Skip to content

Institutul Cantacuzino

Profesionalismul si experienta noastra pentru sanatatea dumneavoastra !

Cercetare-Dezvoltare-Inovare > Proiecte > Proiecte Idei


Subcategorii:
  • No categories
  • Articole in aceasta categorie:
  • Proiect 721
  • Proiect CNCSIS IDEI 219/ 2007-2010

  • Proiect 721

    Dec 1

    Proiect IDEI cod CNCSIS IDEI 721/ Contract nr. 1232/2009

     

    TITLUL PROIECTULUI
    Portajul vaginal al unor microorganisme potential patogene: colonizare tranzitorie sau prim pas in declansarea unei infectii?

     

    ECHIPA DE CERCETATORI
    Usein Codruţa-Romaniţa – director de proiect, CSII, medic primar Medicina de Laborator, doctor in Medicina/specialitatea Microbiologie, Laboratorul Epidemiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
    Strãuţ Monica chimist, CS I, doctor in Chimie/specialitatea Biochimie, Laboratorul de Epidemiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
    Georgescu Raluca Margareta medic primar Medicina de Laborator, Laboratorul de Analize Medicale, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
    Grigore Laura Andrea medic primar Medicina de Laborator, Laboratorul de Analize Medicale, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
    Creţoiu Mariana-Silvia, CS,  biolog, Laboratorul de Epidemiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino” (prezenta in echipa in anul 2009)
    Petrini Anca Maria medic specialist Medicina de Laborator, asistent de cercetare, Laboratorul de infectii respiratorii bacteriene, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino” (prezenta in echipa pana in iunie 2011)

     

    OBIECTIVUL PROIECTULUI

    Studiul de fata are ca obiectiv general imbogatirea cunostintelor legate de izolatele clinice romanesti apartinand unor specii (Escherichia coli si Streptococcus agalactiae) care expun la un inalt risc infectios atat gazda cat si descendentii ei. Aceasta se realizeaza prin doua directii de cercetare: 1/ caracterizarea determinantilor genetici asociati potentialului de patogenitate bacteriana si 2/ imbunatatirea calitatii diagnosticului microbiologic local, prin introducerea metodelor moleculare de caracterizare a genotipului de virulenta.

     

    PLANUL DE REALIZARE A PROIECTULUI

    2009/etapa intermediara
    Termen de raportare: 15 septembrie
    Buget alocat: 38557,06 lei

    Obiective specifice:
    ●Elaborarea unui model de studiu microbiologic pentru evaluarea portajului vaginal de E. coli si S. agalactiae si a riscurilor pe care le implica
    ●Realizarea colectiei de studiu reprezentata de izolate de E. coli si S. agalactiae
    ● Caracterizarea fenotipica a colectiei bacteriene

    2009/ etapa finala
    Termen de raportare: 11 decembrie
    Buget alocat: 33659,45 lei

    Obiective specifice:
    ● Evidentierea particularitatilor autohtone ale portajului vaginal de E. coli si S. agalactiae

    2010 – finantare sistata

     

    2011/ etapa unica

    Termen de raportare: 10 decembrie

    Buget alocat: 175000 lei

    Obiective specifice:

    ● Evaluarea gradului de inrudire genetica a izolatelor colectiei de E. coli

    ● Subtipizarea prin PFGE a izolatelor colectiei de S. agalactiae

    ● Determinarea bazei moleculare a rezistentei la antibiotice la tulpini din colectia de S. agalactiae

    ● Evaluarea relevantei clinico-epidemiologice a rezultatelor obtinute in cadrul acestui studiu microbiologic privitor la portajul vaginal de E. coli si S. agalactiae

     

    REZULTATE
    2009

    • Demararea constituirii colectiei bacteriene, pornind de la prelevate de secretie vaginala, recoltate de la femei gravide si negravide, care s-au adresat pentru investigatii microbiologice Laboratorului de analize medicale din cadrul I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino” (perioada mai – decembrie 2009);
    • Izolarea si identificarea tulpinilor de S. agalactiae si E. coli din cultura prelevatelor vaginale, folosind metode conventionale de diagnostic microbiologic (caractere fenotipice de metabolism si antigenicitate);
    • Serotipizarea tulpinilor de S. agalactiae pe baza polizaharidului capsular;
    • Testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor de S. agalactiae si E. coli, conform recomandarilor din ghidul elaborat de Clinical and Laboratory Standards Institute.
    • Diseminare rezultate:

    *Codruta-Romanita Usein, Laura Grigore, Raluca Georgescu, Maria Condei, Madalina Baltoiu, Maria Damian. Potentialul de patogenitate al unor izolate vaginale de Escherichia coli. Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, octombrie 2009 (comunicare orala)

    *Anca Petrini, Raluca Georgescu, Laura Grigore, Olivia Vizitiu, Mihaela Arama, Codruta-Romanita Usein, Vasilica Ungureanu. Caracteristicile fenotipice ale streptococilor beta-hemolitci de grup B (SGB) izolati din secretii vaginale. Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, octombrie 2009 (poster)

    *Monica Straut, Silvia-Mariana Cretoiu, Vasilica Ungureanu, Anca Maria Petrini, Raluca Georgescu, Laura Grigore, Codruta-Romanita Usein. Identificarea si distributia unor determinanti genetici in izolate de streptococ de grup B. Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, octombrie 2009 (poster)

    *Anca Petrini, Raluca georgescu, Laura Grigore, Olivia Vizitiu, Mihaela Arama, Codruta Usein, Vasilica Ungureanu. Streptococii beta-hemolitici de grup B (SGB): portaj vaginal si rezistenta la antibiotic. Simpozionul tematic organizat pentru marcarea Zilei Europene a Informarii despre Antibiotice. Bucuresti, noiembrie 2009 (comunicare orala)

    *Usein Codruta-Romanita, Cretoiu Mariana-Silvia, Ungureanu Vasilica, Ghita Maria, Petrini Anca, Straut Monica. Genetic heterogeneity of group B streptococci isolated from Romanian pregnant women. Romanian Archives of Microbiology and Immunology 68 (2): 11-16, 2009.

    *Usein CR, Petrini A, Georgescu R, Grigore L, Străuţ M, Ungureanu V. Group B streptococcus colonization of Romanian women: phenotypic traits of isolates from vaginal swabs. Roum Arch Microbiol Immunol. 68(4):235-9, 2009.

     

    2010

    *M. Straut, S. Cretoiu, V. Ungureanu, A.M. Petrini, R. Georgescu, L. Grigore, C.R. Usein. Distribution of serotypes, antimicrobial resistance and virulence-related genes among group B streptococci of vaginal origin isolated in Romania. 20th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Viena, Austria 10-13 April 2010 (poster).

    *M. Straut, S. Cretoiu, V. Ungureanu, A.M. Petrini, R. Georgescu, L. Grigore, C.R. Usein. Distribution of serotypes, antimicrobial resistance and virulence-related genes among group B streptococci of vaginal origin isolated in Romania. Clin. Microbiol. Infect. 16: S273, 2010.

