procedee tehnologice adecvate care se pot aplica pe scara pilot pentru obtinerea si purificarea compusului activ cu activitate farmacologica, reusindu-se in final definitivarea tehnologiei de obtinere pentru acest compus, in vederea transpunerii ei la scară industriala.

    Se considera ca procesul tehnologic aplicat pentru obtinerea compusului bioactiv reprezinta combinatia adecvata a unor tehnici extractive si de purificare cunoscute in industria farmaceutica bazata pe produse naturale. Tehnologia realizeaza astfel un compromis intre (i) utilizarea unui ”extract total” dintr-o  planta medicinala care contine toate componentele extractabile, inclusiv cele toxice si (ii) utilizarea unei singure substante farmacologic active, izolata dintr-o planta sau reprodusa prin sinteza.

    Activitatea biologica a produsului selectat a fost investigata in continuare in cadrul unor modele experimentale in vitro (celule tumorale ovariene SKOV) si in vivo (soareci  nuzi, imunodeficenti) in ceea ce priveste inhibarea eliberarii unor citokine proinflamatoare (HMGB1, VEGF, IL-6). S-a continuat si studiul farmacologic inceput in etapa precedenta.

    S-a efectuat un studiu clinic experimental in vederea eficientizarii chimioterapiei cancerelor ovariene si s-au realizat testari histopatologice si prin teste specifice a fragmentelor tisulare ovariene tumorale recoltate in clinicile partenere.

    Rezultate obtinute sunt semnificative si au condus la urmatoarele concluzii:

    – Datele farmacologice obţinute în condiţiile modelului experimental de şoc endotoxic indus la şoareci (prin  administrarea de LPS) demonstreaza că rata supravieţuirii animalelor tratate cu compusul MCS Ab21 a fost ameliorata, fiind 33% comparativ cu animalele din lotul control (supravietuire 0%).

    – Prin testarea produsului biologic activ MCS Ab21 in modele experimentale in vitro pe celule tumorale SKOV (cancer de ovar), a rezultat faptul ca utilizarea acestui produs alaturi de combinatia de citostatice Paclitaxel + Carboplatin (medicamente de electie in cancerul de ovar), aduce un plus de eficienta chimioterapiei aplicate in cancerele ovariene, comparativ cu capacitatea fiecarui agent chimioterapeutic individual; aceasta concluzie este sustinuta de capacitatea compusului testat de a inhiba cresterea celulelor tumorale ovariene SKOV si eliberarea de citokine (VEGF, HMGB1, IL-6). Consideram ca acest produs bioactiv ar actiona ca un potential inhibitor de PI3K, fapt sustinut si de studiile noastre anterioare.

    – Rezultatele noastre obtinute in studiile in vivo, au aratat faptul ca tratamentul combinat Paclitaxel + Carboplatin, asociat cu MCS Ab21, inhiba cu 25% productia de ascita acumulata in cavitatea intraabdominala si cu 50% concentratia de VEGF in lichidul ascitic la soareci, comparativ cu lotul de control.

    – Compusul MCS Ab21 este capabil sa influenteze negativ activarea VEGF (citokina ce activeaza expresia PI3K) in modelul de cancer ovarian indus in vivo la soareci, probabil prin inhibarea activitatii Akt kinazei.

                – Experimentele in vitro (utilizand celule tumorale SKOV) au aratat ca MCS Ab21 este capabil sa inhibe eliberarea de IL-6. Tinand cont de faptul ca IL-6 secretata de celulele tumorale actioneaza autocrin si creste expresia pompelor de eflux MDR1 (multidrug resistance) responsabile de dezvoltarea rezistentei fata de agenti terapeutici, este posibil ca MCS Ab21 sa fie implicat in inhibarea/reducerea chimiorezistentei.

    – Analizand nivelele de HMGB1, citokina proinflamatoare tinta in terapia bolilor neoplazice maligne, rezultatele studiului in vitro au aratat faptul ca produsul MCS Ab21 actioneaza asupra celulelor tumorale SKOV, fiind capabil sa scada eliberarea HMGB1 (30% fata de control), actiune remarcata si cand produsul este aplicat impreuna cu Paclitaxel si Carboplatin; tratamentul celulelor cu MCS Ab21 impreuna cu ambele citostatice reuseste sa reduca la 40% concentratia de HMGB1 doar in cazul [Paclitaxel 10mM + Carboplatin 50mg].

                – Rezultatele obtinute in cadrul modelului experimental de cancer ovarian indus in vivo la soareci, au aratat ca MCS Ab21 nu scade semnificativ nivelul de HMGB1 din ascita. Doar in cazul tratamentului combinat, MCS Ab21 plus cele 2 citostatice mentionate, s-a observat o diminuare a concentratiei de HMGB1: 22% fata de control (soareci netratati).

    – In studiile clinice efectuate, prin monitorizarea timp de 3 ani (2008-2011) a unui numar total de 252 paciente diagnosticate cu cancer ovarian, s-a reusit realizarea unei importante baze de date. Pacientele care au beneficiat de o monitorizare corecta si completa, acceptand toate metodele terapeutice in momentele optime, au avut supravietuiri semnificative in conditii bune de viata. Pacientele la care s-a efectuat interventie chirurgicala optimala si au beneficat de tratament chimioterapic reprezentat de asocierea dintre Paclitaxel si Carboplatin au avut cea mai buna evolutie.

    – Avand in vedere ca acest tip de cancer este frecvent insotit si de aparitia lichidului ascitic, s-a investigat si prezenta citokinelor proinflamatoare HMGB1, VEGF si IL-6 in 15 probe de ascita asociata tumorilor ovariene, probe ce au fost recoltate de la paciente diagnosticate cu cancer ovarian in stadii avansate (IIIC si IV), aflate in observatie in clinicile partenere. Rezultatele obtinute au demonstrat ca, in general, nivelele citokinelor proinflamatoare masurate sunt ridicate, in concordanta cu precizarile din literatura de specialitate.

    – Au fost efectuate 76 teste imunohistochimice, iar rezultatele obtinute au aratat ca cel mai frecvent tip histopatologic identificat a fost chistadenocarcinomul papilifer, modificarile moleculare cele mai frecvente la acest tip fiind markerii CA 125 pozitiv, c-erb-B2 negativ, Ki-67 pozitiv intermediar, p53 negativ.

    – Cancerul ovarian este in general chimiorespondent iar citoreductia chirurgicala reprezinta o metoda importanta si eficienta, influentand raspunsul terapeutic si “resensibilizand” tumorile maligne ovariene la tratamentul sistemic specific oncologic.

    – Cele mai frecvente recidive inregistrate, cat si precocitatea recidivelor in perioada de monitorizare s-au inregistrat la pacientele tratate chirurgical suboptimal, fapt ce sustine importanta unei descrieri exhaustive si corecte a protocolului operator.

    – S-a definitivat tehnologia pentru izolarea si purificarea din extracte de Helleborus purpurascens a compusului cu actiune imunomodulatoare – MCS Ab21.

    – Dificultatile aparute prin prezenta unor impuritati proinflamatoare gasite in primele sarje pilot in cazul produsului MCS Ab21 au impus aplicarea suplimentara a unor procese de ultrafiltrare pe membrane selective si precipitare / recristalizare repetata, cu control analitic riguros al impuritatilor inclusiv prin teste biologice. 

    – In 2011, partenerii consortiului de cercetare au publicat 2 articole stiintifice (unul intr-o revista cu cotatie ISI si unul intr-o revista B+) si au participat cu lucrari la 3 manifestari stiintifice nationale si internationale, unde au fost prezentate cele mai semnificative rezultate obtinute in fazele anterioare de derulare a proiectului. In ceea ce priveste posibilitatile de colaborare, s-au discutat eventuale colaborari cu institutii de cercetare clinica in domeniul ginecologiei oncologice care vor constitui un punct de plecare pentru viitoare astfel de proiecte.

    – La incheierea proiectului, participantii au interpretat toate datele experimentale obtinute si au analizat modalitatile de aplicare in terapie a produsului biologic activ ce a fost obtinut, purificat si testat.

    Consideram ca rezultatele experimentale obtinute in aceasta faza de derulare a proiectului de cercetare sunt deosebit de semnificative pentru atingerea obiectivelor propuse.

     

     

    Concluzii si perspective

     

    In urma analizarii si interpretarii tuturor rezultatelor experimentale obtinute pe parcursul derularii acestui proiect de cercetare, partenerii membrii ai consortiului de cercetare au ajuns la urmatoarele Concluzii generale:

     

    – Au fost analizate diverse extracte din Helleborus purpurascens, avand drept scop final elaborarea unei tehnologii complexe de obtinere si purificare a unui compus biologic activ.

    –                 Activitatea biologica a unei fractiuni purificate si chimic omogena e reproductibila, spre deosebire de activitatea biologica a amestecurilor de compozitii necunoscute si de natura chimica heterogena.

    –                 Concluzia de mai sus e valabila si pentru amestecuri neseparabile formate din acelasi tip de substante, cum sunt de exemplu helletioninele.

    –                 S-a considerat ca separarea speciilor individuale este nerentabila datorita costurilor de preparare si purificare foarte ridicate si a randamentului scazut.

    – In final, s-a reusit definitivarea unei tehnologii pentru izolarea si purificarea din extracte de Helleborus purpurascens a unui compus cu actiune imunomodulatoare (MCS Ab21) si s-a elaborat o Fisa tehnologie, considerandu-se modul de aplicare instalatie pilot sau echivalent.

    – Dificultatile aparute prin prezenta unor impuritati proinflamatoare gasite in primele sarje pilot in cazul produsului MCS Ab21 au impus aplicarea suplimentara a unor procese de ultrafiltrare pe membrane selective si precipitare / recristalizare repetata, cu control analitic riguros al impuritatilor inclusiv prin teste biologice. 

    – Procesul tehnologic aplicat pentru obtinerea compusului bioactiv reprezinta combinatia adecvata a unor tehnici extractive si de purificare cunoscute in industria farmaceutica bazata pe produse naturale.

    – Tehnologia realizeaza astfel un compromis intre (i) utilizarea unui ”extract total” dintr-o  planta medicinala care contine toate componentele extractabile, inclusiv cele toxice si (ii) utilizarea unei singure substante farmacologic active, izolata dintr-o planta sau reprodusa prin sinteza.

    –                 In cadrul Laboratorului Imunomodulare din INCDMI Cantacuzino (CO) au fost testate intr-o prima faza 6 extracte obtinute si purificate din Helleborus purpurascens de catre partenerul P1 (Donatur GmbH). Studiile experimentale efectuate au condus la punerea in evidenta a urmatoarelor proprietati:

    • Extractul MCS Ab213 (1, 5 si 10μg) s-a dovedit un epurator al radicalilor de oxigen eliberate de celulele PMN umane (efectul intracelular asupra productiei de SRO este nesemnificativ).
    • Alte extracte (MCS Db213, MCS De213, OCS CD154 si OCS D155) manifesta proprietati imunomodulatorii, valoarea terapeutica depinzand de doza si efectul urmarit.
    • MCS Ab21 reprezinta un potential agent terapeutic antiinflamator, scazand (dependent de doza) productia de SRO in celule PMN umane nestimulate sau stimulate cu Pam3Cys.
    • Extractele testate nu si-au dovedit calitati de epuratori ai speciilor reactive de azot.

    – S-a ales extractul inalt purificat MCS Ab21 drept compus biologic activ ce a fost investigat in continuare in modele experimentale (in vivo si in vitro) adecvate, rezultatele obtinute demonstrand ca acesta este un potential agent imunomodulator, atat in sepsis, cat si in maladii neoplazice maligne.

      – Au fost identificate procedee tehnologice adecvate care se pot aplica pe scara pilot pentru obtinerea si purificarea compusului activ cu activitate farmacologica, reusindu-se in final definitivarea  tehnologiei de obtinere pentru acest compus, in vederea transpunerii ei la scară industriala.

    – Datele obtinute in studierea activitatii farmacologice (efectuate de partenerul P2), respectiv experimentele de inducere a socului septic prin ligatura cecala cu punctie (CLP) si socul endotoxic indus cu LPS, au demonstrat ca MCS Ab21 are capacitate de atenuare a socului septic, fiind capabil sa creasca rata de supravietuire a soarecilor C57BL/6 cu sepsis (33%), comparativ cu animalele din lotul martor (animale cu sepsis, supravietuire 0%), probabil interferand cu mecanismul HMGB1 sub forma de citokina proinflamatoare.

    – MCS Ab21, atunci cand a fost utilizat in doze mici (5ug), a fost capabil sa inhibe eliberarea de HMGB1 din celulele mononucleare umane activate cu LPS. La concentratii superioare, cantitatea de HMGB1 eliberata a crescut, dar testul de citotoxicitate a demonstrat ca MCS Ab21 (5, 10 si 25μg) nu are capacitate citotoxica asupra populatiilor de celule mononucleare normale. Acest efect s-ar putea datora eliberarii citoplasmatice a HMGB1, urmata de cresterea concentratiei HMGB1 extracelular. Doza de MCS Ab21 de 5µg apare astfel ca fiind cea cu potentialul terapeutic cel mai ridicat.

    – MCS Ab21 in dozele de 5 si 10ug a fost capabil sa inhibe eliberarea de HMGB1 in celulele SKOV (cancer de ovar). Aceste date au argumentat ideea unei posibile utilizari a MCS Ab21 (dupa efectuarea unor cercetari suplimentare) ca agent terapeutic adjuvant in tratamentul acestui tip de cancer.

    – Prin testarea in continuare a produsului biologic activ MCS Ab21 (obtinut si purificat la scara pilot) in modele experimentale in vitro pe celule tumorale SKOV, a rezultat faptul ca utilizarea acestui produs alaturi de combinatia de citostatice Paclitaxel + Carboplatin (medicamente de electie in cancerul de ovar), ar aduce un plus de eficienta chimioterapiei aplicate in cancerele ovariene, comparativ cu capacitatea fiecarui agent chimioterapeutic individual; aceasta concluzie este sustinuta de capacitatea compusului testat de a inhiba cresterea celulelor tumorale ovariene SKOV si eliberarea de citokine (VEGF, HMGB1, IL-6). Consideram ca acest produs bioactiv ar actiona ca un potential inhibitor de PI3K, fapt sustinut si de studiile noastre anterioare.

    – Rezultatele obtinute in studiile in vivo, au aratat faptul ca tratamentul combinat Paclitaxel + Carboplatin, asociat cu MCS Ab21, inhiba cu 25% productia de ascita acumulata in cavitatea intraabdominala si cu 50% concentratia de VEGF in lichidul ascitic la soareci nuzi (imunodeficienti), comparativ cu lotul de control.

    – Compusul MCS Ab21 este capabil sa influenteze negativ secretia VEGF (citokina ce activeaza expresia PI3K) in modelul de cancer ovarian indus in vivo la soareci, probabil prin inhibarea activitatii PI3K/Akt. Blocarea eliberarii VEGF si scaderea concentratiei acestei citokine ar putea reprezenta un alt avantaj al utilizarii produsului MCS Ab21.

                – Experimentele in vitro (utilizand celule tumorale SKOV) au aratat ca MCS Ab21 are tendinta sa inhibe eliberarea de IL-6. Tinand cont de faptul ca IL-6 secretata de celulele tumorale actioneaza autocrin si creste expresia pompelor de eflux MDR1 (multidrug resistance) responsabile de dezvoltarea rezistentei fata de agenti terapeutici, este posibil ca MCS Ab21 sa fie implicat in inhibarea/reducerea chimiorezistentei.

    – Analizand nivelele de HMGB1, citokina proinflamatoare tinta in terapia bolilor neoplazice maligne, rezultatele studiului in vitro au aratat faptul ca produsul MCS Ab21 actioneaza asupra celulelor tumorale SKOV, fiind capabil sa scada eliberarea HMGB1 (30% fata de control), actiune remarcata si cand produsul este aplicat impreuna cu Paclitaxel si Carboplatin; tratamentul celulelor cu MCS Ab21 impreuna cu ambele citostatice reuseste sa reduca la 40% concentratia de HMGB1 doar in cazul [Paclitaxel 10mM + Carboplatin 50mg].

                – Rezultatele obtinute in cadrul modelului experimental de cancer ovarian indus in vivo la soareci, au aratat ca MCS Ab21 administrat i.v. nu scade semnificativ nivelul de HMGB1 din ascita. Doar in cazul tratamentului combinat, MCS Ab21 plus cele 2 citostatice, s-a observat o diminuare a concentratiei de HMGB1: 22% fata de control (soareci netratati).

                – Avand in vedere ca acest tip de cancer este frecvent insotit si de aparitia lichidului ascitic, s-a investigat si prezenta unor citokine proinflamatoare (HMGB1, VEGF, IL-6) in probele de ascita asociata tumorilor ovariene, probe ce au fost recoltate de la paciente diagnosticate cu cancer ovarian in stadii avansate (IIIC si IV), aflate in observatie si tratament in clinicile partenere. Rezultatele obtinute au demonstrat ca, in general, nivelele citokinelor proinflamatoare masurate sunt ridicate, in concordanta cu precizarile din literatura de specialitate.

    – Pe parcursul derularii proiectului, colectivele partenerilor P3 si P4 au realizat un studiu clinic pentru crearea unei baze de date cuprinzand paciente diagnosticate cu cancer ovarian, in scopul investigarii prin teste specifice imunologice a eficacitatii tratamentelor aplicate acestor bolnave.

    – Prin monitorizarea timp de 3 ani (2008-2011) a unui numar total de 252 paciente diagnosticate cu cancer ovarian, s-a reusit realizarea unei importante baze de date.

    – A fost intocmit un tablou clinic prin investigatii imagistice (ecografie, tomografie) si biologice (explorari biochimice si antigenice) si a fost stabilita malignitatea prin examen citologic dupa paracenteza sau/si toracenteza in cazul prezentei diseminarilor pleurale.