     

    2011

    • Un protocol rapid, bazat pe tehnica PCR multiplex, a permis incadrarea tulpinilor de E. coli in unul dintre cele patru grupuri filogenetice majore; A, B1, B2 si D;
    • Izolatele derivate din grupul filogenetic B2, cunoscut ca sursa de E. coli cu potential patogen extraintestinal (ExPEC), au fost genotipate prin metoda PFGE (Pulsed-Field Gel Electrophoresis). Compararea profilurilor de fragmente de ADN genomic, obtinute prin macrorestrictie cu enzima XbaI, a stat la baza evaluarii diversitatii genetice intraspecifice. Interpretarea dendrogramei rezultate s-a realizat cu ajutorul programului Fingerprinting II;
    • Gradul de inrudire genetica a tulpinilor de S. agalactiae a fost apreciata folosind metoda PFGE. Macrorestrictia ADN s-a realizat cu enzima SmaI, iar dendrograma generata prin compararea profilurilor PFGE cu programul Fingerprinting II.
    • Pentru o cat mai buna apreciere a diversitatii genetice a serotipurilor circulante de S. agalactiae, genotiparea prin PFGE a fost completata cu analiza unor markeri genetici suplimentari: elemente genetice mobile (secventa de insertie IS1548 si intronul de grup II GBSi1) si gene codante pentru proteine de suprafata (bac, bca, alp1, alp2/3, alp4, rib).
    • Izolatele de S. agalactiae, a caror sensibilitate la antibiotice (penicilina, cefuroxime, ofloxacin, eritromicina, clindamicina, tetraciclina) a fost testata anterior, au fost studiate pentru a se stabili baza moleculara a fenotipului lor de rezistenta. Determinantii de rezistenta tintiti pentru tehnica PCR au fost urmatorii: tetM, tetO, tetL (rezistenta la tetraciclina), ermA, ermB, mefA (rezistenta la macrolide-lincozamide), gyrA, parC (rezistenta la fluoroquinolone). Tulpinile purtatoare de gena tetM au fost analizate si pentru prezenta genei codante pentru integraza specifica familiei de transpozoni conjugativi Tn916.
    • Diseminare rezultate:

     

    *Codruta-Romanita Usein, Violeta Cristea, Madalina Baltoiu, Maria Condei, Monica Straut. Genetic diversity of vaginal Streptococcus agalactiae isolates from Romania. XVIII Lancefiled International Symposium, Palermo, Italia, septembrie 2011 (poster).

    *Monica Straut. Molecular characterization and genetic diversity of Streptococcus agalactiae isolates colonizing female population from Romania. 7thBalkan Congress of Microbiology. 8th Congress of Serbian Microbiologists, Belgrad, Serbia, octombrie 2011 (prezentare orala).

    *Usein Codruta-Romanita, Grigore Laura, Raluca Georgescu, Baltoiu Madalina, Condei Maria, Cristea Violeta, Straut Monica. Caracterizarea genotipica a izolatelor autohtone de Streptococcus agalactiae. Congresul National de Microbiologie. Conferinta Nationala de Epidemiologie, Iasi, noiembrie 2011 (poster).

    *Codruta-Romanita Usein, Laura Andrea Grigore, Raluca Margareta Georgescu, Madalina Cornelia Baltoiu, Maria Condei, Monica Delia Teleman. Phylogenetic background and extraintestinal virulence genotypes of Escherichia coli vaginal strains isolated from adult women. Revista Romana de Medicina de Laborator 19: 37 – 46, 2011 (ISSN: 1841-6624; revista cotata ISI, factor de impact 0,113)

    *Codruţa-Romaniţa Usein, Laura Grigore, Raluca Georgescu, Violeta Cristea, Mãdãlina Bãltoiu, Maria Condei, Monica Strãuţ . Molecular characterization of adult-colonizing Streptococcus agalactiae strains isolated in Romania (articol in evaluare la editorul revistei Europ J Clin Microbiol Infect Dis)

     

     

     

     

     


    Director de proiect Dr. Anda Baicus

    “Genotiparea tulpinilor de poliovirus izolate in Romania in perioada 2007-2010 de la cazurile cu paralizie acuta flasca (PAF)  si contactii sanatosi ai acestora ca obiectiv major al procesului de Eradicare a Poliomielitei”


    SINTEZA LUCRARII FAZA 2009

    Articole publicate de membrii echipei de cercetare pe durata derularii proiectului:


    2009: A  Baicus, A Persu, M Popescu, A Penciu, S Stavri, A Soare,N Grecu, C Szmal, G Oprisan, Correlation between vaccine coverage against polio and circulation and genetic evolution of the poliovirus strains isolated in Romania in the framework of the global polio eradication strategy,Roum Arch Microbiol  Immunol., 2009, 4, 9-14.

    2009: A Persu , A Baicus, S Stavri, M.Combiescu.  Non-polio enteroviruses associated with acute flaccid paralysis (AFP) and facial paralysis (FP) cases in Romania, 2001-2008, Roum Arch Microbiol Immunol., 2009, 68(1):20-6.

    2007: A Baicus, A  Persu ,M  Combiescu ,  A Aubert-Combiescu.  The maintaining of the active laboratory-based surveillance of the acute flaccid paralysis (AFP) cases in Romania in the framework of the strategic plan of the global polio eradication initiative, Roum Arch Microbiol Immunol., 2007, 66(1-2):44-50.

    Articol aflat in curs de redactare realizat in colaborare cu echipa din Institutul Pasteur Paris:

    The frequency and biodiversity of polioviruses and enteroviruses nonpolio strains isolated from  healthy children living in a limited area in Romania



    Situatia la nivel international

    Poliomielita este o boala paralitica acuta avand ca etiologie poliovirusul. Poliovirusul, este un membru al genului Enterovirus aparţinând Familiei Picornaviridae. Particula virală are simetrie icosaedrică, este lipsită de anvelopă lipidică şi are un diametru de aproximativ 28nm, este stabilă la pH 3, rezistentă la eter, are o densitate de 1,34 g/cm³ în ClCs, un  coeficient de sedimentare de 160 S şi o greutate  moleculară de 8,5×10³ Kda. Capsida, alcătuită  din 60 de copii ale fiecăreia din cele 4 subunităţi proteice VP1, VP2, VP3 (proteine capsidale majore) şi VP4 (proteină capsidală minoră), înveleşte ARN genomic monocatenar, de polaritate pozitivă (aproximativ 7441 nt). Genomul viral este monocistronic, cu o regiune 5’ non-codantă (NC) (740 nt) ce conţine secvenţa semnal pentru iniţierea translaţiei şi care terminal este legată covalent de un oligopeptid VPg; urmează o lungă porţiune de lectură deschisă ce codifică o poliproteină de aproximativ 250 Kda şi o regiune 3’NC (70 nt), poliadenilată  terminal.  

    Prevenirea poliomielitei, boală infecţioasă gravă prin mortalitatea indusă dar şi prin handicapurile motorii pe care le lasă în urma sa, se face cu ajutorul a două vaccinuri, ambele foarte eficace: vaccin polio inactivat (VPI) şi vaccin polio oral (VPO). Cele două  vaccinuri sunt de concepţie“ pasteuriană”: microorganism omorât (prin formol) (VPI), respectiv microorganism viu atenuat (VPO) [atenuare prin pasaje repetate în gazde diverse (animale sau culturi de celule) şi în condiţii particulare de creştere (temperaturi suboptimale)]. Punerea la punct a tehnicii culturilor de celule (Enders, Weller şi Robbins, 1949, Premiul Nobel), care a demonstrat că poliovirusul se poate multiplica şi în alte celule decât cele nervoase, a permis realizarea vaccinurilor antipolio. VPI a fost realizat de Dr. Jonas Salk în 1953 şi introdus pe scară largă în 1955 în ţările scandinave. În restul lumii cu excepţia Franţei şi Olandei, introducerea vaccinului nu a reuşit să elimine rapid poliomielita epidemică, ceea ce a contribuit rapid la succesul răsunător în  1959 al VPO (Sabin).

    În mai 1988 a fost lansata de catre Adunare Mondială a Sănătăţii Initiativa de Eradicare Globala a Poliomielitei pana in anul 2000. Planul Strategic de Eradicare Globala a Poliomielitei  (PGEP) OMS cuprinde activitati prioritare pentru fiecare faza :

    1. Certificarea eradicarii polio la nivel regional
    2. Stoparea vaccinarii cu VPO ( vaccin polio oral)
    3. Faza post vaccinare cu VPO

    Obiectivele Iniţiativei de Eradicare a poliomielitei sunt: dispariţia cazurilor de poliomielită provocate de poliovirusul sălbatic, absenţa poliovirusurilor sălbatice în produse patologice şi în probele prelevate din mediul înconjurător.

    La 20 de ani de la lansarea initiativei de Eradicare a Poliomielitei tarile in care au fost identificate tulpinile de poliovirus salbatic responsabile de aparitia endemiilor sunt: Afghanistan, India, Nigeria si Pakistan. Circulatia tulpinilor de poliovirus salbatic de tip 2 a fost ultima data identificata in octombrie 1999 totusi tulpini  circulante derivate din vaccin (VDPV) de tip 2 au fost identificate in Nigeria incepand cu anul 2006. Strategia OMS pentru anul 2007 a cuprins utilizarea in arii selectate cu risc endemic a vaccinului oral monovalent de tip 1 (mVPO 1) pentru eliminarea tipului 1 de poliovirus salbatic inaintea eliminarii tipului 3 de PV salbatic si utilizarea tintita a vaccinului monovalent tip 3 (mVPO3) .

    Planul Strategic de Eradicare a Poliomielitei pentru perioada 2009-2013 cuprinde noi instrumente si tactici dezvoltate pentru intreruperea circulatiei tipului 1 si 3 de poliovirus salbatic in regiunile unde circulatia acestuia a fost identificata, pentru sustinerea unui nivel inalt al supravegherii epidemiologice si de laborator pentru cazurile de paralizie acuta flasca (PAF), pentru realizarea Certificarii si  pastrarii in siguranta a tulpinilor de poliovirus salbatic  precum si pentru eliminarea cazurilor de poliomielita paralitica asociata vaccinarii (VAPP) si a tulpinilor de poliovirus derivate din vaccin (VDPV)  urmate de pregatirea pentru faza post vaccinare cu vaccin polio oral (VPO). Vaccinarea de rutina ramane unul din obiectivele majore ale procesului de Eradicare; la nivel global acoperirea vaccinala cu 3 doze de vaccin polio oral trivalent (VPOT) a copiilor a fost estimata la 80% in anul 2006. La nivel regional estimarea OMS privind acoperirea vaccinala a fost de: 65% in Asia de Sud-Est, 75% Africa, 86% Mediterana de Est ,>93% in Pacificul de Vest, Europa si America, 77% in Afghanistan, 58% in India, 61% in Nigeria si 83% in Pakistan.

    In iunie 2009 Comitetul de Avizare a Eradicarii Poliomielitei a recomandat introducerea in ariile cu risc a unui vaccin nou bivalent oral b OPV ( continand tipurile 1 si 3 de poliovirus) alaturi de  vaccinurile orale monovalent si trivalent. Riscul emergenţei şi circulaţiei tulpinilor VDPV rămâne o problemă pentru populaţia vaccinată de rutină cu VPO, chiar şi în acele părţi ale lumii în care circulaţia tulpinilor de poliovirus sălbatic a fost stopată; el este favorizat mai ales de existenţa unor grupuri mici populaţionale care trăiesc în condiţii socio-economice şi igienice precare şi la care acoperirea vaccinală nu este corespunzătoare, in grupuri care refuza vaccinarea din motive religioase.

    Marea majoritate a tarilor au trecut la schema de vaccinare direct cu vaccin polio inactivat (VPI) sau au adoptat o schema tranzitorie de vaccinare VPI-VPOT (vaccin polio oral trivalent) urmată de vaccinarea numai cu VPI. VPI conferă protecţie individuală tuturor vaccinaţilor (min. 2 doze) iar administrarea ulterioară a una sau 2 doze VPOT completează imunitatea cu componenta ei locală intestinală, reducându-se foarte mult riscurile apariţiei cazurilor VAPP. Utilizarea numai a VPI exclude orice risc al aparitiei cazurilor VAPP sau tulpinilor VDPV. Din pacate mai exista probleme logistice, financiare si chiar stiintifice care au impiedicat introducerea vaccinarii cu VPI la nivel global.

    Situatia la nivel national – Scurt istoric

    România a introdus supravegherea poliomielitei paralitice la nivel naţional în 1949, dezvoltând şi menţinând un sistem de supraveghere cuprinzător din 1970 si a introdus supravegherea cazurilor de PAF în mai 1992, în conformitate cu recomandările OMS (Manual OMS, 1997, 2004). Supravegherea vizează investigarea tuturor cazurilor de paralizie acută flască (PAF) aparute la copii sub 15 ani, inclusiv cu sindromul Guillain –Barre. In cadrul acestei supravegheri pentru fiecare caz suspectat de PAF se investighează virologic şi 5 contacţi sănătoşi cu vârsta de până la 5 ani. Investigarea virologică se realizează în cadrul Centrului Naţional de Referinţă pentru Enterovirusuri (CNRE) din cadrul INCDMI „Cantacuzino” respectându-se protocolul standard recomandat de OMS. Deoarece se vizează şi studierea circulaţiei enterovirusurilor non polio alături de poliovirus pe teritoriul României, protocolul standard utilizat în cadrul Centrului National de Referinta pentru Enterovirusuri (CNRE) este mai extins decât minimul recomandat de OMS, gama produselor patologice investigate fiind mai diversă.