    – S-a urmarit si evidentierea rolului diferitilor markeri moleculari identificati la pacientele cu cancer ovarian, utilizand teste specifice imunologice.

    – S-a efectuat evaluarea aspectelor histopatologice si imunohistochimice la cazurile de tumori ovariene la care au fost disponibile piese de exereza chirurgicala din tumora sau fragmente de peritoneu.

    – S-au efectuat 76 teste imunohistochimice si rezultatele obtinute au aratat ca cel mai frecvent tip histopatologic identificat a fost chistadenocarcinomul papilifer, iar modificarile moleculare cele mai frecvente la acest tip au fost markerii CA 125 pozitiv, c-erb-B2 negativ, Ki-67 pozitiv intermediar, p53 negativ (determinati imunohistochimic). Alte variabile care au influentat semnificativ intervalul liber fara semne de boala au fost stadiul TNM si gradul de diferentiere.

    – Explorarile imunohistochimice efectuate permit sintetizarea unui algoritm de diagnostic a responsivitatii la diversele tipuri de tratamente administrate si crearea unui scor prognostic pentru evaluarea riscului de recidiva.

    – Cancerul ovarian este in general chimiorespondent iar citoreductia chirurgicala reprezinta o metoda importanta si eficienta, influentand raspunsul terapeutic si “resensibilizand” tumorile maligne ovariene la tratamentul sistemic specific oncologic.

    – Cercetarile privind eficacitatea tratamentelor aplicate in practica medicala in cazul pacientelor cu cancer ovarian cuprinse in studiul clinic au aratat ca pacientele diagnosticate cu cancer ovarian care au beneficiat de o monitorizare corecta si completa si care a permis aplicarea unor metode terapeutice in momentele optime, au beneficiat de supravietuiri semnificative in conditii bune de viata.  Pacientele la care s-a efectuat interventie chirurgicala optimala si au beneficat de tratament chimioterapic reprezentat de asocierea dintre Paclitaxel si Carboplatin au avut cea mai buna evolutie. Acest algoritm terapeutic urmeaza sa fie verificat statistic prin evaluarea supravietuirii dupa 3 ani.

    – Cele mai frecvente recidive inregistrate, cat si precocitatea recidivelor in primele luni de monitorizare s-au inregistrat la pacientele tratate chirurgical suboptimal, fapt ce sustine importanta unei descrieri exhaustive si corecte a protocolului operator.

    – Se suspicioneaza ca exista modalitati neelucidate sau cel putin neintelese inca prin care aceste raspunsuri sunt semnificativ crescute la unele grupuri de paciente, cu toate ca s-a folosit acelasi protocol terapeutic.

    – Cercetarile intreprinse au cautat sa clarifice tocmai aceste posibile cai ale cancerogenezei si sa identifice modalitati de imbunatatire a raspunsului terapeutic prin determinarea expresiei unor modificari moleculare considerate a fi cheie in istoria naturala a cancerului ovarian.

    – In ultimul an de derulare a proiectului, produsul bioactiv purificat MCS Ab21 a fost evaluat cu precadere sub aspectul capacitatii sale de crestere a eficientei agentilor chimioterapeutici.

                – Rezultatele obtinute in toate modelele experimentale utilizate in laborator pentru studierea compusului bioactiv MCS Ab21, sunt sustinute de cele obtinute in studii anterioare, unde am demonstrat ca un extract inalt purificat obtinut din Helleborus purpurascens actioneaza ca inhibitor al PI3K, fiind capabil sa inhibe viabilitatea celulara intr-o maniera asemanatoare inhibitorilor de PI3K, LY294002 si Wortmanina.

                – Aceste rezultate sugereaza faptul ca un tratament combinat MCS Ab21 si Paclitaxel + Carboplatin ar putea inhiba progresia tumorala ovariana si sustin utilizarea produsului bioactiv MCS Ab21, cu rol de inhibitor al PI3K, impreuna cu terapia bazata pe saruri de platina, drept un tratament corespunzator pentru cancerul ovarian.

                – Ramane de determinat daca administrarea produsului MCS Ab21 va permite si aplicarea unor doze mai scazute de citostatice (Paclitaxel + Carboplatin).

                – Consideram ca inhibarea caii de semnalizare PI3K/Akt va facilita tratamentul chimioterapic, iar inhibitorii de PI3K vor fi potentiali adjuvanti in aceste tratamente.

    – Rezultatele obtinute sustin faptul ca produsul purificat MCS Ab21 ar actiona intr-un mod similar cu Topotecan (produs comercial utilizat deseori in tratamentul cancerelor ovariene), prin inducerea apoptozei celulelor tumorale pe calea reglarii negative a semnalizarii PI3K/Akt. Acest tratament combinat ar fi util in special in cazul cancerelor ovariene rezistente la chimioterapie pe baza de saruri de platina. Acest considerent are la baza ipoteza ca, prin inhibarea semnalizarii prin PI3K, celulele tumorale in cancerul ovarian devin mai susceptibile la efectele chimioterapiei pe baza de Paclitaxel-Carboplatin.

    – Datele obtinute sustin ipoteza ca produsul MCS Ab21 poate modula eficient inflamatia, probabil interferand cu mecanismul HMGB1 sub forma de citokina proinflamatoare; astfel s-ar putea explica si capacitatea sa de atenuare a socului septic la soareci, sustinand posibiliatea utilizarii MCS Ab21 ca potential agent antiinflamator in cancer si/sau sepsis.

    – Se presupune ca MCS Ab21 ar fi capabil sa induca apoptoza celulara si sa inhibe angiogeneza in cancerele ovariene. Semnalele antiapoptotice, transmise prin cascada de supravietuire PI3K/Akt, sunt implicate in dezvoltarea tumorii la actiunea medicamentelor chimioterapice.

                – Prin inhibarea PI3K, compususl bioactiv MCS Ab21 impiedica mecanismele prin care celula tumorala isi asigura supravietuirea in cazul unor conditii de stress, cum ar fi tratamentul chimioterapic.

     

    La incheierea acestui proiect de cercetare se pot formula urmatoarele Perspective:

     

    Luand in considerare proprietatile benefice demonstrate ale compusului biologic activ MCS Ab21, cat si faptul ca s-a elaborat o tehnologie pentru obtinerea si purificarea acestuia, in masura in care o firma din Romania va dori sa preia aceasta tehnologie si va reusi scaderea costurilor aferente purificarilor necesare la nivel industrial, atunci acest agent terapeutic ar putea fi un nou produs farmaceutic pentru eficientizarea chimioterapiei cancerelor ovariene, in special in cazurile care manifesta rezistenta la medicamente citostatice.

    – Daca utilizarea produsului cu proprietati imunomodulatoare, MCS Ab21, drept un adjuvant in chimioterapie va creste eficacitatea dozelor mai mici de citostatice, noua combinatie aplicata ar putea fi o modalitate efectiva pentru controlul cresterii tumorale in cazul pacientelor cu cancer ovarian, cu efecte secundare acceptabile.

    – In acelasi timp, noul produs natural purificat va putea fi folosit si in tratamentul cazurilor de sepsis sever, putand influenta benefic reducerea mortalitatii.

          – Explorarile imunohistochimice efectuate la pacientele cu cancer ovarian luate in studiu, vor permite sintetizarea unui algoritm de diagnostic a responsivitatii la diversele tipuri de tratamente administrate si crearea unui scor prognostic pentru evaluarea riscului de recidiva.

     

    Titlul proiectului: Markeri moleculari utili in diagnosticul si epidemiologia  toxiinfectiilor alimentare produse de bacilli gram negativi

    Acronim: TIAGEN



    Rezumat

    In ciuda progreselor evidente inregistrate in ultimul timp atat in domeniul medical cat si in cel al tehnologiilor alimentare, toxiinfectiile alimentare (TIA), definite ca boli consecutive consumului de alimente sau apa contaminata, continua sa reprezinte o problema de sanatate publica majora. Se cunosc mai mult de 250 tipuri de toxiinfectii alimentare, multe dintre acestea fiind determinate de toxine sau diferite substante chimice periculoase care contamineaza alimentele. Microorganismele sau toxinele elaborate de acestea reprezinta o amenintare pentru sanatatea publica datorita ratei inalte de multiplicare a acestora si cailor multiple de raspandire.

    Daca pentru toxiinfectiile produse de agenti bacterieni cu patogenitate recunoscuta (Salmonella, Shigella, etc) metodologiile de diagnostic sunt clare si dau rezultate specifice, selective si reproductibile, nu acelasi lucru se poate spune despre diagnosticul toxiinfectiilor alimentare determinate de agenti bacterieni pana nu demult nerepertoriati ca patogeni (patotipuri enterice de E. coli si in special patotipul emergent VTEC) sau bacterii greu/dificil cultivabile (Campylobacter, forme viabile dar noncultivabile a patogenilor recunoscuti-VBNC).

    Proiectul isi propune o evaluare a metodelor clasice utilizate in laboratorul de microbiologie si fundamentarea necesitatii introducerii metodelor moleculare pentru diagnosticul de laborator si epidemiologia toxiinfectiilor alimentare produse de bacili gram negativi. Rezultatele obtinute vor fi analizate in consortiu alcatuit din cercetatori din domeniul academic, cercetare fundamentala si aplicativa, medici specialisti in boli infectioase si epidemiologi, in vederea elaborarii unui ghid national privind diagnosticul si epidemiologia acestor imbolnaviri.

    Probele patologice/tulpinile izolate si caracterizate prin metode clasice in laboratorul clinic al partenerului 2 vor fi expediate coordonatorului pentru analiza moleculara. Se va utiliza tehnica PCR pentru detectarea unor structuri genetice specie specifice, precum si gene responsabile pentru sinteza factorilor de virulenta bacteriana. Metodele moleculare, optimizate pe tulpini izolate si caracterizate, vor fi utilizate pentru diagnostic direct in produsul patologic. Va creste in felul acesta operativitatea in focar ca urmare a rapiditatii raspunsului, dar mai ales va creste specificitatea in cazul infectiilor datorate agentilor bacterieni conditionat patogeni, greu cultivabili sau noncultivabili.

    Activitatea multidisciplinara, integrata si colaborativa a colectivului de cercetatori si specialisti din domeniul bolilor infectioase, dezvoltarea unui sistem bazat pe activitate de laborator microbiologic si introducerea metodelor genetice de diagnostic si analiza epidemiologica vor conduce la dezvoltarea unui algoritm de prevenire si control al toxiinfectiilor alimentare cu bacili gram negativi. Activitatea se inscrie in strategia de lucru a Centrului European de Prevenire si Control al Bolilor Transmisibile (ECDC) privind sporirea rolului laboratorului in controlul bolilor infectioase si introducerea metodelor de microbiologie moleculara in diagnosticul si epidemiologia acestora. Implementarea rezultatelor stiintifice ale studiului de fata in practica medicala va contribui la cresterea competitivitatii in cadrul largit al ECDC in care Romania este parte integrata.



    Obiectivele generale si rezultate estimate

    Obiectivul general al proiectului consta in optimizarea metodelor de diagnostic microbiologic al toxiinfectiilor alimentare in vederea participarii eficiente a laboratorului la activitatea de supraveghere si control a acestui tip de imbolnaviri.



    Obiectivele specifice ale proiectului constau in:

    1. Realizarea masei critice de cercetatori implicati in studiul unor boli transmisibile prioritare pentru Romania si Europa in contextul globalizarii circulatiei si comertului cu produse alimentare
    2. Optimizarea supravegherii cu laboratorul a toxiinfectiilor alimentare in vederea operativitatii raspunsului in focar
    3. Cresterea calitatii actului medical prin reducerea numarului de raportari de „boala diareica cu agent etiologic necunoscut”
    4. Armonizarea metodelor de lucru cu cele la nivel european in conformitate cu recomandarile ECDC
    5. Cresterea competitivitatii in cadrul grupului de lucru „wood and water diseases (FWD)organizat la nivelul ECDC



    Institutia coordonatoare

    Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino”

    Director de proiect: Maria Damian, CS I, mdamian@cantacuzino.ro

    Splaiul Independentei 103, Sector 5 Bucuresti

    Tel: +4021.5287276

    Fax: +4021. 5287305

    www.cantacuzino.ro

    e-mail: office@cantacuzino.ro



    Componenta consortiului

    Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” Bucuresti

    Responsabil stiintific: Prof. Dr. Marian Negut, mnegut@cantacuzino.ro

    www.univermed-cdgm.ro


    Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale “Dr. Victor Babes”, Bucuresti

    Responsabil stiintific: Dr. Maria Nica, nicamaria_lab@yahoo.com

    www.spitalulbabes.ro



    Autoritatea contractanta

    Centrul National de Management Programe

    www.cnmp.ro



    Durata proiectului: 2007-2011

    Responsabilitatile aferente fiecarui participant (vezi „Planul de realizare al proiectului”)

    Bugetul proiectului: 1900000 lei (vezi „Informatii financiare despre proiect”)

    Publicatii (vezi lista de publicatii)

    Manifestari stiintifice (vezi lista manifestarilor stiintifice)




    Reuniuni ale partenerilor

    1. 10.12.2008: Reuniune pentru lansarea proiectului

    Participanti: Responsabilii stiintifici impreuna cu echipa de lucru a fiecarui partener implicat in proiect

    Subiecte dezbatute:

    1. prezentarea participantilor
    2. discutarea planului de realizare al proiectului
    3. prezentarea, de catre responsabilii stiintifici ai partenerilor, a activitatilor care urmeaza a fi derulate in etapa 1
    4. discutarea modalitatilor operationale pentru realizarea activitatilor propuse
    5. termene de realizare
    6. discutarea bugetului alocat pe parteneri si categorii de cheltuieli




    Lista de publicatii / comunicari stiintifice

    1. Buiuc D, Neguţ M – Tratat de microbiologie clinică, ed.a 3-a, Ed. Medicală, 2009.
    2. Maria Damian, Dorina Tatu-Chiþoiu, Codruta-Romanita Usein, Gabriela Oprisan,

    Andi-Marian Palade, Sorin Dinu, Camelia Szmal, Simona Adriana Ciontea, Stefania Ceciu, Maria Condei, Ana Persu, Anda Bãicus, Mariana Pop, Ionela Neagoe, Dan Steriu, Radu Codreanu, Marian Graur, Michaela Carmen Cretu, Suzana Cilievici, Maria Nica, Alexandru Ecovoiu and Lucian Gavrilã. Laboratory diagnosis of infectious diarrhoea syndrome; a three years study in two hospitals of infectious diseases. Rom Arch. Microbiol Immunol, 2:89-94, 2009.

    3. Maria Damian. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a bolilor infectioase. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009;

    152.

    4.  Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian Negut. Metode moleculare utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a patogenilor enterici. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, ed III, 2009.

    5. Maria Damian, Andi Palade, Madalina Baltoiu, Codruta-Romanita Usein, Simona Ciontea, Stefania Ceciu, Lavinia Zota si Dorina Tatu-Chitoiu. “Laboratory investigation of Salmonella strains isolated from foodborne outbreaks occured during the last six months in Romania”. Workshop “Intersectoral collaboration for detection, surveillance and response to foodborne diseases” , Polonia, Zegze, 25-28 Mai 2009.



    Documente:


     

     

     

    Etapa 2 /2010: ”Diagnosticul molecular al toxiinfectiilor alimentare”

     

    Activitatile propuse pentru etapa 2 de executie a proiectului 42-106, conform planului de realizare aferent actului aditional nr. 5, au urmarit realizarea urmatoarelor obiective specifice:

    1.- Diagnosticul molecular al agentilor etiologici implicati in toxiinfectiile alimentare,

    2.- Identificarea unor markeri moleculari utili in descrierea proprietatilor de virulenta /

    patogenitate ale acestora,

    3.- Detectarea sursei infectiei prin descrierea caracterelor genetice ale tulpinilor izolate din

    focar,

    4.- Identificarea raspandirii clonale a tulpinilor pe teritoriul tarii.

    Rezumat

    Indiferent daca sunt consummate crude sau procesate, produsele alimentare sunt foarte rar sterile in momentul in care ajung la consumator. Ele pot contine microorganisme comensale, dar adesea contin microorganisme patogene cu inalt potential de raspandire in populatie.

    Organizatia Mondiala a Sanatatii raporteaza ca, in ciuda avantajelor oferite de noile tehnologii si a eforturilor depuse pentru ca hrana destinata omului sa fie sigura, toxiinfectiile alimentare (TIA) raman o problema de sanatate publica atat in tarile dezvoltate cat si in cele in curs de dezvoltare.

    Alimentele de origine animala sunt in principal sursa TIA produse de Salmonella, Listeria, Campylobacter si E.coli verotoxigen. Acestea infecteaza animalele vii, pentru care au un grad diferit de patogenitate, de la portaj asimptomatic pana la boala, dar raman in produsele scestora destinate alimentatiei umane. Astfel, carnea de vita, laptele, carnea de pasare, ouale, etc., sunt cel mai adesea implicate in izbucniri TIA cu caracter familial sau colectiv.

    Ne-am propus imbunatatirea metodologiei de izolare, identificare si tipizare a microorganismelor patogene prezente in alimente sau izolate de la pacienti cu TIA. Metodele moleculare care se adreseaza acizilor nucleici se recomanda prin specificitate, selectivitate, rapiditate dar mai ales prin capacitatea lor de a detecta microorganisme aflate in stare latenta sau noncultivabile. De aceea ne-am propus utilizarea metodelor moleculare pentru identificarea speciilor implicate in TIA, pentru detectarea structurilor genetice care codifica pentru patogenitatea acestora precum si pentru genotiparea lor.