    Aspectul evoluţiei poliomielitei în perioada 1927-1960 a fost sporadică şi  epidemică, morbiditatea înregistrată pentru această perioadă fiind de 5 cazuri /100 000 locuitori. În  anii 1927,1946, 1953-1959 evoluţia a avut caracter epidemic, în special în anul 1957, indicele de morbiditate fiind mai mare de 15 0/0000.  Introducerea şi utilizarea amplă a VPI în 1957 şi a VPO în 1961 a fost urmată de eliminarea virtuală a poliomielitei. Incidenţa raportată a poliomielitei paralitice a scăzut de la aproximativ 10 cazuri la 100 000 locuitori în 1949 la 0,1 cazuri la 100 000 locuitori la mijlocul anului 1980  (Strebel PM, Aubert-Combiescu A, 1994). In Romania incepand cu anii 60 vaccinarea cu VPO s-a făcut iniţial sub formă de campanii naţionale: toţi copiii care împliniseră vârsta minimă de vaccinare până la data campaniei din anul (sezonul) respectiv primeau câte două doze de vaccin la două luni interval. Campania consta din două runde, fiecare având o durată de 7-10 zile maximum. Cea de-a treia doză prevăzută prin programul naţional de vaccinări se administra în prima rundă a campaniei următoare. Deoarece în anii 60 nu exista o reţea de frig care să permită păstrarea stocurilor de vaccin în stare congelată la – 200 C, fie şi la nivelul centrelor regionale de sănătate publică, singura soluţie era vaccinarea tuturor copiilor într-un interval cât mai scurt de timp cu vaccin adus de la depozitul central din Institutul Cantacuzino în camioane frigorifice. La noi în ţară s-a organizat câte o singură campanie pe an în perioada 1961-1978 şi câte două campanii în perioada 1980-1993. În 1969-1970 s-a trecut şi la noi la prepararea de vaccin oral trivalent compensat (VPOT), care ţine cont de „infecţiozitatea” (capacitatea de implantare în intestin) inegală a celor 3 tulpini Sabin. O doză de VPO „compensat“ conţine 1 000 000 DCP/50 de virus Sabin 1, 40 000-80 000  DCP/50 de tip 2 şi 250 000-500 000 DCP/50 de tip 3. La câţiva ani de la introducerea VPO pe scară largă s-au înregistrat scăderi spectaculare ale incidenţei cazurilor de poliomielită paralitică, de ordinul a 99%, dar au început să apară cazuri de poliomieltă paralitică  asociată vaccinării  (VAPP). Începând cu 1970 România a participat pentru o perioadă de 15 ani, împreună cu alte 11 state la un studiu colaborativ OMS privind riscul apariţiei cazurilor de VAPP . Între 1970-1978 au apărut cazuri de VAPP cu o medie anuală de 16,9 (7,1 la recipienţi-copii vaccinaţi  şi 9,8 la contacţi-copii nevaccinaţi care se infectau cu virusul excretat de vaccinaţi) (Combiescu AA, lucrare nepublicată). Pentru a demonstra că factorul de risc VAPP la noi nu este dependent de anume proprietăţi intrinseci ale vaccinului, autorităţile sanitare din România ( Laboratorul de Control al Serurilor şi Vaccinurilor, Ministerul Sănătăţii ) au hotărât în 1978, stoparea utilizării stocurilor de vaccin existente (preparate cu virusurile de sămânţă OMS primite în 1974) în vederea utilizării unui VPOT în care componentele să fie preparate cu un nou virus de sămânţă OMS –B ( Behring).

    În 1983 a fost introdus sistemul de vaccinare în 2 campanii anuale (primăvară, toamnă) fiecare defăşurându-se în 2 runde, 25-29 martie, 25-29 mai, respectiv 25-29 septembrie, 25-29 noiembrie. Schema de vaccinare era concepută astfel încât fiecare copil să primească 4 doze VPO în primii 10 ani de viaţă. Copiii născuţi între timp, primeau o doză de VPOT, fiind reluaţi apoi cu primovaccinare completă în campania următoare. În Noiembrie 1990 VPO produs în Institutul Cantacuzino a fost înlocuit cu VPO produs în Europa Occidentală şi aprobat de OMS, datorită ratei crescute de VAPP apărute în România pe o perioadă mai mare de două decade. În România în perioada 1984-1992 riscul estimat al apariţiei VAPP a fost 1 caz la 183 000 doze VPO (de 14 ori mai mare decât riscul estimat în Statele Unite pe baza datelor de supraveghere  Explicaţia riscului crescut de apariţie a cazurilor VAPP în România s-a bazat pe rezultatele studiului organizat cu ajutorul OMS şi a Programului PolioPlus – Rotary Internaţional, care a demonstrat că vaccinul produs în România nu a avut o neurovirulenţă reziduală ridicată sau o stabilitate genetică scăzută.

    Un studiu caz/control efectuat în cooperare cu CDC – Atlanta a arătat că rata crescută a cazurilor VAPP poate fi dată de excesiva utilizare a injecţiilor  intramusculare cu antibiotice în intervalul de 30 de zile de la primirea VPO, crescând  riscul apariţiei  paraliziei cu un factor de 2 până la 10 ori (paralizia provocată) (Strebel PM , Ion Nedelcu N, Baughman AL, 1995). Din Aprilie 1992 nici un caz produs de poliovirusul sălbatic nu a mai fost raportat, sugerând că transmisia poliovirusului sălbatic a fost întreruptă în România. Din Aprilie 1995 s-a practicat vaccinarea în sistem continuu cu VPOT la 2,4,6,12 luni si 9 ani. Incepand cu anul 2007 numarul cazurilor VAPP a fost 0.  Din septembrie 2008 a fost adoptata schema tranzitorie de vaccinare impotriva poliomielitei  VPI/VPO, pentru ca apoi cu incepere din 2009 sa se stabileasca utilizarea vaccinului VPI la 2, 4, 6, 13-15 luni si apoi la 9 ani

    Supravegherea de laborator a cazurilor PAF

    Supravegherea cazurilor de PAF este realizata prin diagnosticul de laborator virologic la nivelul CNRE acreditat OMS, din cadrul Centrului National de Expertiza in Microbiologie Medicala – INCDMI Cantacuzino si este coordonata epidemiologic  de expertii epidemiologi din cadrul Centrului Pentru Prevenirea si Controlul Bolilor Transmisibile ISP Bucuresti si de expertii din cadrul Ministerului Sanatatii Publice.

    In cadrul procesului de supravegherea a cazurilor PAF in perioada 2007-2009 au fost investigate virologic probe de la 55 de cazuri PAF, 110 cazuri cu paralizie faciala si 674 contacti sanatosi. Au fost izolate 9 tulpini de poliovirus in majoritate de la copii sanatosi vaccinati recent care s-au dovedit a fi vaccinale in urma investigatiilor moleculare.

    In iunie 2002 , la o luna de la Certificarea Europei „polio free” a fost semnala in urma izolarii, circulatia unei tulpini derivate din vaccin VDPV recombinant Sabin 1/Sabin2/Sabin 1 intr-o populatie minoritara (Babdag- Tulcea) la care acoperirea vaccinala impotriva poliomielitei era < 50%. Avand in vedere acest eveniment epidemiologic, impreuna cu cu colegii din cadru Retelei Internationale a Institutelor Pasteur am decis sa investigam in cadrul unui proiect International circulatia tulpinilor de poliovirus in populatia  minoritara  din zona Babadag la 6 ani de la evenimentul epidemiologic din 2002 pentru a vedea implicatiile eventualei aparitii a unor tulpini modificate intr-o tara membra a UE si in contextul procesului de Eradicare Globala a Poliomielitei.

    In perioada 2008 -2009 in fost colectate si investigate virologic probe de la copii  sanatosi  din Babadag cu varste de pana la 15 ani. Rezultatele studiului sunt concretizate intr-unarticol ce este in curs de redactare.

    OBIECTIVE REALIZATE PENTRU FAZA ANULUI 2009

    1.1. EXPERTIZA VIROLOGICA

     

    1.2. EXPERTIZA MOLECULARA

    .

    1.2.1. Tehnica PCR-RFLP

    PCR este o metodă rapidă de amplificare enzimatică a unui fragment specific de ADN. Evaluarea variaţiei genetice a tulpinilor de poliovirus izolate a fost realizată prin analiza polimorfismului segmentelor de ADN provenite dintr-o regiune a genomului (RFLP), ce au urmat revers transcrierii. După amplificare şi digestie enzimatică, migrarea în gel de agaroză permite punerea în evidenţă a unei benzi  suplimentare sau a absenţei altei benzi prin comparaţie cu tulpina vaccinală. Profilurile de restricţie ale tulpinilor vaccinale Sabin sunt conservate de-a lungul pasajelor inter- şi intraumane. Produşii de digestie au fost vizualizati prin migrarea în gel de  agaroză 3% şi au fost evaluate in raport cu un marker de masă moleculară şi o probă  de ADN  nelizat alături de lizate ale tulpinilor de referinţă.

    ¨       Au fost examinate  regiunile  VP3-VP1, VP1-2A, 3D utilizand perechile de amorse UG24-UC1, UG19-UC13, UG17-UC10 (10)

    Secventele nucleotidice ale primerilor

    UG24: (1913)-GACACCATGATTCCCCTTAA-(1932)

    UC1: (2881)-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-(2862)

    UG19: (2870)-GACATGGAATTCACCTTTGTGG-(2891)

    UC13: (3648)-TAGTACTTAGCTTCCATGTA-(3629)

    UG17: (6536)-TCAGTGGCCATGAGAATGGC-(6555)

    UC10: (7464)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-(7441)


    Rezultatele testelor de digestie enzimatica  si analiza profilurilor de restrictie enzimatica pentru tulpinile izolate in anul 2008-2009


    2008

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    23/2/08 PV1

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    366/2/08 PV2

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    453/1/08 PV1

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    454/1/08 PV2

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S1+S2-like

    S1+S2-like

    S1 like

    567/1/08 PV3

    S3-like

    S3-like

    S3-like

    S3-like

    S3-like

    S1/S3-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     


     

     

     Secventierea produsilor de amplificare

    Purificarea produşilor de amplificare

    Secvenţierea prin PCR, integrată în sistemul automat cu fluorocromi permite secvenţierea directă a produsului obţinut prin PCR, fără clonare prealabilă. Principiul reacţiei constă în migrarea în gel de poliacrilamidă a ADN marcat cu 4 fluorocromi diferiţi. Funcţie de mărime, fragmentele de ADN sunt separate, traversează regiunea de la baza gelului, care este  supusă unui fascicul de laser  care îl baleiază în mod continuu. Fluorocromii sunt excitaţi de laser, emiţând fiecare o lungime de undă detectată cu ajutorul unei camere video cuplată la un spectrograf (CDD). Intensitatea emisiilor este colectată sub forma unor semnale electrice. Un program informatic cuplat la secvenţiator, permite analiza automată şi transformarea datelor în secvenţe nucleotidice. Reacţiile au fost făcute pe un secvenţiator automat (ABI Prism–Applied Biosystems) ce utilizează markeri fluorescenţi şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă.Produşii PCR au fost secvenţiaţi folosind primerii utilizaţi în tehnica PCR. Înaintea secvenţierii, produşii PCR au fost purificaţi direct după amplificare folosind coloanele Qiagen (QIAquick Spin Handbook – QIAquick PCR purification Kit) sau prin izolarea din benzile obţinute după migrarea produşilor PCR în gel de agaroză (QIAquick Spin  Handbook – QIAquick Gel Extraction  Kit). Secvenţierea nucleotidică a fost efectuată la Institutul Cantacuzino,  Laboratorul de Microbiologie Moleculara, si a fost confirmata de Institutul Pasteur Paris , pe un secvenţiator automat ABI 3100 Avant  (Applied Biosystems) care utilizează markeri fluorescenţi multipli şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă. În reacţia de secvenţiere s-a utilizat kitul „ABI Prism BigDye terminator v.3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems) ce conţine dNTPs, ddNTPs marcate, tampon, polimerază. S-a avut în vedere secvenţierea fiecarei catene de ADN, prin utilizarea unui singur primer inclus in reactie, sens sau antisens. Cantitatea de matriţă ADN adăugată în reacţia de secvenţiere depinde de mărimea ampliconului şi de calitatea ampliconului (concentraţie şi puritate). Astfel, pentru ampliconi de 0.1-2kpb se aplică regula: pentru fiecare 100pb (perechi de baze azotate) ale ampliconului se adaugă 10 ng matriţă. Cantitatea de ADN din probe a fost apreciată prin comparare cu un marker cantitativ (MassRulerTM Express DNA Ladder Mix, Forward), apreciindu-se la aproximativ 20 ng/μL. ADN purificat a fost diluat (cu apă distilată) astfel încât cantitatea necesară să se regăsească într-un volum de 6 μL.

    Concluzie :

    Toate tulpinile de poliovirus  izolate pe teritoriul Romaniei in perioada 2008-2009 au prezentat in urma investigatiilor moleculare RT-PCR-RFLP in regiunile VP1-2A, VP3-VP1, secventiere in regiunea VP1-2A  profiluri Sabin-like (au fost tulpini vaccinale). Investigarea regiunii 3D atat prin RFLP cat si prin secventiere au evidentiat aparitia recombinantilor dar numai intre tulpini vaccinale fapt care nu a creat conditii pentru cresterea neurovirulentei acestor tulpini.  Au fost secventiate si tulpini de EVNP izolate in aceeasi perioada si s-a constat circulatia  tulpinilor de ECHO 7. Capacitatea de detectie, investigare rapida si  aducerea la zi a  diagnosticului ramane un standard impus de OMS, dar care trebuie asigurat de fiecare tara. In acest sens prin derularea acestui proiect a crescut capacitatea de raspuns rapid in  cazul unor  situatii epidemiologice speciale.

    Pe durata derularii proiectului au fost implicati in activitatea de cercetare:  2 studenti  UMF Carol Davila :  A. Soare, N. Grecu, 1 asistent de cercetare, 1 student Facultatea de biologie



    FAZA DE RAPORTARE  2008

    Evenimente aparute in Romania in contextul supravegherii cazurilor PAF  

    In Romania supravegherea cazurilor de PAF este realizata prin diagnosticul virologic la nivelul Laboratorului infectii enterice virale acreditat OMS, din cadrul Centrului National de Expertiza in Microbiologie Medicala – INCDMI Cantacuzino.