    In cadrul studiului efectuat au fost analizate 29 tulpini de Campylobacter, izolate din cazuri singulare de boala si 184 tulpini de Salmonella izolate din 38 focare TIA. Listeria nu a fost inclusa in studiul nostru care se refera la TIA determinata de bacili gram negativi, iar E. coli verotoxigen nu a fost izolat din cazuri de TIA pe perioada de derulare a proiectului.

    Reactia de PCR, tintind structuri genetice specie specifice, a fost utilizata pentru identificarea in produsul analizat a microorganismelor apartinand diferitelor serovaruri de Salmonella precum si pentru detectarea infectiei cu Campylobacter. Profilul de restrictie enzimatica a structurilor genetice care codifica pentru flagelina la Campylobacter, urmata de electroforeza in gel de agaroza a permis discriminarea intre tulpini izolate in diferite perioade de timp si diferite regiuni ale tarii. Macrorestrictia genomului total si separarea fragmentelor de ADN in camp pulsator a fost metoda de referinta utilizata pentru discriminarea tulpinilor de Salmonella.

    Parteneriatul realizat cu o unitate spitaliceasca implicata in primirea pacientilor suspecti de TIA, a unei unitati de invatamant superior implicata in formarea specialistilor in microbiologie si a unui institut de cercetare medicala in care fiinteaza un laborator de referinta pentru Epidemiologie Moleculara a oferit cadrul propice realizarii obiectivelor si activitatilor prevazute in scopul realizarii acestora.

     

    Activitatea de formare si diseminare a rezultatelor a reprezentat de asemenea o componenta importanta a activitatii desfasurate in aceasta etapa in cadrul proiectului.

    Printre participantii la proiect se numara trei tineri cercetatori care isi desfasoara activitatea de pregatire pentru sustinerea tezei de doctorat pe subiectul proiectului si un cercetator care utilizeaza metodele moleculare insusite si aplicate in cadrul proiectului pentru caracterizarea agentilor etiologici implicati intr-un alt tip de afectiune.

    Participarea, ca persoane de contact, la reuniunile anuale ale ECDC in cadrul programului de supraveghere a toxiinfectiilor alimentare si hidrice, la teste externe de calitate (EQA) organizate in cadrul programului pentru evaluarea proficientei laboratorului si in exercitii internationale menite sa imbunatateasca comunicarea intre participantii in retea, au drept scop realizarea unor obiective specifice, bine conturate in proiect:

    – Armonizarea metodelor de lucru cu cele la nivel european in conformitate cu recomandarile

    ECDC

    – Cresterea competitivitatii in cadrul grupului de lucru „food and water diseases” (FWD)

    organizat la nivelul ECDC.

    Rezultatele activitatii privind standardizarea unor metode moleculare utilizate pentru caracterizarea tulpinilor de Salmonella Typhimurium la nivel european au fost prezentate intr-un poster la Reuniunea Grupului International de Studiu al Markerilor Moleculari:

    „European Standardisation of MLVA for SalmonellaTyphimurium. Eva Møller Nielsen, Jonas T. Larsson, Mia Torpdahl and a European study group on MLVA for Salmonella Typhimurium:

    Gitte Sørensen; National Food Institute -DTU, Denmark….Maria Damian, Codruta-Romanita Usein; National Institute of Research-Development for Microbiology and Immunology, Romania…..

    Organizare de cursuri de perfectionare a medicilor rezidenti in domeniul microbiologiei moleculare

    a) Simpozionul „Rolul biologiei moleculare în diagnosticul de laborator al bolilor infecţioase” organizat de Institutul Naţional de Cercetare şi Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie Cantacuzino colaborare cu Novaintermed, 20-21 aprilie 2010 (Anexa 3).

    b) Curs “Toxiinfecţii alimentare – metode convenţionale şi rapide de diagnostic etiologic”, 2-4 iunie 2010, organizat de UMF “Carol Davila” Catedra de Microbiologie în colaborare cu INCDMI Cantacuzino, Bucureşti. Responsabili curs: Prof. Dr. Marian Neguţ, Dr. Maria Damian. Participanţi: Medici primari / specialişti / rezidenţi şi biologi din laboratoarele de microbiologie din cadrul DSP şi din spitale de boli infecţioase, medici epidemiologi din Bucureşti şi din ţară. Loc de desfăşurare: INCDMI Cantacuzino, Centrul de Învăţământ Jacques Monod. Cursul a fost aprobat de Colegiul Medicilor.

     

    Publicarea rezultatelor intr-o revista ISI si/sau indexata Medline

    Usein CR, Straut M, Palade AM, Tatu-Chitoiu D, Ciontea S, Baltoiu M, Dinu S, Damian M. A multiple typing approach is needed for the laboratory-based surveillance of salmonellosis in Romania. Romanian Archves of Microbiology and Immunology, 2010, nr. 3 (in press)

    Alexandra-Maria Năşcuţiu. Cronobacter (Enterobacter) sakazakii – bacterie emergentă, contaminant al formulelor de lapte pentru sugari. Medicina Modernă, 2010, XVII (1): 28-31.

    Alexandra-Maria Năşcuţiu. Bacterii viabile necultivabile. Bacteriologia Virusologia Parazitologia Epidemiologia, 2010, 55(1): 11-19.

    Alexandra-Maria Năşcuţiu. Toxiinfecţiile alimentare determinate de bacterii din genul Salmonella (I). Consideraţii asupra evoluţiei clinice şi asupra epidemiologiei salmonelozelor enterice. Medicina Modernă, 2010, XVII(11): 566-572.

    Alexandra-Maria Năşcuţiu. Toxiinfecţiile alimentare determinate de bacterii din genul Salmonella (II). Diagnosticul de laborator. Medicina Modernă, 2010, XVII(12) in press.

     

    Prezentarea rezultatelor in cadrul sesiunii anuale a Societatii Romane de Microbiologie (SRM)

    In perioada 14-16 octombrie, a avut loc la Sinaia A doua Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie. Rezultatele obtinute in cadrul proiectului au fost prezentate intr-un numar de prezentari orale si postere. Rezumatele au fost publicate in Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol, 2010, 55(3).

    Alexandra-Maria Năşcuţiu, Andi-Marian Palade, Codruţa-Romaniţa Usein, Mădălina Băltoiu, Dorina Tatu-Chiţoiu, Simona Ciontea, Andrei Popa, Silvia Iordache, Maria Damian. Investigarea prin PFGE a unui focar de toxiinfecţie alimentară determinat de S. enterica serovar Enteritidis. Poster (P33).

    Adriana Simona Ciontea, Andi Marian Palade, Codruta-Romnaita Usein, Dorina Tatu-Chitoiu, Daniela Cristea, Maria Damian. Tipizarea molecular a unor tulpini de Campylobacter coli provenite de la pacienti cu boala diareica

    Maria Condei, Codruta-Romanita Usein, Andi Marian Palade, Madalina Baltoiu, Sorin Dinu, Maria Damian, Monica Straut. Tipizarea molecular a tulpinilor de Salmonella Typhimurium prin MLVA: Eforturi de armonizare europeana.

    Madalina Baltoiu, Codruta-Romanita Usein, Andi Marian Palade, Simona Ciontea, Dorina Tatu-Chitoiu, Maria Condei, Maria Damian. Markeri molecular utilizati pentru detectarea tulpinilor de Salmonella enterica.

    Dorina Tatu-Chitoiu, Adriana Siona Ciontea, Daniela Cristea, Andrei Popa, Iordache Silvia. Supravegherea microbiologica a tulpinilor de Salmonella isolate din boala doareica in perioada 2007-2010.

    Codruta-Romanita Usein, Lavinia Zota. Tulpinile VTEC-un pericol emergent ce nu trebuie ignorant.

    Gabriela Oprisan, Sorin Dinu, Maria Nica, Carmen Michaela Cretu, Ana Persu, Anda Baicus, Maria Damian. Metode de detective si analiza epidemiologica molecular a Norovirusurilor.

     

    In perioada 16-19 iunie, in cadrul celei de-a V-a Conferinte a Asociatiei Romane de Medicina de Laborator s-a organizat un workshop pe tema „Toxiinfectii alimentare”. La workshop au participat medici, biologi si biochimisti care lucreaza in laboratoare clinice si de sanatate publica. Lucrarile prezentate au fost publicate in revista societatii, Revista Romana de Medicina de Laborator, 2010, 18, 2/4, supl., pg. 76-80, revista cotata ISI.

    G. Ionescu, Ionescu Maria Monica, A. Rafila. Quality control of culture media used in Bacteriological diagnosis of foodborne toxinfections.

    Nascutiu Alexandra-Maria. Bacterial foodborne infections.

    Negut M, Nascutiu Alexandra-Maria. Alternatives for bacteriological investigations of foodborne infections.

    Damian Maria, Usein Codruta-Romanita. Limits and perspectives in the diagnostic and molecular epidemiology of foodborne infections.

    Tatu-Chitoiu Dorina, Ciontea Simona Adriana, Popa Andrei. Salmonella serotypes circulating during 2005-2009.

    Proiect 61-021

    Acronim: TORULARHODIN

     

    Elaborarea biotehnologiilor avansate de preparare a produselor farmaceutice antioxidante cu torularhodină şi studiul potenţialelor aplicaţii terapeutice

     

    Director Proiect: Dr. Aurora Salageanu

     

    Parteneri :

    1. Universitatea POLITEHNICA Bucuresti-Departamentul de Bioinginerie si Biotehnologie
    2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica
    3. Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicinã Veterinara-Bucuresti


    Obiectivul proiectului este elaborarea unei biotehnologii inovative de laborator pentru obţinerea bioproduselor antioxidante cu torularhodină şi stabilirea soluţiilor de valorificare în terapie.

    • INCDMI “Cantacuzino” va elabora metodologia de caracterizare fizico-chimică şi biologică a proprietăţilor antioxidante ale preparatelor cu torularhodină, sistemul de testare a activităţii biologice, va participa la realizarea sistemelor de bioprocesare discontinuă şi fed-batch, va studia soluţiile potentiale de valorificare în terapie şi va asigura coordonarea cercetărilor în calitate de conducător de proiect.
    • UPB-Departamentul de Bioinginerie şi Biotehnologie va coordona în principal studiile tehnologice de bioprocesare, va participa la elaborarea metodologiei de control a calităţii pe ansamblul operaţiilor din fluxul productiv şi la selecţia şi optimizarea tehnicii de separare a bioproduşilor, va realiza sinteza modelului productiv, şi va elabora manualul de diseminare a rezultatelor, care va fi folosit în procesul educativ şi de formare profesională.
    • INCD Chimico-Farmceutice va realiza selecţia tulpinilor microbiene producătoare de torularhodină şi ameliorarea potenţialului productiv prin tehnici genetice, va elabora metodele de identificare şi determinare cantitativă a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi, va studia metodologia de management de calitate, va colabora la cercetarea bioprocesării şi la elaborarea metodologiei de separare a bioproduşilor.
    • USAMV Bucureşti-Facultatea de Biotehnologie va studia extracţia bioproduşilor cu fluide critice, va realiza sinteza modelului de separare a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi şi va participa la optimizarea formulei mediului de cultură.


    Etapa I (raportare 15 decembrie 2007): Studiul metodelor de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode analitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor

     

    În cadrul lucrărilor aferente acestei etape a fost realizat un studiu şi o analiză a datelor de literatură în urma cărora s-a ajuns la următoarele concluzii :

     

    • Cercetările au demonstrat că torularhodina şi pigmenţii carotenoizi asociaţi-torulena şi beta-carotenul sunt biosintetizaţi în special de drojdii din genurile Rhodotorula şi Sporobolomyces şi altele înrudite, drojdiile roz-roşii, care formează aceşti pigmenţi ca metaboliţi secundari cu rol de protecţie faţă de factori de mediu, în special lumina.
    • Aplicaţiile actuale de interes ale acestor pigmenţi s-au extins mult dincolo de rolul de coloranţi şi provitamina A, în special în cazul torularhodinei demonstrându-se reale proprietăţi ca antioxidant, ceea ce îi conferă o activitate biologică cu rol în terapia bolilor ce au la bază mecanisme de declanşare şi evoluţie legate de efectul distructiv al radicalilor liberi şi al speciilor oxigen active.
    • Analiza factorilor de mediu care influenţează biosinteza torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi a demonstrat că formarea acestor bioproduse depinde puternic de condiţiile de cultivare ale drojdiilor capabile de carotenogeneză: de temperatură, pH, prezenţa luminii, nivelul aeraţiei, prezenţa unor molecule cu rol în formarea speciilor oxigen active sau a radicalilor liberi, compoziţia mediului de cultură.
    • Descifrarea căilor metabolice de formare a permis studiul aprofundat al acestor factori de influenţă în conexiune cu metabolismul şi stabilirea unor metode de modificare genetică a tulpinilor productive pentru creşterea potenţialului de biosinteză a torularhodinei.
    • Pentru realizarea unei tehnologii de producţie de interes economic se recomandă folosirea unor surse ieftine de C, de obicei subproduse de la agricultură.
    • Au fost efectuate studii experimentale privind metodele de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode anlitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor. Rezultatele acestor studii au condus la acumularea de date importante referitoare la comportamentul microorganismelor testate în condiţiile prestabilite, date care vor contribui la selecţia finală a microrganismului cu care se vor efectua, în fazele următoare, studiile de biosinteză şi extracţie a pigmenţilor carotenoidici.

     

    Etapa II (raportare 15 decembrie 2008): Elaborarea biotehnologiei de formare torularhodină si pigmenti asociati în drojdiile din genurile Rhodotorula si Sporobolomyces


    In urma efectuarii lucrarilor de cercetare aferente fazei a II-a au fost obtinute urmatoarele rezultate:


    • In baza studiului de literatura, in lucrarile de mutageneza efectuate asupra tulpinii Rhodotorula rubra ICCF 209 (IC 120, IMF R7) a fost utilizat agentul mutagen alchilant N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), in doza de 2 mg/ml si timp total de actiune 30 minute si o ora. Dispersiile dilutiilor zecimale seriate in placi Petri au dus la selectionarea de pe mediul Bacto-Wortagar (BW) a unor colonii pigmentate in mov-negru, a caror carotenogeneza, cu etapa finala biosinteza torularhodinului, este favorizata de prezenta in mediu a glicerolului. Coloniile sunt foarte mici, intens colorate in mov-negru. Lucrarile de testare a stabilitatii genetice a acestui caracter au dus la selectia a 5 colonii prelevate de pe mediul BW care au fost trecute in conserv vegetativ pe acest mediu si pe mediul YM sucroza si au constituit tulpina Rhodotorula rubra ICCF 220.
    • A fost studiata influenta surselor de carbon: glucoza, sucroza, maltoza, glicerol, asupra formarii de biomasa continand pigmenti carotenoidici la tulpinile: Rhodotorula rubra ICCF 220,Rhodotorula sp. ICCF 396 si Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369. Cantitatea de biomasa variaza in functie de tulpina si sursa de carbon intre 5-12 g/l ca S.U,pe mediul cu sucroza obtinandu-se rezultate mai bune.
    • Studiul influentei unei temperaturi de 30-32oC asupra evolutiei bioprocesului la Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat lungirea duratei fazei logaritmice si valori mai mici pentru indicii de caracterizare a acestuia, respectiv DO si formarea de biomasa exprimata ca S.U.
    • A fost izolata tulpina Rhodotorula sp. ICCF 396 dintr-o tulpina de Rhizobium sp., care ocazional, pe mediile de cultura (BW, Extract de malt 4%) formeaza colonii intens colorate in rosuviolaceu. Cultivarea acesteia pe aceleasi medii si in aceleasi conditii ca si Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat similitudinea morfo-fiziologica cu tulpinile de Rhodotorula din colectie.
    • Rezultatele cele mai bune privind utilizarea sursei de carbon (Mediul nr. 3 cu sucroza) cu formare de biomasa, s-au obtinut cu tulpina Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369 izolata din tulpina Xanthophillomyces dendrorhous ICCF 338 (DSM 5626).
    • Continutul total în pigmenti carotenoidici este variabil, dependent de natura microorganismului, dar si de conditiile de cultivare, respectiv de natura sursei de carbon. Continutul în pigment cu absorbtia maximă la 490-500nm (posibil Torularhodin) în cazul cultivării Rhodotorula ICCF 220 pe mediul cu malt este cel mai ridicat.
    • Mediile de cultură utilizate au prezentat o influentă considerabilă asupra dezvoltarii biomasei celulare si biosintezei pigmentilor carotenoidici, în particular a torularhodinei.
    • Pentru tulpina parentala s-a determinat cea mai mare producŃie de torularhodină în mediul MS3 cu fructoză (626 μg/l mediu) urmată de zaharoză si glucoză, date comparabile cu cele din literatura de specialitate.
    • Bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură Sabouraud si comparativ pe acelasi mediu a tulpinii mutante Rhodotorula rubra ICCF 220 (două experimente).
    • S-a urmărit variatia în timp a densităŃii optice (măsură a dezvoltării celulare), a pH-ului si a variatiei concentratiei oxigenului dizolvat în timp. Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponential. Pentru tulpina mutantă s-au obtinut valori mai mari ale vitezei specifice de crestere fată de tulpina parentală, dar valorile nu diferă semnificativ.

    Etapa III (raportare 15 iulie 2009): Stabilirea procedeului de laborator de formare a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi


    Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

    –          Metoda de extracţie cea mai eficientă a pigmenţilor din celulele a două tulpini de drojdii aparţinând genului Rhodotorula este extracţia cu DMSO şi acetonă.

    –           Dintre metodele studiate în vederea realizării separării şi izolării torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi din extractele carotenoidice totale, metoda cromatografiei pe coloană la presiune normală a condus la obţinerea rezultatelor scontate în sensul că au fost separate fracţii  ale căror spectre de absorbţie în domeniul vizibil şi cromatograme realizate prin LC-MS au demonstrat prezenţa torularhodinei.