    In anul 2007 au fost investigate produse patologice recoltate de la 25 cazuri PAF, 48 cazuri de paralizie faciala si de la 300 de contacti sanatosi cu varsta < 5ani. Au fost identificate 4 tulpini de poliovirus si 49 tulpini de EVNP. In perioada iunie –noiembrie  2007 in contextul unei epidemii de meningita acuta cu lichid clar  la nivelul a 36 de judete si Municipiul Bucuresti au fost investigate in cadrul laboratorului probe de materii fecale si /sau LCR recoltate  de la 1150 de cazuri cu meningita acuta virala cu lichid clar, confirmate ca  avand etiologie enterovirala ( ECHO 4; LCR +)  214 cazuri (11). In acel moment s-a reliefat foarte clar necesitatea introducerii unei tehnicii de diagnostic rapid. Tehnica de biologie moleculara (secventiere la nivelul genomului) a fost aplicata in cadrul Laboratorului de Microbiologie Moleculara pentru confirmarea rezultatului obtinut prin tehnica clasica de seroneutralizare cu seruri polivalente respectiv monovalente fata de enterovirusurile non polio. Confirmarile s-au realizat si pe parcursul anului 2008 incercandu-se in continuarea gasirea unei solutii de diagnostic cat mai rapid in situatii epidemice. In anul 2008 au fost izolate doar 2 tulpini de PV.S-a constatat o scadere a numarului tulpinilor de PV izolate pe teritoriul Romaniei in perioada 2007-2008.Au predominat serotipurile de PV1 ( 4 tulpini), tipurile 2 si 3 au fost izolate da la cate un copil. Profilurile dupa investigarea in regiunea VP1-2A au fost Sabin –like, in regiunea VP3-VP1 o tulpina a prezentat  mutatii eveniment confirmat si prin tehnica de secventiere. Pentru investigarea regiunii 3 D  tulpina 25/2/07 a prezentat profil Sabin 3/Sabin2; tulpina 52/1/07 a prezentat un profil S2/S1(tab.5).Prin tehnica de secventiere a tulpinilor de PV izolate in anul 2007 s-a constatat  ca inafara de secventa 1P – de tip Sabin 3 si care prezinta mai multe mutatii in regiunea capsidei virale, celelalte 3 secvente investigate sunt de tip Sabin 1, mai stabile genetic si cu omologie de 99% fata de tulpina vaccinala de referinta.Expertiza epidemiologica a reliefat pentru perioada 2007-2008 absenta cazurilor de poliomielita paralitica asociata vaccinarii (VAPP)

    OBIECTIVE REALIZATE PENTRU FAZA ANULUI 2008

     

     

    1. 1.EXPERTIZA VIROLOGICA

    • Preparare si intretinere linii celulare L20B, RD (testarea puritatii, stabilitatii, autenticitatii)
    • Stabilirea sensibilitatii liniilor celulare (L20B, RD) fata de tulpinile Sabin
    • Multiplicarea tulpinilor de poliovirusuri de referinta cu titrarea tulpinilor Sabin



    1.2. EXPERTIZA MOLECULARA

    Genomul enterovirusurilor prezintă zone extrem de variabile, care alternează cu zone conservate. Acestea din urmă pot fi utilizate pentru construirea unor sonde nucleotidice sau a unor primeri utilizaţi pentru amplificarea prin PCR. Aceste zone conservate se constituie deci în adevăraţi markeri moleculari, utilizabili în diagnosticul enterovirusurilor prin metodele moderne cum sunt hibridizare moleculară, PCR sau secvenţiere, care au cunoscut o dezvoltare continuă în ultimile decenii. Aplicaţiile tehnicii PCR se pot încadra în două grupe: cele în care se utilizează PCR preparativ pentru sinteza ADN (RT-PCR, secvenţiere, clonare, sinteza şi marcarea sondelor) şi cele analitice cum sunt: diagnosticul factorilor infectioşi, al bolilor genetice, epidemiologia moleculară, tehnici moleculare din medicina legală etc., care fac apel la anumiţi markeri moleculari, în funcţie de scopul propus.

    Tipizarea virusurilor este necesară atât pentru investigaţii epidemiologice, pentru identificarea tipurilor de virusuri cu virulenţă crescută sau cu anumite caracteristici patogene şi stabilirea corelaţiilor cu imunitatea virală dar şi în analiza taxonomică, pentru obţinerea informaţiilor privind relaţiile filogenetice dintre virusuri. Noile tehnici moleculare şi în special PCR au permis dezvoltarea unor metode de tipare moleculară, complementare metodelor tradiţionale de tipare pe bază fenotipică.

    În ciuda numărului mare de serotipuri enterovirale şi a gradului ridicat de variabilitate antigenică, serotipurile sunt stabile, reflectând probabil conservarea epitopilor importanţi pentru structura şi funcţia capsidei. În consecinţă, se pot identifica determinanţi genetici pentru fiecare serotip. Serotipurile sunt definite prin epitopii de neutralizare localizaţi în proteinele capsidei virale, în special pe VP1 dar şi pe VP2 şi VP3. Unii determinanţi de neutralizare ai PV sunt dependenţi de conformaţia proteinelor capsidei, care ajung în vecinătate prin pliere către suprafaţa virusului. Datorită acestei conformaţii de tip contiguu a determinanţilor de neutralizare s-a considerat, până nu demult, dificilă identificarea serotipului viral numai pe baza secvenţei de acizi nucleici. Recent, diferiţi autori au pus la punct sisteme de “serotipare” moleculară prin PCR şi secvenţiere, pe baza unor markeri moleculari situaţi în proteina capsidei virale VP1 (Oberste et al., 1999c; Caro et al., 2001).

    Poliovirusurile prezintă o variabilitate legată de incapacitatea polimerazei virale de corectare a incorporării greşite a nucleotidelor, ceea ce determină apariţia de mutaţii punctiforme, cu o frecvenţă medie de 10-4. Practic fiecare doză de VPO cu cele 3 serotipuri de poliovirus atenuat, conţine un procent de genoame mutante “contaminante”, critice pentru stabilitatea atenuării. Tipul 3 de poliovirus atenuat pare a fi cel mai putin stabil. O explicaţie ar fi că, pentru obţinerea tulpinii atenuate, este nevoie de un număr mic de substituţii de nucleotide, astfel că este favorizată selectarea cu uşurinţă a revertanţilor neurovirulenţi. Astfel, din 10 nucleotide care diferenţiază tulpina Sabin 3 de tulpina sălbatică neurovirulentă, numai două par să contribuie la atenuare: poziţia U452 din 5’NCR şi U2034 din VP3. Reversia U452 >C este însoţită de o creştere a neurovirulenţei şi conferă aparent un avantaj selectiv. Tulpina Sabin 2 a fost derivată dintr-o tulpină sălbatică cu neurovirulenţă scăzută. Până în prezent, numai două poziţii nucleotidice au fost considerate importante pentru fenotipul atenuat. Acestea sunt localizate în 5’NCR (A481) şi în regiunea capsidei din VP3 (U2908). Tulpina Sabin 1 este considerată cea mai stabilă din VPO. Foarte puţine cazuri au fost semnalate cu aceasta tulpină (Minor, 1992). Toate aceste poziţii nucleotidice, care suferă mutaţii în cele 3 tulpini vaccinale Sabin, se constituie în tot atîţia markeri moleculari, pentru identificarea revertanţilor la neurovirulenţă prin RT-PCR, RFLP si secventiere. Mutaţiile care intervin în atenuare sunt de fapt mult mai numeroase şi sunt răspîndite pe întregul genom. Aceasta este, deci, o metodă pentru determinarea rolului tulpinilor Sabin în patogeneza cazurilor de paralizie persistentă asociată vaccinării (PPAV), prin evaluarea stabilităţii nucleotidelor critice pentru fenotipul atenuat la virusurile izolate de la pacienţi.