    –          Au fost stabilite condiţiile optime de operare care permit realizarea unei separări corespunzătoare a bioproduşilor prin  HPLC. 

    –          A fost testată şi aplicată metoda spectrofotometrică. Pe baza unei curbe etalon de ß-caroten au fost efectuate determinările cantitative necesare stabilirii conţinutului în carotenoide şi precum şi eficienţa diferitelor operaţii tehnologice.

    –          S-a realizat bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură MS3, în care s-a folosit zaharoza ca sursă de carbon atât datorită inducerii biosintezei torularhodinei ca metabolit secundar cu proprietăţi tinctoriale şi antioxidante, cât şi datorită preţului de cost scăzut.

    –          S-a realizat cultivarea într-un bioreactor de laborator tip Bioengeering cu capacitatea de 3, 7 L prevăzut cu aerare, agitare, termostatare şi înregistrare automată a unor parametrii de proces-turbiditate, pH, pO2 .

    –          Pe parcursul dezvoltării culturii au fost monitorizaţi următorii parametri: temperatură, pH, pO2 şi turbiditate, care au fost reprezentaţi grafic în funcţie de timpul de biosinteză. Nivelul scăzut al pO2 către sfârşitul fazei exponenţiale de creştere indică faptul că este necesară mărirea în continuare a parametrilor ce influenţează nivelul transferului interfazic al oxigenului, turaţia agitatorului mecanic şi debitul de aerare, pentru a realiza un exces de oxigen dizolvat şi neconsumat de cca 20% pe durata bioprocesului discontinuu.

    –          Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponenţial. Valorile obţinute pentru fiecare caz în parte sunt comparabile pentru cele doua obţinând experimente efectuate independent.

    –          După încheierea biosintezei, s-a realizat prelucrarea biomasei. Biomasa umedă a fost separată prin centrifugare şi s-a efectuat extracţia pigmenţilor carotenoidici totali în hexan precum şi a torularhodinei, singura componentă cu caracter acid în metanol bazic, trasându-se curbele de absorbţie în vizibil şi calculându-se totodată concentraţia acestor pigmenţi raportată atât la substanţa uscată cât şi la unitatea de volum de mediu.

    –          S-a determinat o concentraţie finală de beta-caroten cuprinsă între 600-700 μg/L mediu precum şi o concentraţie de torularhodină de 377 μg/L. Pe parcursul biosintezei în probele recoltate s-a determinat după primele 24 de ore de dezvoltare o preponderenţă a beta-carotenului, iar după 48 de ore de dezvoltare mai mult de 50 % din acest pigment se poate presupune că s-a transformat pe calea metabolică descrisă în literatură în torularhodină.

    Studiul diferitelor modele de extractie a cu fluide supercritice propuse pentru pigmenti din clasa carotenoizilor a condus la concluzia ca aceasta metoda poate poate fi folosita cu randamente acceptabile, in special in cazul utilizarii unor co-solventi organici.

     

    Etapa IV (raportare 15 noiembrie 2009): Studiul condiţiilor de separare şi caracterizare bioproduşi

     

    Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

    –          Studiile efectuate în vederea realizării dezintegrării /disrupţiei membranelor celulare i au constat în aplicarea tehnicilor: tehnica imersării în azot lichid (congelare) urmată de imersia în apă fierbinte (decongelare); tratare la cald cu soluţie salină peste tăria ionică fiziologică ( sol. NaCl 20%); tratare in sisteme agitate ( tip Vortex sau Dezintegrator) cu perle de zirconiu de diferite diametre (0,5-1 mm).

    –          Efectul tratamentelor aplicate asupra celulelor de biomasă a fost urmărit prin intermediul imaginilor captate la microscopul optic şi prin cantitatea de pigmenţi carotenoidici extrasă  în volume egale de solvent de extracţie.

    –          Tratamentul cu perle în aparate tip Vortex sau Dezintegrator apare ca un procedeu necesar, care favorizează extracţia pigmenţilor din celulele de drojdie. În absenţa oricărui procedeu de permeabilizare/dezintegrare a membranei celulare extracţia pigmenţilor nu se realizează, sau se realizează în condiţii dificile necesitând adaosuri de acizi sau baze care pot produce modificări ale structurii pigmenţilor extraşi.

    –          Au fost extinse studiile privind posibilitatea realizării separării pigmenţilor carotenoidici din extractele celulare prin metoda repartiţiei lichid-lichid.

    –          Urmărirea procesului de separare a pigmenţilor carotenoidici extraşi din culturile testate s-a realizat prin metodele analitice selectate şi anume : spectrofotometric, prin cromatografie în strat subţire şi HPLC.

    –          Prin aplicarea reapartiţiei între Metanol şi Hexan în condiţii de variaţie a valorii pH-ului s-au separat pigmenţii nepolari (sau cu polaritate scăzută) prin trecere în faza hexanică la pH alcalin, iar pigmentul cel mai polar , (în cazul nostru Torularhodinul) a fost trecut în faza hexanică abia după acidulare. Maximul de absorbţie al acestor faze s-a situat în intervalul de 495 – 499 nm atribuit Torularhodinului conform datelor de literatură.

    –          Prezenta pigmentului Torularhodinul a fost confirmata şi prin aplicarea metodei HPLC unde a fost evidenţiată prezenţa unui singur compus majoritar al cărui spectru pe pic este similar cu al Torularhodinului prezentat în literatura de specialitate cu un maxim la λ =495 nm .

    –          In vederea stabilirii metodei optimizate de testare a caracterului antioxidant al pigmentilor carotenoidici, au fost analizate metodele fluorimetrice pentru determinarea capacitatii antioxidante impotriva radicalilor peroxyl (ORAC – Oxygen Radicals Absorbance Capacity), peroxinitrit (NORAC – Nitric Oxide Radicals Absorbance Capacity), hydroxyl (HORAC – Hydroxyl Radical Absorbance Capacity) si superoxide (SORAC – Superoxide Radicals Absorbance Capacity). Metoda fluorimetrica ORAC se adreseaza atat antioxidantilor hidrosolubili (H-ORAC), cat si celor liposolubili (L-ORAC), capacitatea antioxidanta totala impotriva radicalilor peroxyl fiind suma valorilor obtinute pentru cele doua variante (ORAC total = H-ORAC + L-ORAC).

    –          Pentru realizarea obiectivului privind diseminarea rezultatelor preliminare au fost realizate :

    ×          un poster  prezentat la “16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering ” Sinaia, sept.9-12, 2009

    ×           o lucrare publicată în ” Proceedings of the 16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering “

    ×          un poster ce urmeză a fi prezentat la “2nd International Symposium on New Research in Biotechnology,” 19 – 20th November 2009, Bucharest, Romania.

     

    Proiect 42164

    Acronim:  MIRVI

    Investigatii moleculare ale infectiilor respiratorii acute determinate de virusuri non-gripale, cu evaluarea implicatiilor in patologia sugarului si copilului mic

     

    Proiectul are ca scop investigarea infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial – VRS, Meta Pneumo virusului uman – hMPV, Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si Coronavirusurile OC 43 si 229E) folosind tehnici de evaluare moleculara atat a agentilor etiologici cat si a reactiei organismului la acestia utilizand atat datele clinice cat si testele de laborator moleculare, atat pentru diagnostic etiologic cat si de analiza a mediatori solubili ai inflamatiei (citokinelor/chemokinelor serice).

    Se stie ca, daca pentru diagnosticul virozelor datorate VRS si adenovirusului exista si teste rapide comerciale de diagnostic iar pentru celelalte virusuri doar diagnosticul prin imunofluorescenta, aceste metode nu prezinta aceeasi sensibilitate si specificitate ca diagnosticul molecular prin RT-PCR (revers transcription polimerase chain reaction). In acelasi timp efectul acut al infectiilor respiratorii virale non-gripale asupra organismului, tradus prin secretia mediatorilor solubili ai inflamatiei a fost investigat pana acum intr-o masura relativ restransa. Drept urmare, obiectivele principale ale studiului sunt: evaluarea acestor infectii utilizand tehnici moderne atat de detectie a patogenului (RT-PCR/real time RT-PCR) cat si de analiza a raspunsului organismului prin profilul mediatorilor solubili ai inflamatiei (Tehnologia Multiplex – xMAP, aplicata pe platforma LUMINEX 100IS); stabilirea relevantei clinice a profilului molecular; estimarea implicatiilor asupra strategiei de diagnostic, management si control al infectiilor respiratorii la copii.

    Rezultatele estimate ale proiectului sunt: punerea la punct si optimizarea unui pachet de tehnici moleculare de diagnostic, imbunatatind metodologia diagnosticarii infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial_VRS, MetaPneumo virusului_hMPV,Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si CoronaVirusurile OC 43 si 229E); obtinerea unui tablou al pattern-urilor de secretie de mediatori solubili ai inflamatiei (realizabil doar folosind tehnologia Multiplex), in corelatie cu incarcarea virala, profilul clinic etc.; incidenta acestor viroze in patologia respiratorie a sugarului si copilului mic care se adreseaza clinicilor pediatrice din proiect; identificarea de  parametri semnificativi in evaluarea impactului celorlalte rezultate.     

    Prin tematica abordata, proiectul se incadreaza in directia de cercetare 4. Sanatate, tematica de cercetare 4.1.3 Metode de investigaţie şi intervenţionale bazate pe medicina moleculară şi celulară, genomică şi proteomică din Planul National de Cercetare Dezvoltare si Inovare II, Programul Parteneriate, deoarece:

    • 1. Virozele respiratorii altele decat gripa reprezinta o problema majora de sanatate publica la sugar si copilul mic cu un important impact socio-economic.
    • 2. Studiul propus implica folosirea unor metode si tehnici specifice medicinei moleculare
    • 3. Rezultatele estimate ale cercetarii vor putea fi folosite in conturarea unei noi abordari in investigarea si evaluarea eficientei strategiilor de management si control ale virozelor respiratorii non-gripale la sugar si copilul mic.
    • 4. Gradul inalt de complexitate si interdisciplinaritate al activitatilor propuse impun constituirea unui parteneriat format din specialisti de cea mai inalta competenta din domenii complementare ale cercetarii si practicii medicale (pediatrii, medici de laborator – virusologi, imunologi, specialisti in medicina moleculara)

          Impactul proiectului este major in aria de cercetare medicala atit nationala cit si internationala domeniul abordat reprezentand o prioritate tematica la nivel national, deoarece pana acum nu s-au realizat studii sistematice in tara noastra in acest domeniu. Proiectul va fi realizat prin colaborarea a trei institutii de cercetare medicala din Romania:

    1. Promotorul Proiectului: Institutul National de Cercetare Dezvoltare in Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino” (IC), cu experienta in cercetare fundamentala si aplicata in domeniul microbiologiei, imunologiei, virusologiei si medicinii moleculare
    2. Spitalul de Pediatrie Grigore Alexandrescu-Bucuresti

    Universitatea de Medicina si Farmacie Carol Davila (Clinica Pediatrie IOMC Alfred Russescu, Bucuresti

     

    Obiectiv specific faza I Punerea la punct şi optimizarea unor metode de diagnostic molecular în afecţiunile virale respiratorii non-gripale precum şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei, utilizând tehnologia multiplex xMAPâ -Luminex. Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale: analiza datelor din literatură privind tehnicile de diagnostic molecular (RT-PCR şi real time RT-PCR) al infecţiilor respiratorii non-gripale, elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie, de formare a loturilor de pacienţi diagnosticaţi cu infecţii respiratorii virale, elaborarea metodologiei de recoltare a probelor biologice, evaluarea virusologică a tulpinilor de virusuri non-gripale detectate prin secvenţierea lor şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei.

     

    Rezumat faza I Infecţiile respiratorii în general constituie o grupă patologică cu mare impact în motbiditate şi mai ales cu potenţial serios de producere de epidemii cu viteză mare de extindere şi gravitate semnificativă. In cadrul patologiei sugarilor şi copiilor mici, infecţiile respiratorii constituie o problemă majoră at]at prin numărul cazurilor cât şi prin dificultatea aplicării metodelor de prevenţie. Aproximativ 70% din infecţiile respiratorii acute ale copilului sunt determinate de virusuri, majoritatea dintre ele fiind non-gripale. Din punct de vedere etiologic, există teste rapide comerciale numai pentru infecţiile virale respiratorii datorate VRS şi ADV, iar în general pentru virusurile respiratorii non-gripale se utilizează teste de imunofluorescenţă dar care nu au o sensibilitate (aproximativ 90%) şi specificitate (aproximativ 84%) foarte bune. Astfel, se impune în diagnosticarea infecţiilor virale respiratorii, altele decât gripa. Un diagnostic performant şi rapid în baterie, pentru majoritatea acestor virusuri care sunt importante în patologie, fiind un domeniu în care se descoperă atât noi patogeni (cum este de exemplu Metapneumovirusul uman (hMPV)) cât şi noi aspecte ale infecţiilor virale respiratorii, cum a fost epidemia SARS (severe acute respiratory syndrome) dată de un coronavirus.

    In Romania, diagnosticarea etiologică a acestor infecţii a fost iniţiată de INCDMI Cantacuzino, iar acest demers trebuie continua şi dezvoltat. Un alt aspect mai putin investigat până acum sau în curs de investigare este reacţia acută a organismului faţă de aceste infecţii, exprimată în tabloul mediatorilor solubili ai inflamaţiei. Astfel se vor analiza aceste infecţii respiratorii non-gripale (datorate VRS, Metapneumovirusul uman (hMPV), virusurilor Paragripale 1,2,3 şi Coronavirusurile OC43 şi 229E) folosind tehnici de evaluare moleculară moderne atât a agenţilor etiologoci cât şi a reacţiei organismului la aceştia utilizând atât datele clinice cât şi testele de laborator moleculare, atât pentru diagnostic etiologic, cât şi de analiza mediatorilor solubili ai inflamaţiei (citokinelor/chemokinelor serice).

    Rezultatele studiului vor fi utilizate pentru estimarea implicaţiilor asupra strategiei de diagnostic, management şi control al infecţiilor respiratorii la copii.

    Virusurile sunt implicate în majoritatea infecţiilor respiratorii la sugari şi copii mici. Datorită incidenţei mari ale bronşiolitelor la copiii mici cauzate de VRS (40-45%) şi a hMPV (7-12%), apare necesitatea punerii unui diagnostic cât mai specific şi mai sensibil ale unor astfel de afecţiuni cât şi evaluarea mecanismelor patologice implicate la nivel molecular. Pentru un diagnostic cât mai bun şi eficient în aceste afecţiuni, se impune implementarea metodelor de diagnostic molecular (RT-PCR) standard şi/sau multiplex şi/sau real-time. Menţionăm drept exemplu faptul că la această oră pentru diagnosticul afecţiunilor cauzate de hMPV există numai această tehnică moleculară pe care INCDMI Cantacuzino a introdus-o în cadrul laboratorului său de Infecţii Respiratorii Virale, pentru prelucrarea probelor de la sugari şi copii mici. Pentru reducerea costului reacţiilor se poate testa şi introduce reacţia de amplificare moleculară pentru mai multe virusuri deodată (PCR Multiplex) de exemplu pentru virusurile paragripale se poate realiza RT-PCR Multiplex pentru cele 3 tulpini (1,2,3) într-o singură reacţie.

    Patogeneza infecţiilor respiratorii cu etiologie virală nu este pe deplin clarificată până în prezent, dar există un consens în ceea ce priveşte implicarea răspunsului imun al organismului gazdă în mecanismele producerii bolii. În privinţa evaluării mediatorilor solubili ai inflamaţiei, este cunoscut faptul că profilul secreţiei lor influenţează atât profilul clinic, cât şi evoluţia ulterioară a pacienţilor, fiind factori posibili de inducere şi/sau prognosticare a evoluţiei spre hipersensibilitate şi inflamaţie cronică de tipul celei prezente în astmul bronşic.

    Studierea în detaliu a mecanismelor patogenice implicate în SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome, cauzat de un coronavirus înrudit cu Coronavirusurile OC43 şi 229E, numit SARS-CoV) a dus la conturarea unei paradigme conform căreia infecţia virală induce un răspuns imun exagerat, manifestat în principal prin niveluri sistemice extrem de crescute ale mediatorilor solubili ai inflamaţiei (“furtună de citokine”), responsabile de distrugerea alveolară difuză caracteristică acestui sindrom. Ulterior, paradigma a fost extinsă şi pentru cazurile de infecţii respiratorii gripale cu tulpina H5N1, fiind aplicată generic tuturor infecţiilor respiratorii cu etiologie virală care au evoluţie gravă. Totuşi, aceasta pare a fi o abordare prea simplistă a problemei, care nu reflectă realitatea. Studii ulterioare au arătat că în cazul SARS evoluţia nefavorabilă este asociată cu valori sistemice crescute ale unor chemokine (CXCL9: MIG, monokine induced by γ -interferon; CXCL10: IP-10, interferon inducible protein-10; CCL2: MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1) dar fără creşterea valorilor citokinelor pro-inflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-α); IFN-α, IFN-γ şi IL-12 au valori scăzute; există un anumit grad de limfopenie şi în cazul unora dintre pacienţi apar autoanticorpi (IgM şi împotriva unor antigene citoplasmatice pneumocitare) (1). În cazul infecţiei cu H5N1 (1997) cazurile care au evoluat spre exitus au fost asociate cu valori serice excesive ale IL-6, IL-2R şi IFN-γ precum şi cu depleţie limfocitară. Se impune astfel nuanţarea paradigmei enunţate mai sus, putându-se descrie pattern-uri de mediatori solubili caracteristice fiecărei etiologii.

    Astfel, în cazul VRS (virusul respirator sinciţial) se constată atât niveluri sistemice crescute ale citokinelor pro-inflamatorii (IL-6, TNF-α şi IL-8) dar şi anti-inflamatorii (IL-10) care participă la efectele patogenice ale infecţiei (însoţite de secreţie scăzută de IFN tip I). Se asociază şi un pattern particular de chemokine, incluzând IL-8/CXCL8, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MIP-2, IP-10, eotaxin-1/CCL11, MCP-1 şi RANTES/CCL5. VRS este capabil să infecteze celulele dendritice (DC, atât mieloide cât şi plasmacitoide); DC infectate sunt capabile de maturare (exprimă la nivel membranar CD80, CD86 şi MHC-II) dar nu mai pot realiza eficient “priming”-ul limfocitelor T antigen-specifice (DC infectate sunt incapabile de a secreta citokine de tip Th-1, cum ar fi IFN-α şi IL-12p70 necesare pentru promovarea funcţiei efectorii a limfocitelor T CD8+; în schimb induc polarizare Th-2, cu secreţie de IL-4 şi IL-5 de către limfocitele T CD4+). Aceste fenomene au cel puţin două consecinţe patogenice: lipsa unei memorii imunologice eficiente post-infecţie (asociată cu reinfecţii frecvente) şi favorizarea hiperactivităţii inflamatorii a mucoasei tractului respirator (astm bronşic). Răspunsul de tip Th-2 a fost obţinut şi în urma încercărilor de a se obţine un vaccin (VRS inactivat prin tratare cu formalină a indus în modele experimentale la o memorie imunologică polarizată Th-2, responsabilă de reacţie inflamatorie cu eozinofile şi distrugere pulmonară extensivă prin complexe imune şi complement la a doua expunere la VRS) (2).

    Deşi înrudit cu VRS, metapneumovirusul uman (hMPV) prezintă un mecanism diferit de evitare a răspunsului imun antiviral. Acest virus poate infecta DC (atât mieloide cât şi plasmacitoide) dar fără a induce maturare; celulele infectate produc doar IL-6 şi TNF-α (în concentraţii mult mai mici decât VRS) în schimb induc secreţie semnificativă de IFN-α (deşi în modele experimentale in vitro hMPV, similar cu VRS, a putut bloca în mod eficient secreţia de IFN-α indusă prin agonişti sintetici: poly-IC sau CpG) (3). În plus,m modele experimentale pe animale de laborator indică un pattern de chemokine diferit în cazul hMPV faţă de VRS: valori crescute ale GM-CSF şi KC (chemoatractant al neutrofilelor) (4).

    Astfel de pattern-uri de mediatori solubili au fost definite pentru toţi agenţii etiologici ai infecţiilor respiratorii luaţi în discuţie în proiectul de faţă, dar rezultatele sunt neconcludente (şi chiar uneori contradictorii, în special în cazul modelelor experimentale, rezultatele variind mult în funcţie de specia de animal de laborator pentru experimentele in vivo sau tipul liniei celulare pentru cele in vitro). Se impune astfel continuarea acestor tipuri de studii prin analiza mediatorilor solubili ai răspunsului imun la pacienţii cu infecţii respiratorii, atât în faza acută a bolii cât şi în perioada de convalescenţă.

     

    Concluzii faza I

    A fost atins obiectivul acestei faze a proiectului: elaborarea modelului teoretic de studiu pentru evaluarea virozelor respiratorii non-gripale.

    Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale:

    • – Analiza datelor din literatură privind tehnicile moleculare de diagnostic ale infecţiilor respiratorii virale non-gripale;
    • – Elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie a loturilor de pacienţi;
    • o Elaborarea metodologiei de: – evaluare clinică a pacienţilor, recoltare probe biologice;

    evaluarea diagnosticului de infecţii respiratorii cauzate de virusuri non-gripale prin tehnici moderne moleculare

    Proiect 42-116

    Acronim : CarMen

    Managementul meningitelor bacteriene acute: Strategii moderne de investigatie si interventionale

    Dirctor proiect: Dr. Vasilica Ungureanu

    Parteneri:

    Institutul National de Boli Infectioase “Prof. Dr. M. Bals”

    Spitalul Clinic de Boli Infectioase “Dr. V. Babes”

     

    Meningita bacteriana acuta (MBA) – o infectie invaziva a SNC, caracterizata prin inflamatia meningelui, este o cauza majora de morbiditate si mortalitate, putand produce sechele permanente (epilepsie, retardare mentala sau surzenie etc.). Acesta patologie reprezinta o serioasa problema de sanatate publica la nivel mondial. In ciuda disponibilitatii celor mai noi si potente antibiotice cat si atentiei acordate diagnosticului si profilaxiei prin antibioterapie si/sau vaccinare, rata mortalitatii ramane in continuare foarte inalta, in special in tarile in curs de dezvoltare (15 – 40%). Meningita este o urgenta medicala ce justifica necesitatea diagnosticului rapid si instituirea unei terapii agresive. Medici infectionisti si cercetatori din intreaga lume reclama nevoia supravegherii permanente a meningitei bacteriane acute, stiind ca agentii patogeni responsabili pentru infectii ale SNC variaza cu timpul si aria geografica, precum si cu varsta si functionalitatea mecanismelor de aparare a organismului.

     

    Scopul proiectului este reprezentat de elaborarea unui algoritm modern de diagnostic si tratament al meningitelor bacteriene acute in concordanta cu noile descoperiri si directii de cercetare in domeniu. Acesta va permite identificarea rapida a agentilor etiologici specifici, orientarea diagnosticului si tratamentului, prin completarea metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare, capabile sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice alternative.

     

    Principalele obiective ale proiectului sunt:

    •  Studiul aspectelor de etiologie bacteriana a meningitei prin metode conventionale si moleculare
    • Punerea la punct a unui algoritm de diagnostic bacteriologic si molecular “cost-eficient” al meningitelor cauzate de cei mai frecventi agenti patogeni
    • Studiul aspectelor de sensibilitate/rezistenta la antibiotice si realizarea antibiotipurilor de rezistenta
    • Caracterizarea prin metode moleculare a principalilor agenti etiologici de natura bacteriana, dar si virala pentru realizarea diagnosticului diferential
    • Studiul implicarii mediatorilor solubili ai inflamatiei (citokine, chemokine etc.) in patogenie pentru diagnosticul diferential cu alte meningite (virale, aseptice) din stadiile incipiente ale bolii
    • Studierea interactiei complexe agenti patogeni-sistem imun in relatie cu particularitatile localizarii meningeale, in vederea elucidarii mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicatiilor neurologice consecutive

     

    Rezultatele estimate ale proiectului:

    • – Definirea unui cadru epidemiologic adaptat la situatia actuala din Romania
    • – Optimizarea algoritmului de diagnostic microbiologic si diferential al meningitelor
    • – Actualizarea si reconsiderarea schemelor terapeutice
    • – Evidentierea implicarii unor componente ale imunitatii in mecanismele patogenice ce contribuie la severitatea bolii si la aparitia complicatiilor ulterioare
    • – Conturarea unor noi strategii de prevenire si control a bolii

     

    Etapa I (raportare 15 februarie 2009): Model conceptual de studiu al etapelor critice ale diagnosticului MBA

     

    In aceasta etapa a fost realizat un studiu al datelor din literatura de specialitate pentru a identifica stadiul actual al cunoasterii diagnosticului MBA pe plan international, precum si aspectele critice ale supravegherii si diagnosticului MBA in Romania. Aceasta va permite elaborarea unui algoritm de diagnostic si tratament al meningitelor bacteriene acute, putand realiza astfel identificarea rapida a agentilor etiologici si orientarea diagnosticului si tratamentului, prin completarea metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare, capabile sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice alternative.

    De asemenea, a fost elaborata documentatia referitoare la particularitatile clinice si epidemiologice ale MBA determinate de cei mai frecventi agenti bacterieni si s-au definit criteriile de selectie a pacientilor in studiu, precum si fisa de urmarire clinica a pacientilor.

    Criteriile de selectie a pacientilor in studiu:

    1.  Criterii clinice

    Meningita bacteriana poate fi dificil de diagnosticat dupa semne si simptome, acestea fiind adesesa nespecifice (11).

    Simptomele pot include : febra, cefalee, inapetenta, greturi, varsaturi, letargie, iritabilitate, fotofobie, alterarea starii de constienta.

    Semnele clinice cele mai frecvente la copii sunt : febra, varsaturi, bombarea fontanelelei,  somnolenta, refuzul suptului, apnee, convulsii si rash purpuric. La copiii mai mari semnele clasice –  redoarea cefei, cefalea si fotofobia – sunt cele mai comune, iar semnele Kernig, Brudzinski, sunt adesea absente.

    2. Criterii epidemiologice:

    –    Contact cu alte cazuri cunoscute

    –    Provenienta din colectivitate (casa copii, camin,, cresa, armata, etc)

    –    Calatorie recenta in zone endemice (Africa, Asia, etc)

    –    Contact cu animale (profesional, animale de casa)

    3.  Criterii de laborator

    3.1. Criterii orientative:

    Modificarile macroscopice, citologice si biochimice ale LCR sugestive pentru o meningita bacteriana sunt:

    • – LCR tulbure (zeama de varza) sau opalescent
    • – LCR hipertensiv
    • – Reactia Pandy pozitiva
    • – Pleiocitoza (peste 100 celule nucleate / mmc LCR) cu predominenta PMN
    • – Hiperalbuminorahie (peste 100 mg /dl LCR)
    • – Hipoglicorahie (sub 40 mg / dl LCR)

    3.2. Criterii de confirmare:

    Etiologia bacteriana a unei meningite acute bacteriane poate fi confirmata prin 3 metode:

    –    Identificarea pe frotiul colorat Gram a unei bacterii gram-pozitive sau negative.

    –   Identificarea unor antigene bacteriene solubile  din LCR sau sange prin: latex-aglutinare,                            imunoelectroforeza

    –    Izolarea in culturi a unei bacterii din LCR sau sange (hemocultura)

    4. Criterii de excludere :

    Pacienti ce nu consimt sa participe la studiu

    Epidemie de meningita virala

    –    Semne sugestive de meningita tuberculoasa:    –    Debut insiduos

    –    Sindrom de impregnare bacilara

    –   Infectie TBC cunoscuta (pulmonar

    sau alta localizare

    –    Infectie HIV (?)

    Pentru a facilita comunicarea intre parteneri si a asigura un bun acces la rezultatele obtinute in cadrul proiectului a fost elaborata o baza de date cu acces extern restrictionat (username si parola). Fiecare partener este automat directionat catre partea ce ii revine din baza de date, pe baza username-ului propriu. Coordonatorul proiectului va avea acces la toata baza de date.

    Intrucat metodele si tehnicile moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare vor fi puse la punct si aplicate pentru prima data in tara noastra, s-a impus elaborarea metodologiei de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in LCR si ser si a metodologiei moderne de diagnostic – adaptate pentru probele biologice utilizate.

     


     

    Etapa II (raportare 01.12.2009): Studiul si analiza comparativa a metodelor moderne si conventionale de diagnostic MBA.

    Activitatile specifice si rezultatele estimate ale acestei etape sunt:

    1. Metodologie de diagnostic microbiologic  prin metode conventionale si de  testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice (optimizare metode)
    2. Metodologie de diagnostic diferential prin metode conventionale (optimizare metode)
    3. Metodologie de diagnostic si caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de derminare a markerilor genetici ai rezistentei bacteriene (optimizare metode)
    4. Metodologie de realizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in LCR/ ser

     

    Rezumatul etapei II

     

    1. In aceasta etapa sunt descrise etapele importante ale diagnosticului bacteriologic prin metodele conventionale optimizate, experimentate la nivelul laboratoarelor partenerilor: recoltarea prelevatelor biologice (LCR, hemocultura, exsudate faringiene si nazale etc), procesarea acestora, urmata de identificarea prin metode rapide de diagnostic (ex. Latex – aglutinare, microscopie) si identificarea prezumtiva a agentului cauzal. Inocularea prelevatelor biologice pe medii de cultura este urmata de identificarea definitiva a agentului etiologic al MBA. Ultima etapa a diagnosticului bacteriologic il constituie testarea susceptibilitatii la antibiotice (TSA), ceea ce ajuta la determinarea antibiotipurilor de rezistenta, necesara pentru instituirea tratamentului “empiric” pana la obtinerea rezultatelor de laborator, prezentand astfel importanta pentru adoptarea atitudinii terapeutice si/sau a politicii de utilizare a antibioticelor la nivel local, regional si/sau national pe baza datelor obtinute.

    2. In continuare sunt etalate metodele conventionale de diagnostic diferential. Diagnosticul diferential intre meningita bacteriana si meningitele de alte etiologii este inca foarte dificil de facut, semnele si simptomele fiind adesea nespecifice. Analiza LCR, coloratia Gram si cultura raman inca cele mai utilizate metode de diagnostic al meningitei, dar la pacientii ale caror rezultate, privind coloratia Gram si cultura, sunt negative, se folosesc alte teste pentru a diferentia meningita bacteriana de celelalte meningite (nivelul proteinelor, lactatului si glucozei, ca si numarul leucocitelor in LCR ; CRP, procalcitoninele si glucoza in ser). Parametrii cei mai importanti pentru diagnosticul diferential al meningitelor sunt sintetizati in Tabelul 2.

    3. Unul dintre obiectivele specifice ale fazei de executie a fost elaborarea metodologiei de diagnostic si caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de derminare a markerilor genetici ai rezistentei bacteriene.Metodele de laborator convenţionale, bazate pe cultivarea şi identificarea agentului etiologic prezent în produsul patologic, pot necesita cîteva zile pentru obţinerea unui rezultat cert. In plus, instituirea precoce a tratatmentului cu antibiotice, înaintea recoltării probelor biologice, a diminuat mult numărul cazurilor clinice de meningită confirmate prin metode de laborator tradiţionale. Acest impas poate fi depăşit prin identificarea microorganismului direct în produsul patologic, utilizând în principal tehnica PCR. In această etapă, ne-am propus adaptarea la condiţiile noastre de lucru a unei reacţii PCR multiplex care permite detectarea simultană a celor trei microorganisme care cauzează majoritatea meningitelor bacteriene: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae si Haemophilus influenzae. Această metodă ţinteşte trei gene specifice speciilor menţionate :ctrA – codifică o proteină de membrană implicată în transportul capsulei la N. Meningitidis ; ply – codifică pneumolizina la S. pneumoniae ; bexA – codifică o proteină implicată în exportul capsulei polizaharidice la H. Influenzae.

    Studiile efectuate pe probe biologice în diferite laboratoare, au evidenţiat sporirea numărului de rezultate pozitive înregistrate în diagnosticul etiologic al meningitelor acute bacteriene obţinute prin utilizarea unei reacţii PCR multiplex şi sunt unanim de acord asupra utilităţii includerii unor reacţii de acest tip în diagnosticul molecular de rutină.

    Identificarea serogrupului / serotipului reprezintă primul pas în caracterizarea tulpinilor de meningococ şi cel mai important pentru managementul prompt al contacţilor. Pentru acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de amplificare a acizilor nucleici, pentru identificarea serogrupului la nivel molecular (genogrup), care sunt sau trebuie să devină o parte importantă a funcţiei laboratorului de referinţă.

    In ceeea ce priveste determinarea moleculară a sensibilităţii la agenţi antimicrobieni în absenţa unor culturi bacteriene, s-a experimentat detectarea mutaţiilor în secventa genelor implicate în rezistenţa principalilor agenti cauzali ai MBA la substanţe antimicrobiene  prin amplificare PCR urmată de secvenţiere.

    4. Un alt obiectiv specific al fazei de executie II a fost elaborarea metodologiei de realizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice (LCR si ser) recoltate de la pacienti cu meningita acuta. Etapele importante in cadrul acestui model experimental au fost definite, dupa cum urmeaza: selectarea pacientilor si recoltarea probelor biologice; selectarea parametrilor imunologici de determinat; alegerea metodei de determinare si optimizarea protocolului de lucru. Determinarea unor astfel de pattern-uri specifice de mediatori solubili ai inflamatiei atat la nivel sistemic (ser) cat si local (LCR) in relatie cu etiologia si evolutia meningitelor infectioase ar putea constitui o modalitate moderna de diagnostic. In ceea ce priveste metoda de testare, variantele cele mai potrivite au fost considerate metodele ELISA si xMAP (asa cum reiese si din evaluarea metodologiei de lucru din etapa anterioara de raportare), ambele avand la baza reactia specifica antigen-anticorp. Desi ELISA este o metoda robusta, cu sensibilitate si specificitate crescuta,  are ca dezavantaj major posibilitatea determinarii unui singur parametru in mediul de reactie, necesitand efectuarea de determinari separate pentru fiecare parametru in parte. Acest fapt a dus la optiunea utilizarii tehnologiei xMAP (care permite determinari multiple de parametri simultan in aceeasi proba) deoarece in etapa de optimizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice a fost necesara determinarea unui panel larg de parametri (citokine, chemokine, factori de crestere) pe un numar redus de probe biologice.

    Tehnologia xMAP folosita de platforma Luminex permite o determinare multiparametrica bazandu-se pe un ansamblu (array) de microsfere in suspensie capabil sa detecteze simultan pana la 100 de parametri intr-o singura proba (necesarul fiind de maximum 100 µL de proba biologica, in mod obisnuit 25 – 50 µL). Aceasta tehnologie ofera o solutie eficienta de investigare a sistemelor complexe de mediatori (cum ar fi citokinele secretate la nivel sistemic in cursul inflamatiei, reteaua de hormoni etc.), avand o serie de avantaje cum ar fi rapiditatea achizitiei datelor, specificitate si sensibilitate excelenta, protocol mai putin laborios (decat metode de referinta cum ar fi ELISA), cost redus per parametru, cinetica de reactie mai rapida, flexibilitate in alegerea parametrilor. De asemenea datorita analizei statistice a evenimentelor individuale (prin soft-ul dedicat, Star Station 2.3), rezultatele obtinute sunt net superioare.