    1.2.1. Tehnica PCR-RFLP

    ¨       Au fost examinate  regiunile  VP3-VP1, VP1-2A, 3D utilizand perechile de amorse UG24-UC1, UG19-UC13, UG17-UC10 (10)

    Rezultatele testelor de digestie enzimatica  si analiza profilurilor de restrictie enzimatica pentru tulpinile izolate in anul 2007 -2008


    Tulpini PV

    RFLP VP1-2A

    RFLP 3D

    RFLP        VP3-VP1

     

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    RsaI

    DdeI

    HinfI

    25/2/07PV3

    S3-like

    S3-like

    S3-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S3like +banda suplimentara

    S3like

    S3like

    52/1/07PV2

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    1552/3/07PV1

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    1572/2/07PV1

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    23/2/08 PV1

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    S1-like

    366/2/08 PV2

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like

    S2-like


     

     



      

     

     

     

     

     

     

     


     


    1.2.2 Secventierea produsilor de amplificare  

    1.2.2.1.Purificarea produşilor de amplificare

    Probe analizate : 25/2/07 PV3; 52/1/07 PV1, 1552/3/07PV1, !572/2/07PV1

    Produşii PCR au fost purificaţi în vederea secvenţierii cu kit Qiagen. Acest protocol permite purificarea ADN dublu şi monocatenar, cu dimensiuni cuprinse între 100 pb şi 10 kb. Produşii PCR au fost transferaţi pe coloane, după adăugarea a 5 volume de tampon PB la 1 volum de produs PCR şi centrifugaţi la o viteză de     13 000 rpm (1 min) pentru fixarea acizilor nucleici pe membrana din coloane. Coloanele au fost apoi spălate cu 750 ml de tampon PE (la care se adaugă etanol 100%  la prima deschidere a flaconului) şi centrifugate ca mai sus. Eluatul a fost eliminat într-un tub colector de 2 ml. S-a procedat la o centrifugare suplimentară de 1 min la aceeaşi viteză, pentru a se elimina etanolul rezidual din tamponul PE. În final, ADN a fost eluat într-un tub Eppendorf de 1,5 ml cu 50 ml de tampon EB (Tris HCl 10 mM pH 8,5) plasat pe centrul coloanei, prin centrifugare timp de 1 min la 13 000 rpm. ADN obţinut a fost stocat la -20°C până la utilizarea sa pentru secvenţiere.

    Pentru obţinerea unor electroforegrame de calitate prin secvenţiere, a fost necesară purificarea produşilor PCR care prezentau benzi suplimentare, nespecifice. Produşii PCR au fost purificaţi prin tehnica de migrare în gel de agaroză si excizarea benzilor de interes.


    1.2.2.2.Determinarea secvenţei acizilor nucleici

     Metoda de secvenţiere folosită în prezent este cea enzimatică, dezvoltată de Sanger. Această metodă se bazează pe utilizarea unor nucleotide modificate, 2′,3’didezoxiribonucleotid trifosfaţi (ddNTP), care joacă rolul de terminatori de lanţ în timpul reacţiei de polimerizare enzimatică a ADN. Datorită acţiunii ADN polimerazelor, ddNTP-urile sunt încorporate în catena în curs de elongare a ADN aşa cum sunt utilizate dNTP-urile normale. Diferenţa constă în faptul că un ddNTP încorporat declanşează, la un moment dat, blocarea elongării.

    Secvenţierea nucleotidică a fost efectuată la Institutul Cantacuzino, Laboratorul de Microbiologie Moleculara, pe un secvenţiator automat ABI 3100 Avant  (Applied Biosystems) care utilizează markeri fluorescenţi multipli şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă. În reacţia de secvenţiere s-a utilizat kitul „ABI Prism BigDye terminator v.3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems) ce conţine dNTPs, ddNTPs marcate, tampon, polimerază. S-a avut în vedere secvenţierea fiecarei catene de ADN, prin utilizarea unui singur primer inclus in reactie, sens sau antisens.

    Cantitatea de matriţă ADN adăugată în reacţia de secvenţiere depinde de mărimea ampliconului şi de calitatea ampliconului (concentraţie şi puritate). Astfel, pentru ampliconi de 0.1-2kpb se aplică regula: pentru fiecare 100pb (perechi de baze azotate) ale ampliconului se adaugă 10 ng matriţă. Cantitatea de ADN din probe a fost apreciată prin comparare cu un marker cantitativ (MassRulerTM Express DNA Ladder Mix, Forward), apreciindu-se la aproximativ 20 ng/μL. ADN purificat a fost diluat (cu apă distilată) astfel încât cantitatea necesară să se regăsească într-un volum de 6 μL.

    Migrarea probelor prin capilare se realizează cu ajutorul injecţiei electrocinetice pe care aparatul o aplică automat, sub acţiunea unei tensiuni electrice şi un anumit timp, aceşti parametrii  fiind deja setaţi. Timpul de injecţie defineşte timpul cât stă proba in capilar şi cantitatea care este injectată în capilar. Laserul excită fluorocromii, care emit fiecare o lungime de undă diferită, detectată de o cameră video cuplată cu un spectrograf (CDD). Prin intermediul unor filtre, datele privind intensitatea emisiilor sunt colectate şi conservate sub forma unor semnale electrice. Un program informatic, cuplat la secvenţiator, permite analiza automatizată şi convertirea directă a datelor în secvenţe nucleotidice.


    1.2.2.3.Analiza computerizata a secventelor

    Secvenţa de ADN, identificată prin diferite tehnici de secvenţiere (radioactive sau neradioactive, automate), este analizată din punctul de vedere al compoziţiei în nucleotide, a zonelor repetitive, pentru determinarea unor motive specifice sau regiuni de control şi, în cazul secvenţelor monocatenare, a unor structuri secundare potenţiale. Dacă secvenţa conţine un cadru deschis de citire (“ORF, open reading frame”), secvenţa dedusă de aminoacizi poate fi analizată pentru utilizarea codonilor (“codon usage”), structuri secundare posibile etc. In acelaşi timp, secvenţele obţinute sunt comparate cu cele deja existente în băncile de date. Pentru stabilirea relaţiei filogenetice cu alte secvenţe se realizează alinieri cu cele cunoscute, rezultatul fiind exprimat grafic sub forma unor arbori.

    Pentru acest studiu am utilizat programele BioEdit, Clustal W, Blast si Mega 4. Arborii filogenetici au fost construiti cu programul TreeView.

    Rezultate poliovirusuri: caracterizarea moleculară a unor tulpini de poliovirusuri în vederea detectării unor variante virale mutante sau a virusurilor recombinante intra- sau interspecifice.

    Ampliconii VP1-2A de poliovirusuri vaccinale au fost secvenţiaţi in ambele sensuri cu primerii sens UG19 si primerii antisens UC13. Cu ajutorul programului BioEdit secventele sens si antisens au fost aliniate si, pe baza acestui aliniament, a fost creata o secventa consens.

    Tulpina 25/2/07 PV

    Secventa 1P consens de 744 pb este de tip Sabin 3. Comparata cu tulpina de referinta Sabin 3 secventa consens se gaseste intre pozitiile nucleotidice 2860 si 3603.

    In secventa de referinta Sabin 3 proteina de capsida VP1 este codificata de pozitiile nucleotidice 2477 si 3376 iar proteina nestructurala 2A este codificata de pozitiile nucleotidice 3377 – 3823.

    Prin alinierea secventei  1P consens cu secventa de referinta Sabin 3 au fost identificate citeva pozitii in care apar mutatii punctiforme:  in regiunea genomica VP1: 2878 C>T; 2971 si 2973 A>G; 3269 G>A. In regiunea genomica 2A (mai consevata decit regiunea codificatoare a capsidei) a fost semnalata o singura mutatie: 3496 G>A. Aceste mutatii nu apar in pozitiile cheie de reversie la virulenta pentru tulpinile de poliovirus vaccinale de tip 3. Pe de alta parte aceste mutatii nu se traduc in modificarea structurii proteinei deoarece sunt de tip tranzitie (intre acelasi tip de baze: purinice – G sau A sau pirimidinice – C sau T) (Fig. 1). Mutatiile de tip transversie apar numai cind se modifica o baza purinica intr-una pirimidinica si invers.