     

    Etapa III (raportare 01.12.2010): Dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de diagnostic.

    Activitatile specifice si rezultatele estimate ale acestei etape sunt:

    • Studiu comparativ al celor doua tipuri de metode, conventionale si moleculare, in raport cu indicatorii de fiabilitate (sensibilitate, specificitate, cost)
    • Selectarea, diagnosticarea si monitorizarea pacientilor si fezabilitatea algoritmului de diagnostic
    • Set de parametri definitorii ai algoritmului de diagnostic si concluzii privind functionalitatea algoritmului de diagnostic
    • Completarea algoritmului cu parametri imunologici
    • Solutii de caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare
    • Diseminarea rezultatelor partiale obtinute in aceasta etapa.

     

    Rezumatul etapei III

     

    Dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de diagnostic a consitituit obiectivul specific al etapei a III-a, realizandu-se in acest scop analiza comparativa a metodologiei de diagnostic microbiologic prin metode moderne moleculare in raport cu cele conventionale, stabilirea parametrilor definitorii ai algoritmului de diagnostic.si analiza functionalitatii acestui algoritm pe cazuri de MBA inregistrate in studiu. De asemenea, s-a experimentat  modelul de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in prelevatele de LCR si ser sanguin, recoltate de la pacientii cu MBA inscrisi in proiect, acestia avand un rol deosebit de important in patogenia meningitelor, dar si a complicatiilor acestora. Caracterizarea unor tulpini bacteriene prin metode moleculare, complementare metodelor  fenotipice,  a constituit o alta activitate in cadrul acestei etape. Diseminarea rezultatelor partiale ale proiectului au fost , de asemenea, in atentia activitatilor noastre.

    Sunt descrise comparativ cele doua tipuri de metode, conventionale si moleculare, in raport cu indicatorii de fiabilitate. Astfel, suspiciunea clinica de meningita bacteriana este confirmata pe baza detectarii / izolarii agentilor bacterieni cauzali ai meningitei prin examenul microscopic si prin cultura din LCR, insa sensibilitatea  acestor teste este mai mica de 50% la pacientii care au fost deja tratati cu antibiotice. Exista unele teste de detectare rapida a antigenului bacterian (polizaharidul capsular) in LCR (latex-aglutinarea-LA, imunoelectroforeza), dar acestea au o specificitate si sensibilitate scazuta (50 – 80%). Istoric, agentii patogeni cauzali ai meningitei bacteriene au fost caracterizati prin metode conventionale fenotipice: cultura, caractere morfologice si morfotinctoriale, caractere biochimice, caractere antigenice (serogrupare, serotipare, subtipare) si susceptibilitatea la antibiotice.

    In contrast cu metoda de cultivare a specimenelor clinice, care necesita ca bacteria sa fie in viata, si LA care nu poate detecta agentii bacterieni necapsulati, s-au dezvoltat tehnici moleculare, precum polymerase chain reaction (PCR), care ofera avantajul de a putea detecta rapid ADN-ul celulei bacteriene moarte, iar pe de alta parte caracterizarea tulpinilor bacteriene, in special in cazul tulpinilor necapsulate. Pentru diagnosticul meningitei bacteriene a fost pusa la punct tehnica PCR multiplex pentru detectarea simultana a mai multor germeni, in speta N.. meningitidis, H. influenzae si S. pneumoniae. Metodele moleculare sunt utilizate tot mai mult, in defavoarea metodelor fenotipice, pentru caracterizarea tulpinilor bacteriene, esentiale pentru supravegherea epidemiologica a bolilor infectioase,  ceea ce constituie o baza solida pentru stabilirea masurilor eficiente de prevenire,  modalitatea cea mai eficienta ramanand vaccinarea. In etapa anterioara au fost optimizate doua reactii PCR multiplex : (i) o reactie care tinteste gene specifice celor trei agenti etiologici majori ai meningitei bacteriene, N. meningitidis, S. pneumonie si H. Influenzae; (ii) a doua reactie permite caracterizarea / identificarea si determinarea prin PCR a 5 serogrupuri (genogrupuri) de N. meningitidis izolate din meningitele meningococice.

    In etapa prezenta s-au urmarit doua aspecte privind reactia PCR: (i) aprecierea sensibilitatii / limitei de detectie a reactiei PCR multiplex care tinteste identificarea agentului etiologic. Limitele de detectie (exprimate in cantitate de ADN) obtinute pentru fiecare specie, dupa cateva experimente, au fost: < 1 pg/ reactie , respectiv mai putin de 415 microorganisme pentru N. meningitidis (Fig. 1); < 0,9 pg/reactie, respectiv mai putin de 457 microorganisme pentru H. influenzae si < 2,6 pg/reactie, respectiv mai putin de 1130 microorganisme pentru S. pneumoniae. Rezultatele obtinute de noi, similare cu alte studii (Tzanakaki si colab), ne indreptatesc sa evidentiem sensibilitatea  buna a reactiei PCR multiplex pentru detectia agentilor bacterieni cauzali ai meningitei acute.  Al doilea aspect studiat a fost (ii) evaluarea reactiei PCR ca metoda de detectie direct din prelevatele clinice (LCR), care s-a realizat prin testarea direct din prelevate clinice de la pacienti suspecti de meningita bacteriana. Rezultatele obtinute prin PCR au fost in concordante cu alte teste fenotipice aplicate la nivelul laboratorului pentru identificarea agentului etiologic (Tabel 1).

    Desi costul unei investigatii moleculare poate fi ridicat, in comparatie cu metodele conventionale, prin instituirea rapida a terapiei specifice, ca urmare a unui diagnostic etiologic si patogenic rapid, se pot reduce cheltuielile de management al bolii si, implicit, de spitalizare si de monitorizare a complicatiilor, in aceste situatii raportul beneficiu – cost fiind pozitiv.

    Un alt aspect studiat a fost functionalitatea algoritmului de diagnostic al MBA, care a fost testata pe cazuri noi de MBA, selectate, validate si inregistrate in studiu conform criteriilor clinice, epidemiologice si de laborator, stabilite in etapele anterioare. Metodele conventionale de diagnostic au fost realizate in cea mai mare parte la nivelul laboratoarelor celor doi parteneri, iar la nivelul Institutului Cantacuzino s-au pus la punct si s-au realizat o serie de metode moderne de diagnostic si de investigare a patogeniei meningitelor bacteriene, precum si pentru diagnosticul diferential intre meningitele bacteriene si cele virale, in vederea completarii diagnosticului conventional cu unele metode moderne moleculare si imunologice, pentru dezvoltarea experimentala a modelului de algoritm de diagnostic.

    Astfel, au fost  inclusi in studiu  de catre cei doi parteneri 54 bolnavi prezentand MBA. Acesti bolnavi au provenit din judete din sudul tarii, cu varste cuprinse intre 1 luna si 75 ani, iar distributia pe sexe a fost aproximativ egala.

    Metodele conventionale, foarte importante si sugestive pentru diagnosticul de meningita bacteriana, au fost realizate la toti pacientii inclusi in studiu: (i) examenul LCR pentru orientarea diagnosticului (modificarile macroscopice, citologice si biochimice); (ii) coloratia Gram a fost pozitiva intr-un procent de 77,8% din cazurile studiate; (iii) Latex-aglutinarea cu LCR a fost pozitiva numai in 5 cazuri, in care cultura a fost negativa; desi specificitatea acestei reactii este foarte buna, sensibilitatea este mai mica, depinzand de numarul de germeni din LCR; (iv) Cultura LCR a fost pozitiva in 41 de cazuri (75,9%); (v) Serogruparea/serotiparea tulpinilor de N. meningitidis, S. pneumoniae si  H. influenzae a evidentiat predominenta serogrupului B la meningococi (o singura tulpina a apartinut serogrupului C), la pneumococi au predominat serotipurile 6B, 19F si 1,  iar hemofilii au apartinut  serotipului b.; (vi) Testarea sensibilitatii la antibiotice (TSA), realizata conform standardelor CLSI, a evidentiat la S pneumoniae o rezistenta  crescuta la tetraciclina (TE) si clindamicina (DA) – 42,1% ; 36,1% din tulpini au fost rezistente la eritromicina (E), iar rezistenta la penicilina si cefotaxim a fost inregistrata in 31,6% si, respectiv, 10,5% din cazuri. Toate tulpinile au fost sensibile la ciprofloxacin  (Grafic 3); la meningococi s-a observat rezistenta intr-un procent foarte mare fata de sulfamide si aparitia rezistentei de nivel scazut la penicilina, insa beta-lactaminele, carbapenemele, quinolonele, cloramfenicolul si rifampicina raman antibioticele majore curent utilizate in terapia si profilaxia acestor infectii.

    Adaugarea metodelor moleculare la algoritmul de diagnostic al MBA (in speta detectarea ADN-ului bacterian direct in LCR prin tehnica PCR si caracterizarea moleculara a tulpinilor bacteriene) are o deosebita importanta in special in situatiile in care pacientii au primit antibiotice inainte de realizarea punctiei lombare sau in cazul agentilor etiologici fastidiosi, dar si pentru confirmarea cat mai rapida a diagnosticului de MBA.

    Determinarea mediatorilor solubili ai inflamatiei prin metoda xMAP, atat la nivel sistemic (ser) cat si in LCR, in relatie cu etiologia si evolutia meningitelor infectioase, constituie o modalitate moderna de diagnostic, de investigare in detaliu a interactiei complexe agenti patogeni-sistem imun in relatie cu particularitatile localizarii meningeale, si de elucidare a  mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicatiilor neurologice consecutive. In aceasta etapa, au fost analizate un numar de 18 probe de  LCR si ser provenite de la pacienti cu meningita bacteriena (ajungandu-se la un total de 35 de pacienti), 17 probe de LCR de la pacienti cu meningite enterovirale si 15 probe de ser de la donatori sanatosi. Au fost evaluati parametrii imunologici stabiliti in etapa anterioara (IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α,  IFN-γ, VEGF, bFGF, MIP-1α,  MCP-1, ENA-78, IL-1β). Rezultatele obtinute au relevat prezenta unui status inflamator local mai puternic in cazul meningitelor bacteriene (caracterizate prin valori semnificativ mai mari atat ale citokinelor si proinflamatorii cat si ale IL-10) in comparatie cu meningitele enterovirale (concentratii detectabile doar pentru IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1α, ), dar si diferente semnificative intre cazurile de meningite bacteriene, in functie de agentul etiologic (coci gram negativi vs. coci gram pozitivi).

    S-a stabilit astfel setul de parametri definitorii ai algoritmului de diagnostic (parametri clinici, epidemiologici, parametri de laborator conventionali, moleculari si imunologici). Acest algoritm poate fi aplicat la nivelul laboratoarelor spitalelor de boli infectioase, cu conditia sustinerii materiale si educatiei continue a personalului medical. Aplicarea algoritmului modern de diagnostic al MBA se traduce prin optimizarea diagnosticului prin introducerea metodelor moderne si rapide, cresterea capacitatii de diagnostic microbiologic, imbunatatirea managementului meningitei bacteriene acute, ce au drept consecinta evolutia favorabila si reducerea complicatiilor severe ale infectiilor meningeale ce pot lasa sechele pentru toata viata.

    In concluzie, toate obiectivele etapei a III-a de executie a proiectului au fost indeplinite.

     

     

    ETAPA IV ŞI FINAL (15.11.2011)

     

    In cadrul etapei a IV-a, am urmărit îndeplinirea obiectivului specific:Model de studiu cu privire la interacţia sistem imun-agent patogen în MBA. Verificarea funcţionalităţii algoritmului de diagnostic  în clinică (aplicarea metodelor moderne de diagnostic – moleculare şi imunologice la pacienţii înscrişi în studiu). Integrarea cunoştinţelor acumulate şi evaluarea strategiilor de transfer spre potenţialii beneficiari”, obiectiv care a cuprins următoarele activităţi specifice şi rezultate estimate ale acestora:

    –          Elaborare model in vitro de studiu al efectelor bacteriilor / componentelor bacteriene asupra inflamaţiei în raport cu particularităţile regiunii meningeale

    –          Realizare model in vitro de studiu al efectelor bacteriilor/ componentelor bacteriene asupra inflamaţiei (secreţie mediatori, apoptoza etc.)

    –          Experimentarea funcţionalităţii algoritmului de diagnostic în clinică

    –          Realizarea sistemului integrat de cunoştinţe acumulate, prin corelarea datelor experimentale cu datele clinice

    –          Proiectarea şi elaborarea documentaţiei de analiză tehnico-economică asupra posibilităţii de transfer spre beneficiari a produselor rezultate din proiect [Strategie de transfer al algoritmului de diagnostic în sistemul de sănătate publică (aspecte tehnico-economice)]

    –          Diseminarea prin comunicarea şi publicarea naţională sau internaţională a rezultatelor

                            Scopul proiectului, reprezentat de elaborarea unui algoritm modern de diagnostic al meningitelor bacteriene acute, a fost realizat. Prin aceasta s-a ţintit:

    1. identificarea agenţilor etiologici, incidenţa şi caracterizarea acestora cu importanţă în orientarea diagnosticului şi în strategiile de combatere şi prevenire prin vaccinare. Metodele de izolare şi identificare utilizate au fost cele convenţionale asociate cu metodele moderne moleculare. Cultura LCR a fost pozitivă în 71,6% din cazuri, pe primul loc situând-se Streptococcus pneumoniae – izolat şi 47,3% din cazuri, cu predominenţa serotipurilor 6B, 19F şi 1, care se regăsesc în componenţa vaccinului pneumococic 23-valent, ceea ce corespunde, pe de o parte datelor din literatură – conform cărora serotipurile cuprinse în vaccinul 23-valent acoperă aprox. 90% din serotipurile implicate în infecţiile invasive, iar pe de altă parte aceste date denotă şi faptul că introducerea vaccinării antipneumococice ar acoperi în mare parte tulpinile care cauzează infecţii invasive, având un efect favorabil în ceea ce priveşte prevenirea şi scăderea îmbolnăvirilor în special la grupele de vârstă cu risc crescut. Neisseria meningitidis a fost identificat şi detectat în 13,5% din cazurile de meningită, serogruparea acestor tulpini, atât prin metode fenotipice cât şi moleculare, a relevat predominenţa serogrupului B, serogrup ce predomină în special în zona europeană.  Haemophilus influenzae,  se situează pe locul trei, fiind identificat şi detectat în 9,5% din cazuri şi aparţinând în mod egal serotipurilor b şi f. Urmărind distribuţia agenţilor etiologici după vârstă, s-a observat că la grupa de vârstă <5 ani s-au izolat şi/sau detectat germeni din toate cele trei specii,  H. influenzae fiind izolat în 80% din cazuri de la copii < 5 ani, vaccinarea anti – H. influenzae serotip b având un rol important în prevenirea infecţiilor invazive determinate de acest serotip, dar, aşa cum este semnalat şi în literatură, s-a observat apariţia unei nişe ecologice – alte serotipuri decât b şi chiar şi tulpini necapsulate de  H. Influenzae au fost identificate ca fiind cauza unor infecţii severe.
    2. completarea metodelor convenţionale cu metode şi tehnici moderne din domeniul: 
      –      biologiei moleculare, care asigură rapiditatea diagnosticului prin detectarea ADN bacterian direct din prelevatul clinic (LCR), precum şi caracterizarea agenţilor etiologici ai MBA. De asemenea, aplicarea metodelor moleculare ( în principal PCR) de detectare a ADN bacterian în LCR a mărit procentul de identificare a celor trei germeni, cei mai frecvent implicaţi în etiologia MBA. Astfel s-au detectat S. pneumoniae, H. influenzae, şi N. meningitidis la pacienţi la care cultura LCR a fost pozitivă, dar şi la pacienţi trataţi cu antibiotice anterior puncţiei lombare şi la care cultura a fost negativă (11 din cele 12 probe de LCR testate, pentru care cultura a fost negativă, au fost PCR pozitive pentru unul sau mai mulţi din cei trei agenţi cauzali mai importanţi ai MBA). Rezultatele obţinute prin PCR au fost concordante cu coloraţia Gram / Latex-aglutinarea , cultura LCR şi/sau semnele clinice ale pacienţilor al căror LCR a fost luat în experiment. Metoda  PCR multiplex, cu primeri specifici pentru detectarea simultană a unor secvenţe ţintă specifice, constituind un instrument rapid ce poate pune diagnosticul etiologic relativ repede, a fost adaptată şi optimizată în acest proiect. 

    –     imunologiei,  capabile să evidenţieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel ţinte terapeutice alternative. Determinarea citokinelor [IL-6, IL-8, IL-10, TNF-a, IFN-g), chemokinelor  (MCP-1, MIP-1a, ENA-78) şi factorilor de creştere (VEGF)] în serul şi LCR pacienţilor şi al martorilor cu meningite de origine enterovirală, s-a realizat prin aplicarea metodologiei stabilite în etapele anterioare ale proiectului, folosind tehnologia xMap, aplicată pe platforma Luminex. Rezultatele obţinute indică un status inflamator sistemic evident, caracterizat prin concentraţii semnificativ mai mari ale IL-6, IL-8 şi mai mici pentru ENA-78 la pacienţii cu meningite bacteriene. Meningitele cauzate de Neisseria meningitidis şi Streptococcus pneumoniae se diferenţiază clar de meningitele virale prin manifestările inflamatorii la nivel sistemic (concentraţii semnificativ mai mari de IL-6 şi IL-8), dar toţi pacienţii, indiferent de etiologia bolii, prezintă concentraţii scăzute ale ENA-78 în comparaţie cu donatorii sănătoşi. Determinările la nivel local indică un status inflamator mai puternic în cazul meningitelor bacteriene caracterizat prin valori semnificativ mai mari ale IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ, VEGF, MIP-1α, MCP-1, ENA-78 dar şi IL-10 în comparaţie cu meningitele virale (concentraţii detectabile doar pentru IL-6, IL-8, MCP-1 şi MIP-1α). Diferenţe semnificative în funcţie de agentul etiologic au fost identificate doar pentru IL-8, dar tendinţe spre concentraţii mai mari în LCR apar la pacienţii cu meningită meningococică şi în cazul IL-6, IL-10, TNF- α, MIP-1α şi MCP-1.                                                                                         

    –  prin componenta de cercetare fundamentală (ipoteze, modele de studiu) proiectul poate clarifica unele aspecte importante asupra mecanismelor patogenice ale bolii, prin dezvoltarea unui model experimental de investigare a interacţiei complexe agenţi patogeni-sistem imun în relaţie cu particularităţile localizării meningeale, în vederea elucidării mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicaţiilor neurologice consecutive. De asemenea, prin determinarea unor mediatori imuni (citokine, chemokine, factori de creştere) atât la nivel local cât şi sistemic, au fost evidenţiate unele particularităţi ale răspunsului imun în relaţie cu agentul etiologic al bolii.

     

                            Un rezultat important al proiectului, tradus şi printr-un plus de cunoaştere ştiinţifică în domeniu, s-a concretizat prin elaborarea  unei cărţi “Algoritm de diagnostic în meningitele bacteriene acute”, la editura CERES, încadrându-se în cerinţele strategiei de dezvoltare a cunoaşterii ştiinţifice în spaţiul european.

                            Prin îndeplinirea obiectivelor propuse, impactul proiectului este major în aria de cercetare medicală naţională dar şi internaţională, domeniul abordat reprezentând o prioritate tematică la nivel mondial. Acest proiect vine în întâmpinarea unei lungi activităţi pe plan european a proiectului EU-IBIS (European Union Invasive Bacterial Infections Surveillance), având drept scop îmbunătăţirea supravegherii bolilor invazive determinate de Neisseria meningitidis şi Haemophilus influenzae. Din 2007, în cadrul  European Invasive Bacterial Diseases Surveillance Network (EU-IBD), au fost incluse şi infecţiile invazive determinate de S. pneumoniae. 

                            Aplicarea acestor rezultate la nivel naţional vor avea şi un impact social şi economic direct:

    •  îmbunătăţirea stării de sănătate, creşterea calităţii vieţii şi a speranţei de viaţă a pacienţilor
    • reducerea incapacităţii de muncă şi a consecinţelor negative la nivelul familiei şi societăţii
    • reducerea cheltuielilor de spitalizare şi a costului extrem de ridicat ale tratamentului

     

                Prin activităţile de cercetare aplicativă şi dezvoltare experimentală desfăşurate în cadrul proiectului, se evidenţiază şi un impact economico-social derivat legat de creşterea competitivităţii în cercetare, prin:

    •   formarea tinerilor specialişti, prin dezvoltarea unor competenţe complementare şi interdisciplinare (număr tinerilor paticipanţi la proiect: 9, din care 3 asistenţi de cercetare şi 4 doctoranzi);
    •   posibilitatea dezvoltării profesionale pe termen lung a tinerilor cecetători (în timpul derulării proiectului unul din tinerii cercetători – as. de cercetare, a devenit doctorand având ca  temă implicarea H. influenzae în etiologia infecţiilor invazive şi studiul aprofundat al factorilor de virulenţă ce intervin în mecanismele fiziopatologice din cadrul acestor infecţii, iar un alt tânăr cercetător va continua şi aprofunda studiile în vederea elucidării mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicaţiilor neurologice, prin investigarea în detaliu a interacţiei complexe agenţi patogeni-sistem imun în relaţie cu particularităţile localizării meningeale)

     

                    Rezultatele obţinute, atât în cadrul proiectului cât şi prin continuarea studiilor de către tinerii cercetători, vor avea aplicabilitate clinică directă (Ministerul Sănătăţii Publice, care  în calitate de beneficiar, va putea implementa algoritmul de diagnostic în sistemul de sănătate publică), dar vor contribui şi ca spor de cunoaştere ştiinţifică în spaţiul european (European Added Value).

                                                                                                

              Prin introducerea la nivelul laboratoarelor, ce deservesc Spitalele de boli infecţioase şi Direcţiile de Sănătate Publică din ţară, a tehnicilor moderne de diagnostic adaptate la condiţiile noastre şi optimizate în cadrul proiectului, putem afirma că rezultatele acestui proiect vor conduce la atingerea unuia dintre obiectivele majore ale Planului Naţional de Cercetare – Dezvoltare şi Inovare II, şi anume – eficientizarea sistemului de sănătate publică, atât prin obţinerea într-un interval de timp mai scurt a rezultatelor scontate în cazul bolii, cât şi prin scăderea incidenţei acestor maladii datorită aplicării tot mai eficiente a strategiilor de prevenire prin vaccinare.

     

    Lista de publicatii / comunicari stiintifice  

    Carte

    •   Vasilica Ungureanu, Alexandru Rafila, Maria Nica. “Algoritm de diagnostic in meningitele bacteriene acute”. Editura CERES, Bucuresti,  2011.

    Articole

    •   L. Lerescu, C. Tucureanu, Iuliana Caras, Ramona Pitica, Vasilica Ungureanu, Aurora Salageanu. “Implicarea mediatorilor solubili ai inflamatiei în interactia agent patogen – sistem imun din cadrul meningitelor infectioase”.  Bacteriol.Virusol. Parazitol.Epidemiol.- 2008, vol 53, nr 2, p 89-97.
    •   M. Nica, T. Biolan, A. Dascalu, E. Mozes, A. Toderan, P. Calistru, E. Ceausu. “Tulpini bacteriene izolate din infectii sistemice ; evaluare si supravegherea rezistentei la antibiotice”. Bacteriol.Virusol. Parazitol.Epidemiol. 2010, vol 55 nr 2, p 151-160.
    •   Pana M, Ghita M, Nica M, Botea S, Dorobat OM, Rafila A, Papagheorghe R, Popescu N, Nistor I, Ungureanu V. “Study of Streptococcus pneumoniae strains resistant to antibiotics analyzed at “Cantacuzino” NIRDMI during 2006-2008”. Bacteriol.Virusol.Parazitol.Epidemiol. 2010, vol 55 nr 2, p 77-82
    •  Giuca Mihaela Cristina, Monica Straut, Maria Surdeanu, Alina Maria Holban, Cerasella Cristiana Dragomirescu, Raluca Georgescu, Laura Grigore, Maria Nica, Amalia Dascălu, Alexandru Rafila, Vasilica Ungureanu. “Methodology optimization and diversification for the investigation of virulence potential in Haemophilus influenzae clinical strains”. Roum.Arch.Microbiol.Immunol. Vol. 70, nr 4/2011.

    Comunicări naţionale

    •  Vasilica Ungureanu, A. Rafila, Maria Nica, Monica Straut. “Algoritm de diagnostic al meningitelor bacteriene acute”. Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie,Brasov, 8-10 oct.2009.
    •   Ungureanu Vasilica, Rafila Alexandru, Nica Maria, Straut Monica, Salageanu Aurora, Surdeanu Maria, Lerescu Lucian, Pana Marina, Petrini Anca, Giuca Mihaela si toti membrii Consortiului Parteneriate 42-116. “Managementul meningitelor bacteriene acute: Strategii moderne de investigatie si interventionale”. A 2-a Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
    •   Anca Petrini, Mihaela Giuca, Tuca Ceornea, Maria Nica, Alexandru Rafila, VasilicaUngureanu.  “Streptococi β-hemolitici implicati in etiopatogenia meningitei bacteriene acute (MBA)”. A 2-a Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
    •   Mihaela Cristina Giuca (Arama), Monica Straut, Marieta Surdeanu, Marina Pana, Anca Petrini, Vasilica Ungureanu.   ‘Haemophilus spp.: Implicatii in patologia umana si diagnostic”. A 2-a Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.
    •   Marina Pana, Maria Ghita, Maria Nica, Smaranda Botea , Olga Dorobat, A.Rafila, Raluca Papagheorghe, Nicoleta Popescu, Elena Duca ,Irina Nistor, Daniela Blana,Vasilica Ungureanu. “Studiul tulpinilor de Streptococcus pneumoniae, analizate la INCDMI  “Cantacuzino”, in perioada 2005 – 2010”. A 2-a Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Sinaia, 14-16 oct 2010.

    Comunicări internaţionale

    •  Vasilica Ungureanu, M. Pana, M.C.Giuca, M. Surdeanu, M. Nica, A. Rafila, O. Dorobat, A.O. Dascalu, all partners of “Parteneriate” project 42-116 and M. Straut. “Causal agents of acute bacterial meningitis: phenotipical and genotipical characteristics”. Microbiologia Balkanica, 7th Balkanic Congress of Microbiology, 25-29 oct 2011,Belgrad,Serbia.
    •   Mihaela Cristina Giucă, M. Străuţ, M. Surdeanu, C. M. Chifiriuc, V.  Ungureanu. “Phenotypic and molecular characterization of Haemophilus influenzae invasive and noninvasive strains”. Microbiologia Balkanica, 7th Balkanic Congress of Microbiology, 25-29 oct 2011,Belgrad,Serbia.

     

     

     

    Proiect 61-019

     

    Acronim: TERASER

     

    Titlu: Implementarea şi optimizarea procesului tehnologic de obţinere a serurilor terapeutice cu componentă activă F(ab’)2 faţă de agenţi înalt patogeni bacterieni şi virali. TERASER

     

    Director Proiect: Dr. Nadia Bucurenci

     

    Proiectul este coordonat de

     

    Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

     

    Avand ca parteneri

    1.  Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila”

    2.  Institutul National De Cercetare-Dezvoltare In Domeniul Patologiei Si Stiintelor Biomedicale ” Victor Babes”

     

     

    Rezumatul proiectului

    În anul 1890 von Behring demonstrează că anticorpii exogeni faţă de antigene solubile au valoare terapeutică, deoarece administrarea sistemică de ser de cal imunizat cu toxoid difteric sau cu anatoxină tetanică a redus semnificativ mortalitatea copiilor bolnavi de difterie sau de tetanos. Serurile terapeutice au deschis o noua cale de abordare terapeutică, pe cât de eficientă pe atât de actuală în combaterea bolilor produse de agenţi patogeni bacterieni, virali şi de toxine solubile.

     

    Dacă vaccinarea urmăreşte prevenţia bolilor infecţioase, serurile terapeutice reprezintă terapia cea mai eficace sau chiar de elecţie în unele boli infecţioase acute şi grave de etiologie bacteriană sau virală.

     

    Utilizarea anticorpilor policlonali ca agenţi terapeutici la nivel mondial cunoaşte o revigorare deoarece aceştia asigură o protecţie semnficativă după expunerea la un agent toxic, în absenţa unei vaccinări anterioare sau când răspunsul imun este foarte scăzut. Imunizarea pasivă cu anticorpi policlonali antigen specifici sau cu fragmente ale acestora este singura abordare terapeutică fezabilă care asigură protecţie clinică imediat după expunerea la toxine bacteriene (e.g. Bacillus antracis, Clostridium tetani), la un virus (e.g. Rhabdoviridae, Hepadnaviridae) sau după otrăvirea cu toxine solubile (e.g. veninuri). Utilizarea serurilor terapeutice policlonale cu componenta activă reprezentată de fragmentele F(ab’)2 bivalente rezultate prin digestia enzimatică cu pepsină, în mediu acid, a plasmei (serului) animale şi umane hiperimune are multiple avantaje. Serurile policlonale cu componentă activă F(ab’)2 recunosc şi neutralizează numeroşi epitopi din structura agentului patogen. Utilizarea exclusivă a fragmentelor F(ab’)2 bivalente comparativ cu utilizarea imunoglobulinei integrale reduce semnificativ reacţiile de hipersensibilitate şi sporeşte gradul de siguranţă a produsului final. Producerea anticorpilor fata de un antigen tinta în animale hiperimunizate şi nu prin inginerie genetică este avantajoasă deoarece anticorpii policlonali sunt produşi prin “selecţie naturală” împotriva epitopilor cu cea mai mare imunogenicitate. Numeroasele etape de concentrare şi purificare conduc la obţinerea unui produs final cu eficacitate crescută, înaltă puritate şi cu efecte secundare adverse absente sau semnificativ reduse care conferă serurilor policlonale o mai mare siguranţă în utilizare.

     

    Proiectul propus va furniza mai multe elemente de noutate pe plan naţional legate de implementarea şi optimizarea procesului tehnologic de obţinere a serurilor terapeutice cu componenta activă reprezentată de fragmente F(ab’)2 bivalente rezultate prin digestia enzimatică cu pepsină, în mediu acid, a plasmei (serului) hiperimune şi purificarea ulterioară prin metode de bioinginerie moderne.

     

    Obiectivul major al proiectului este punerea la punct pe scară de laborator a procedurilor de obţinere a unor seruri terapeutice cu eficacitate crescută şi cu efecte adverse secundare absente sau reduse, care este condiţionată de numeroşi factori care includ: (i) calitatea, puritatea şi concentraţia preparatului antigenic utilizat pentru inoculare; (ii) starea de sănătate a animalelor utilizate; (iii) schema de imunizare; (iv) colectarea şi stocarea plasmei (serului); (v) procedeul de hidroliză enzimatică cu pepsină în mediu acid pentru obţinerea fragmentelor F(ab’)2 prin hidroliza componentei Fc; (vi) etapele de purificare, concentrare şi caracterizare a amestecului proteic bogat în F(ab’)2; stabilitatea şi modul de formulare; (vii) testarea efectului imun protector; (viii) controlul intern de calitate.

     

    Importanţa economică deosebită asociată acestui proiect de cercetare constă în faptul că va putea oferi premisele autonomiei la nivel naţional privind producţia de seruri terapeutice, prin fundamentarea tehnico-ştiinţifică inovativă a procesului adaptabilă pentru diferite tipuri de antigene.

     

     

     

    Descrierea proiectului din punct de vedere stiintific si tehnic, incluzind gradul de noutate si posibilitatea aplicarii rezultatelor cercetarilor

    Anticorpii sunt imunoglobuline serice care au capacitatea de recunoaştere şi legare specifică a antigenelor străine, fiind capabili de eliminarea selectivă a microorganismelor, parazitilor şi moleculelor străine din organism.

    Administrarea de ser hiperimun pentru tratamentul infecţiilor la oameni a fost introdusă în anii 1890 pentru tratamentul difteriei. În anii 1930 seroterapia era larg utilizată în tratamentul infecţiilor bacteriene (cu pneumococ, bacil carbunos, bacil botulinic) şi virale (varicela). Datorită dezvoltării antibioterapiei, producţia şi utilizarea serurile terapeutice policlonale au cunoscut un declin, dar au revenit în actualitate fiind larg utilizate în neutralizarea virală, a toxinelor şi în terapia deficitului de imunoglobuline.

     

    Dezvoltarea în domeniul serurilor terapeutice la nivel internaţional cunoaşte mai multe direcţii: seruri hiperimune de origine animală (CroFabTM, DigiFabTM, Atgem®, etc) sau umană (Tetagam P®, Berirab P®, etc), producţia de amestecuri de anticorpi monoclonali şi alţi produşi bioterapeutici obţinuţi prin tehnici de inginerie genetică (anticorpi policlonali recombinaţi antigen specifici folosind ca sistem de expresie culturi de celule mamaliene, agenţi terapeutici policlonali umani obţinuţi în animale transgenice).

     

    Pe plan naţional producţia de seruri terapeutice a cunoscut un declin datorită costurilor mari de producţie, procedurilor tehnologice învechite şi noilor reglementări naţionale privind validarea etapelor din procesul de fabricaţie. În anul 2006 s-a sistat producţia naţională de imunoseruri inclusiv a celor strategice.

    Prin obiectivele şi activităţile de cercetare ofertate, acest proiect va contribui la implementarea şi optimizarea unei tehnologii inovatoare la nivel naţional pentru obţinerea unor seruri imune de uz terapeutic. Proiectul are un impact deosebit asupra sistemului naţional de sănătate deoarece oferă posibilitatea obţinerii de seruri terapeutice utilizate în tratamentul unor boli infecţioase acute, grave de etiologie bacteriană sau virală. Antigenele caracterizate şi formulate, care se vor utiliza pentru imunizarea animalelor, sunt obţinute din agenţi patogeni bacterien si viralii de importanţă epidemiologică.

     

    Noutatea şi complexitatea asociate proiectului rezultă din propunerile inovative de optimizare şi perfecţionare a procesului tehnologic de obţinere a serurilor terapeutice. Recoltarea plasmei hiperimune se va face prin metode cu circuit închis care asigură sterilitatea si suguranta produsului primar. Etapele de prelucrare, purificare şi concentrare perfecţionate se vor face în sisteme de unică folosinţă care limitează posibilităţile de contaminare şi reprezintă un element de noutate în producţia autohtonă de seruri terapeutice. Toate etapele de punere la punct la scară de laborator a procedurilor de obţinere a imunoserurilor vor urmări cerinţele impuse de farmacopeea europeană. Avantajul major al metodologiei ce urmează a fi elaborată derivă din plasticitatea procedeului tehnologic care va putea fi adaptat pentru producţia de seruri terapeutice faţă de diferite antigene.