    Tulpina 52/1/07 PV1. Secventa 2 P consens, obtinuta din alinierea secventelor 2P sens si antisens, asa cum a fost prezentat mai sus, este de tip Sabin 1 si este asemanatoare cu aceasta in proportie de 99%. Singura mutatie a probei 2  fata de secventa Sabin 1 vaccinala este in pozitia 3589 din proteina 2A si este tot de tip tranzitie (G>A)

    Tulpina 1552/3/07PV1

    Secventa 3 P consens prezinta un scor de 99% cu Sabin 1 vaccinal (intre pozitiile nucleotidice 2915 si 3636 ale secventei acestuia). Singura diferenta apara ca amestec de cvasispecii in pozitia 3106 (pozitie degenerata Y, amestec de nucleotide C cu T) din secventa nucleotidica care codifica proteina de capsida VP1.

    Tulpina 1572/2/07PV1

    Secventa 4 P consens este tot de tip Sabin 1, cu o omologie de 99% datorata unei pozitii degenerate (M = amestec de nucleotide A cu C) la 3125 si unei mutatii de tip tranzitie in pozitia nucleotidica 3535 A>G. Secventa investigata se gaseste intre pozitiile nulceotidice 2920 si 3647 din Secventa Sabin 1.

    In concluzie, in afara de secventa 1P – de tip Sabin 3 si care prezinta mai multe mutatii in regiunea capsidei virale, celelalte 3 secvente investigate sunt de tip Sabin 1, mai stabile genetic si cu omologie de 99% fata de tulpina vaccinala de referinta.

    Tehnica de secventiere a tulpinilor de poliovirus in regiunea VP1-2A a fost optimizata si a permis evaluarea cu acuratete a mutatiilor prezente in tulpinile de poliovirus analizate.




    Bibliografie

    1. 1. Balanant J, Guillot S, Candrea A, Delpeyroux F,  Crainic R. The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment lengtb polymorphism assay. Virology 1991; 184:645-654.
    2. Baicus A, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA. Immune status to polioviruses in the children population of Romania between 2002-2005 as indicated by serological investigation in cases of acute flaccid paralysis (AFP) and facial paralysis (FP) and its use as a “national reference value” to evaluate the vaccination coverage in particular groups of  healthy children. Rev med Chir Soc Med Nat  Iaşi 2006, 110: 1004-11.
    3. Baicus A, Combiescu M, Persu A, Oprişan G, Aubert-Combiescu A, Delpeyroux F. The molecular characterization of poliovirus strains by the RT-PCR-RFLP assay and its use in the active surveillance for acute flaccid paralysis cases in Romania between 2001-2006.Roum Arch Microbiol Immunol. 2006 Jul-Dec;65(3-4):120-30.
    4. Baicus A, Persu A., Popa MI, Baicus C. Immunity status against Coxsackieviruses B in 25 patients with acute myocarditis. Rom Arch Microbiol Immunol 2006; în vol. Nr. 3-4, 2006.
    5. Baicus A, Persu A, Combiescu M  , Aubert-Combiescu A.  .The maintaining of the active laboratory-based surveillance of the acute flaccid paralysis (AFP) cases in Romania in the framework of the strategic plan of the global polio eradication initiative. Rom Arch Microbiol Immunol. 2007 Jan-Jun;66(1-2):44-50
    6. Centers for Disease Control and Prevention. Certification of Poliomyelitis Eradication-European Region. Morbidity and Mortality weekly Report. 2002; 51: 572-4.
    7. Combiescu M, Guillot S, Persu A, Baicuş A, Pitigoi D, Balanant J, Oprisan G, Crainic R, Delpeyroux F, Combiescu AA. Circulation of a type 1 recombinant vaccine-derived poliovirus strain in a limited area in Romania Arch Virol. 2007;152(4):727-38. Epub 2007
    8. Georgescu MM, Balanant J, Macadam A, Otelea D, Combiescu M, Combiescu AA, Crainic R, Delpeyroux F. Evolution of the Sabin type 1 poliovirus in humans: characterization of strains isolated from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J. Virol. 1997; 71: 7758-776848.
    9. Global Polio Eradication Initiative Strategic Plan 2004-2008.WHO 2003.
    10. Global Polio Eradication Initiative., Monthly Situation Report (online), Geneva: WHO, 2009.
    11. Guillot S, Caro V, Cuervo N, Korotkova E, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Delpeyroux F, Crainic R. Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol 2000; 74: 8434-8443.
    12. Guillot S, Otelea D, Delpeyroux F, Crainic R.Point mutation involved in the attenuation /neurovirulence alternation in type 1 and 2 oral polio vaccine strains detected by site- specific polymerase chain reaction. Vaccine 1994; 12: 503-507.
    13. Nedelcu NI, Strebel PM, Toma F, Moroeanu SB, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Plotkin SA, Sutter RW. Sequential and Combined use of inactivated and oral poliovirus vaccines: Dolj district, Romania, 1992-1994. J of Infectious Diseases. 1997;175(Suppl 1): S241-6.
    14. Otelea D, Guillot S, Furione M, Combiescu AA, Balanant J, Candrea A, Crainic R. Genomic modifications in naturally occuring neurovirulent revertants of Sabin 1 polioviruses. Dev Biol  Stand 1993; 78: 33-38.
    15. Strebel PM Combiescu AA., Nedelcu  IN, et al. Paralytic poliomyelitis in Romania , 1984-1992: evidence for a high risk of vaccine-associated disease and reintroduction of wild –virus infection. Am J Epidemiol. 1994; 140: 1111-24.
    16. Strebel PM, Nedelcu IN, Baughman AL, Sutter RW, Cochi SL. Intramuscular injections within 30 days of immunization with oral poliovirus vaccine—a risk factor for vaccine-associated paralytic poliomyelitis. N Engl J Med. 1995; 332: 500–06.
    17. WHO Expanded Programme on Immunization. Global eradication of poliomyelitis by the year 2000. Weekly Epidemiological Record 1988; 63: 161-162.
    18. WHO. Progress towards the global eradication of poliomyelilis, 2002. Wkly. Epidemiol. Rec 2003; 78: 138-144.
    19. Wright PF , Kim –Farley  RJ, De Quadros CA, Robertson SE, Scott RM , Ward NA, Henderson RH. Strategies for the global eradication of poliomyelitis by the year 2000. N. Engl. J. Med. 1991; 325: 1774-1779.
    20. WHO, Polio laboratory manual WHO/IVB/04.10, WHO, Geneva, Switzerland, 1997/2004.
    21. Centers for Disease Control and Prevention, Progress toward interruption of wild Poliovirus transmission-worldwide, 2008, MMWR, 58, 308, 2009.
    22. WHO, Global polio eradication initiative strategic plan 2009-2013, Euro Immunization Monitor, 4, 2009.
    23. Centers for Disease Control and Prevention, Poliovirus infections in four unvaccinated children, Minnesota, MMWR, 54, 1, 2005.
    24. WHO, Summary of discussions and recommendations of the 13th informal consultation of the WHO Global Polio Laboratory Network, Weekly Epidemiol. Rec., 82, 297, 2007.