     

    Obiectivul general al proiectului constă în elaborarea unei metodologii inovative de implementare şi optimizare a procesului tehnologic de obţinere a serurilor terapeutice cu componentă activă F(ab’)2 faţă de agenţi înalt patogeni bacterieni de importanţă strategică şi virali cu rol potenţial în biosiguranţa naţională.

     

     

     

    Impactul generat de proiect

    impactul economic al proiectului

    -realizarea acestui proiect va permite furnizarea unei metodologii aplicate la scară de laborator a producţiei de seruri terapeutice animale de uz uman strategice care va putea fi extrapolată la scară pilot şi industrială

    -metodologia care va fi elaborată prezintă un grad înalt de flexibilitate putând fi adaptată pentru producţia de seruri terapeutice faţă de diferite antigene de interes medical şi de biosecuritate (utilizabile în lupta contra bioterorismului)

    – studiile care se vor efectua în acest proiect urmăresc şi eficientizarea preţului de cost care face atractivă această metodologie pentru producatorii interesaţi

    impactul social al proiectului

    -Folosirea rezultatelor din această activitate de cercetare are un impact major pentru serviciile de sănătate publică, serurile terapeutice reprezentând terapia de elecţie în cazul anumitor urgenţe medicale cu etiologie infecţioasă

    -Proiectul va reprezenta cadru de studiu pentru tinerii cercetători implicaţi în acest proiect

    impactul asupra mediului

    -Nu există riscuri de poluare şi contaminare a mediului fiind respectată legislaţia în vigoare referitoare la normele de protecţie a muncii şi mediului aplicate în laboratoarele de cercetare biomedicală.

    – Experimentele ştiinţifice cu animale vor fi aprobate de Comisia internă de etică şi va respecta legislaţia internă şi europeană în domeniu

     

    Rezumatul primei faze de studiu

     

    Profilaxia tetanosului in Romania, realizata in special prin imunizarea in masa a intregii populatii a dus la o scadere spectaculoasa a morbiditatii si mortalitatii.

    Metoda consta in combinatia profilaxie specifica active cu VTA(vaccin titanic adsorbit) , profilaxie specifica pasiva- serul antitetanic. In scop profilactic se aplica in cazul plagilor tetanigene, la cei nevaccinati antitetanic, la cei vaccinati incomplete, precum si la cei cu antecedente vaccinale nesigure ser antitetanic purificat si concentrat pe cale subcutanata, in dozele recomandate , vaccinare de urgenta cu vaccin titanic adsorbit (VTA) si tratament cu antibiotice. In scop terapeutic se foloseste aceeasi combinatie ser antitetanic purificat si concentrate si vaccine titanic adsorbit. Antigenul folosit pentru obtinerea vaccinului antitetanic si a serului antitetanic este anatoxina tetanica nativa. Anatoxina – preparat obtinut dintr-o toxina bacteriana prin actiunea formolului si a caldurii si care si-a pierdut puterea toxica , pastrand proprietatile anigenice si imunizante.

    In 1896 van Ermengem,in cursul unei intoxicatii alimentre cu carnati izoleaza germenul incriminat pe care l-a numit C.botulinum. In mod paradoxal, aceste toxine sunt utilizate pentru tratamentul maladiilor caracterizate printr-o hiperactivitate musculara sau pentru a suprima ridurile. Toxina botulinica la om are ca si toxina tetanica , neurotropism exclusive. Mecanismul sau de actiune consta in blocarea transmiterii nervoase , prin inhibarea secretiei de acetilcholina. La animalul de laborator injectarea intraperitonela a toxinei produce o paralizie flasca a trenului posterior, care evolueaza ulterior spre moarte in lipsa administrarii antitoxinei. Toxina botulinica este cea mai puternica otrava cuscuta la acesta ora. 1mg de toxina pura poate provoca moartea a 40 miliarde de soareci

    Substanţa activă pentru prepararea Serului nativ anticărbunos o constituie globulinele antitoxice obţinute prin hiperimunizarea animalelor cu tulpinia B. anthracis 34 F2 (Sterne). Administrarea globulinelor specifice, anti B. anthracis, induc protecţie imună pasivă prin neutralizarea exotoxinelor în infecţia cărbunoasă.

    Totusi, având în vedere cã productia vaccinului gripal este laborioasã, consumatoare de timp, dependentã aproape în totalitate de ouã embrionate, si cã rezistenta la antivirale, chiar si la inhibitorii de neuraminidazã se instaleazã destul de rapid (2), alte directii sunt luate în studiu, cum este imunoterapia. Scopul studiului din aceastã etapã a fost de a obtine si a caracteriza o suspensie de virus gripal A/H5N1, întreg, purificat si inactivat pentru imunizarea animalelor în vederea producerii de seruri specifice terapeutice cu componentã activã F(ab’)2.

    Virusul gripal este agentul cauzal al uneia dintre cele mai frecvente boli respiratorii severe la om, cu rãspândire globalã. În cadrul tipului A al virusului gripal, numai subtipurile H1N1, H2N2, H3N2 au determinat pandemii în secolul precedent dar toate cele 16 subtipuri de hemaglutininã (HA) si 9 de neuraminidazã (NA) sunt mentinute în populatii de pãsãri acvatice care reprezintã rezervorul lor natural. Aceste virusuri aviare nepatogene se pot transforma, adesea, în virusuri înalt patogene, virulenta fiind poligenicã dar se pare cã rolul major îl are HA.

    Analiza fiecarei aplicatii este expusa pe larg in proiect.

    Titlul Proiectului: CERCETARI DE GENOMICA SI PROTEOMICA IN PATOGENIA SCLEROZEI SISTEMICE IN VEDEREA DESCHIDERII DE NOI PERSPECTIVE TERAPEUTICE

     

    Acronimul proiectului: SScHELP

    Contract nr: 41-021/2007

    Programul: PN-II – Parteneriate in domeniile prioritare

    Tipul Proiectului: PC

    Durata proiectului: 3 ani

    Data inceperii proiectului: 2007

    Data finalizarii proiectului: 2010

    Valoarea totala a proiectului: 2.000.000 lei

    Finantare de la buget: 2.000.000 lei

     

    Autoritatea contractanta (finantatoare a proiectului): Centrul National de Management Programe


    Institutia coordonatoare: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino

    Director de proiect: Dr. Cristiana Matache (cristianamatache@cantacuzino.ro)

     

    Componenta consortiului:

    P1: Spitalul Clinic Sfanta Maria

    Responsabil stiintific: Conf. Dr. Denisa Predeteanu (dpredet@rdslink.ro)

     

    P2: Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” „Centrul de cercetare in patologia si tratamentul bolilor sistemice reumatismale” – RCRD

    Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Ruxandra Ionescu (ruxandraionescu1@gmail.com)

     

    P3: Universitatea Politehnica Bucuresti, Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor

    Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Ioana Jitaru (ioanajitaru2002@yahoo.com)

     

    Rezumat:

    Proiectul are ca scop elucidarea unor mecanisme moleculare implicate in disfunctiile celulare observate la pacientii cu Scleroza Sistemica. Scleroza sistemica (scleroderma, SSc) este o boala autoimuna caracterizata prin deteriorari microvasculare si fibroza la nivelul dermei si organelor interne. In pofida multiplelor eforturi pentru studierea mecanismelor etiopatologice SSc ramane o boala incomplet elucidata care inca asteapta raspunsuri privind diagnosticul precoce, dezvoltarea si propagarea bolii dar mai ales terapia.

    In ultimii ani, cercetatori din intreaga lume si-au dedicat eforturile sperand sa identifice: cuza/cauzele bolii, mecanismele celulare si moleculare care guverneaza aceasta patologie, noi biomarkeri si tinte terapeutice, terapii cat mai adecvate si mai tintite. Printre multiplele defecte identificate in SSc rolul celulelor T si al monocitelor infiltrate in leziunile tisulare din SSc este unanim acceptat. La acest nivel, prin secretia de factori profibrotici si activarea fibroblastelor are loc producerea anormala de colagen sau alte proteine de matrice extracelulara. In timp ce rolul celulelor T in dezvoltarea fibrozei asociate SSc a fost intens studiat, rolul celulelor B a fost subevaluat chiar daca s-a observat ca aceste celule sunt in stare de activare cronica si sunt capabile sa produca autoanticorpi specifici acestei boli autoimune. Terapiile aplicate pana in prezent, in general, incearca sa amelioreze consecintele bolii. Totusi, descoperirea multiplelor defecte celulare si moleculare la pacientii cu SSc a deschis orizontul spre terapii promitatoare care au ca tinta celulele T si B, receptorii lor, moleculele implicate in semnalizare sau mediatorii celulari solubili.

    Recent, descoperirea unei noi clase de proteine apartinand familiei de semaforine si demonstrarea rolului acestei clase in activarea celulelor T si B ne-a condus la dezvoltarea acestui proiect prin care se urmareste: (1) elucidarea implicarii semaforinelor si a receptorilor lor in cooperarile dintre diferite populatii celulare ale sistemului imun ca si dintre celulele imune si non-imune, in scopul identificarii de noi tinte terapeutice pentru pacientii cu SSc (Etapele I si II); (2) elaborarea unor metode de proteomica si genomica in scopul identificarii de biomarkeri cu potential de diagnostic si/sau prognostic pentru pacientii cu SSc (Etapele III si IV); (3) analiza in vitro si in vivo (pe un model murin de SSc umana) a eficacitatii unor inhibitori asupra expresiei si secretiei de semaforine (Etapa V).

     

    Stadiul proiectului: finalizarea etapei IV

     

    Rezultatele studiilor derulate pana in prezent (Etapele I, II, III, IV)


                Analiza comparativa prin citometrie de flux (FACS) a celulelor mononucleare periferice (PBMCs) izolate de la pacienti cu SSc, cu Lupus Eritematos Sistemic (LES) si donatori sanatosi a aratat:

    –          pacientii cu SSc prezinta cel mai crescut procent de celule T CD4+ care exprima nivele crescute de semaforina 4D (sema4D/CD100);

    –          procentul de celule T CD4+CD100high este mai mare decat cel de celule T CD8+CD100high independent de procentele de celule T CD4+ sau CD8+ si de grupul investigat ;

    –          raportul CD4+CD100high/CD8+CD100high este semnificativ mai mare in cazul pacientilor cu SSc (2.04±1.80) comparativ cu donatorii sanatosi (1.14±0.61);

    –          procentele de celule T CD100high nu sunt crescute/scazute si pentru pacientii cu LES, cu toate ca LES este considerat prototip de boala autoimuna sistemica;

    –          PBMCs pacientilor cu SSc, aproape similar cu cele ale donatorii sanatosi, contin aproximativ 1% celule B CD19+CD100high in timp ce PBMCs pacientilor cu LES au un procent semnificativ redus (~ 0.37%);

    –          ponderea celulelor B CD72+ in populatia de celule B CD19+ periferice este semnificativ redusa in cazul pacientilor cu LES, ceea ce-i diferentiza semnificativ de donatorii sanatosi;

    –          serurile pacientilor cu SSc contin nivele crescute de CD100 solubil (sCD100);

    –          41,94% din serurile pacientilor cu SSc, 0% din serurile pacientilor cu LES si 9.09% din cele ale donatorilor sanatosi pot fi considerate pozitive pentru sCD100 in raport cu valoara de cut-off definita ca fiind egala cu valoarea medie + 2 x deviatia standard obtinuta pentru donatorii sanatosi;

    –          in cazul pacientilor cu SSc, nivelele serice de sCD100 nu se coreleaza cu procentele de celule T si B CD100high;

    –          procentele crescute de celule T CD3+CD100high sunt o caracteristica a pacientilor cu SSc cu boala mai veche de 2 ani, cu anticorpi anti-Scl70 pozitivi sau cu proces inflamator activ (VSH > 30 mm/h, CRP > 1 mg/dl). De asemenea, pacientii cu forma difuza a bolii sau cu boala interstitiala pulmonara (BIP) au cele mai mari rapoarte CD4+CD100high/CD8+CD100high (~ 2.5±2);

    –          nivele serice crescute de sCD100 caracterizeaza pacientii cu SSc care prezinta BIP sau proces inflamator activ (VSH, CRP crescute);

    –          procente crescute de celule B care supraexprima CD19 (mediator al semnalelor pozitive de activare celulara) sunt o caracteristica a pacientilor cu SSc cu scor Rodnan modificat > 14 (afectare cutanata severa);

    –          un procent redus de celule B CD19+CD72+ caracterizeaza pacientii cu SSc care au prezenti anticorpii anti-centromer.

                Prin cultivarea ex vivo a PBMCs, in conditii de stimulare specifica celulelor T, s-a remarcat numai in cazul pacientilor cu SSc o crestere semnificativa a procentelor de celule T CD8+CD100high si B CD19+CD100high. Cresterea frecventei celulelor T CD8+CD100high este insotita de cresterea nivelelor de sCD100 si IgG in supernatantele de cultura dar si de reducerea procentelor de celule B CD19+CD72+. Cu toate acestea, numai intre procentele de celule T CD8+CD100high si nivelul de sCD100 exista o corelatie directa semnificativa.

    Aceasta observatie a sugerat ca prin activare si expresia crescuta a receptorului CD100 celulele T CD8+ isi pierd capacitatea de supresie asupra celulelor B, probabil prin interactia contrareceptorilor CD100, exprimati de celulele T, si CD72, exprimati de celulele B; in acest mod blocandu-se semnalele negative din caile de activare a celulelor B.

                Rezultatele obtinute pana in prezent stau la baza unui nou concept privind rolul jucat de CD100 si/sau sCD100 in dezvoltarea unor procese patologice la nivel tisular local, a unor procese inflamatorii sau in dezvoltarea unui raspuns imun nepotrivit (autoimunitate) din SSc.

     

    Valorificarea rezultatelor obtinute pana in prezent:

     

    Publicatii:


    1. Role of cellular immunity in Systemic Sclerosis pathogenesis: update on CD4+T cells population studies. Alina Nicoleta Besliu, Leontina Mirela Banica, Ruxandra Ionescu, Denisa Predeteanu, Crina Stavaru, Carmen Maria Marica, Cristina Chitonu, Gina Pistol, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2009, 68 (1): 5-13


    Comunicari:


    Congrese/conferinte internationale:


    1. Semaphorin 4D involvement in Systemic Sclerosis; Alina Besliu, Leontina Banica, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Carmen Marica, Cristina Chitonu, Gina Pistol, Violeta Vlad, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 3rd conference Adaptive Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases; September 24-27, 2009, Genova, Italy
    2. The role of CD100 and CD72 in the cooperation between peripheral T and B cells from Systemic Sclerosis patients; A. Besliu, C. Marica, L. Banica, D. Predeteanu, R. Ionescu, C. Stavaru, V. Vlad, M. Stefanescu & C. Matache; 2nd European Congress of Immunology; september 13-16, 2009, Berlin, Germany, European Journal of Immunology, 2009, Vol. 39(S1), Pg. S235
    3. CD100 expression level on peripheral blood T and B cells from patients with Systemic Sclerosis, C. Matache, A. Besliu, L. Banica, D. Predeteanu, R. Ionescu, C. Marica, L. Varzaru & M. Stefanescu, 6th International Congress on Autoimmunity, September 10-14, 2008, Porto/Portugal, Abstract 289
    4. Effects of some cellular and molecular defects on anti-DNA topoisomerase I antibodies production in Systemic Sclerosis patients . M. Stefanescu, L. Banica, A. Besliu, G. Pistol, C. Stavaru, R. Ionescu, A.M. Forsea, C. Tanaseanu, S. Dumitrache, D. Otelea, M. Balteanu & C. Matache, 6th International Congress on Autoimmunity, September 10-14, 2008, Porto/Portugal, Abstract 290


    Congrese/conferinte nationale:


    1. Soluble Semaphorin 4D role in Systemic Sclerosis. Alina Besliu, Leontina Banica, Cristina Chitonu, Carmen Marica, Gina Pistol, Denisa Predeteanu, Violeta Vlad, Ruxandra Ionescu, F. Berghea, Crina Stavaru, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 39th National Conference of Immunology – Calimanesti-Caciulata, 24-26 September 2009, Abstract 17
    2. Are matrix metalloproteinases responsable for the high level of serum sCD100 in patients with Systemic Sclerosis? Alina Besliu, Leontina Banica, Denisa Predeteanu, Violeta Vlad, Ruxandra Ionescu, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 38th National Conference of Immunology – Calimanesti-Caciulata, 24-26 September 2009, Abstract 18
    3. CD100 a potential marker for Systemic Sclerosis. Alina Besliu, Leontina Banica, Carmen Marica, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Crina Stavaru, Cristiana Matache & Maria Stefanescu, NIRDMI „Cantacuzino” Annual scientific conference, 14-15 january 2009, Bucharest
    4. CD72 expression and molecular analysis in Systemic Sclerosis. Carmen Marica, Leontina Banica, Alina Besliu, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Crina Stavaru, Maria Stefanescu & Cristiana Matache, NIRDMI „Cantacuzino” Annual scientific conference, 14-15 ianuary 2009, Bucharest
    5. CD100 and CD72 expression level on peripheral blood T and B cells from patients with Systemic Sclerosis. A. Beşliu, L. Bănică, D. Predeţeanu, R. Ionescu, C. Marica, C. Stăvaru, L. Vărzaru, M. Ştefănescu & C. Matache, 38th National Conference of Immunology- Busteni, 24-26 September 2008
    6. Cellular and molecular defects observed in Systemic Sclerosis patients could explain anti-DNA topoisomerase I antibodies production, A. Beşliu, L. Bănică, G. Pistol, C. Stăvaru, R. Ionescu, A.M. Forsea, C. Tănăseanu, S. Dumitrache, D. Oţelea, M. Bălteanu, C. Matache & M. Ştefănescu, 38th National Conference of Immunology- Busteni, 24-26 September 2008