LABORATOR ENZIMOLOGIE SI MICROBIOLOGIE APLICATA

Sef Laborator : Nadia Bucurenci, PhD, CS I, nadiab@cantacuzino.ro

Personal permanent:

Adrian Onu, PhD, CS I, Adrian.Onu@cantacuzino.ro
Adriana Zoe Costache, Drd., CS III, aradulescu@cantacuzino.ro
Ana-Maria Eftimie, MS, CS, aeftimie@cantacuzino.ro
Florina Toma, MS, Drd., CS, tflorina@cantacuzino.ro

Domeniul de Cercetare:
Activitati de baza: clonarea, purificarea si caracterizarea fizico-chimica a proteinelor (enzimelor) bacteriene.

Subiectele majore de studiu :

  • Cautarea de noi tinte terapeutice, din familia nucleozid monofosfat kinazelor, in bacteriile patogene rezistente la antibiotice
  • Noi metode de diagnostic utilizind anticorpi mono sau policlonali sau reactii enzimatice cuplate; obtinerea si purificarea de subunitati de toxine, antigene bacteriene etc.
  • Metode de regenerare enzimatica a ATP sau NADH pentru sinteze enzimatice industriale cu reactii de fosforilare sau oxidare / reducere
  • Implementarea si optimizarea procesului tehnologic de obtinere a serurilor terapeutice cu componenta activa F(ab’)2 fata de agenti inalt patogeni bacterieni si virali

Activitati stiintifice:
UMP kinaze bacteriene din organisme patogene
UMP kinazele bacteriene nu prezinta nici un fel de omologie de secventa cu celelalte NMP kinaze cunoscute, sint hexameri in solutie si activitatea lor enzimatica este supusa unor reglari complexe de catre GTP (activator) si UTP (inhibitor).
Studiile anterioare demonstrasera ca intre UMP kinazele din organisme gram pozitive si cele din organisme gram negative exista diferente importante. Am aprofundat acest subiect si am testat comportamentul cinetic al UMP kinazelor din S.aureus, E.faecalis, P.aeruginosa (enzime clonate anterior in institutul nostru) in special in ceea ce priveste reglarea activitatii enzimatice de catre GTP si UTP.
Datele cinetice au fost confirmate de analiza structurii cristaline a UMP kinazei din E.coli realizata de I.Pasteur – Paris in colaborare cu alte unitati de cercetare din Franta.
GMP kinaze bacteriene
GMP kinazele din eucariote sint monomeri si au fost mult studiate datorita importantei lor medicale (activeaza analogii de guanozina utilizati in terapia cancerului si a infectiilor virale).
S-a demonstrat recent ca structura GMP kinazei din E.coli (clonata in laboratorul nostru) are caracteristici unice, care o diferentiaza de ortologii din eucariote, inclusiv de enzima murina care este considerata modelul GMP kinazei umane. Extensia C-terminala, prezenta la enzima din E.coli si din alte bacterii inrudite, dar absenta la eucariote, este un determinant critic in formarea unitatii dimerice care sta la baza structurii cuaternare a enzimei.
Gasirea situsului de legare al GDP, care este in conflict steric cu situsul de legare al ATP, poate sta la baza cautarii unor inhibitori specifici pentru GMP kinazele din bacterii patogene.
In unitatea noastra au fost clonate si studiate patru GMP kinaze din bacterii patogene (S.aureus, E.faecalis, P.aeruginosa, S.pneumoniae)

Sisteme regenerative pentru ATP si NADH
In multe sinteze enzimatice sint implicate reactii de fosforilare, in care ATP este donorul de fosfat, sau reactii de transfer de electroni, in care NADH este donorul de electroni. Ambele substante avind un cost ridicat este necesara regenerarea lor in cursul sintezei astfel incit procesele sa fie convenabile din punct de vedere economic.
a) Dintre reactiile posibile de regenerare a ATP am testat cuplul acetat kinaza (AceK) / acetil-fosfat (AcP) ; am folosit AcP sintetizat in laborator sau AcP generat in situ printr-o serie de reactii enzimatice. Am demonstrat fezabilitatea sintezelor de fosforilare a nucleozidelor (Gua) pina la nucleozid trifosfati (GTP), folosind un sistem de regenerare al ATP (AceP generat in situ/ AceK) si enzime recombinante obtinute “in house”.
b) Regenerarea NADH se face intr-un sistem de reactii care pleaca de la NAD si glucoza si utilizeaza doua enzime clonate si purificate de noi: glucozo dehidrogenaza (GDH) si galactozo mutarotaza (GalM). Utilizind acest sistem am reusit sa producem NADH pornind de la NAD cu un randament de aprox. 80%.

Clonarea si purificarea de toxine sau antigene bacteriene in scop diagnostic
Diagnostic rapid al dizenteriei si colitelor hemoragice
Scopul final al proiectului, realizat in colaborare cu institute din cadrul Retelei Institutelor Pasteur si Asociate, este obtinerea de strip-uri pentru diagnosticul rapid al unor agenti enteropatogeni, printre care S. dysenteriae si E.coli O157. Acesti patogeni produc toxina Shiga, respectiv toxina Shiga-like 1 si 2. Toxinele sint compuse din cite 5 subunitati B, care asigura legarea toxinei de celula tinta si o subunitate A, responsabila de activitatea toxica. Participarea noastra la proiect a constat in producerea, purificarea si controlul antigenelor tinta (subunitatile B ale toxinelor).
Subunitatea B a toxinei Shiga, identica cu toxina Shiga-like 1, a fost folosita pentru obtinerea de anticorpi monoclonali iar subunitatea B din toxina Shiga-like 2 pentru testarea unor eventuale reactii incrucisate ale anticorpilor monoclonali obtinuti.

Depistarea antigenelor specifice toxoplasmozei, cu anticorpi monoclonali, la gravidele cu seroconversie
Diagnosticul modern al toxoplasmozei se face prin depistarea antigenelor circulante, fie prin tehnici de tip PCR, fie utilizind anticorpi monoclonali marcati. Proiectul, realizat in colaborare cu alte laboratoare din institut, si-a propus utilizarea nucleozid-trifosfat hidrolazei (NTP-aza) din Toxoplasma gondii ca antigen pentru obtinerea anticorpilor monoclonali.
Primul obiectiv a fost clonarea uneia din izoformele NTP-azei, supraexpresia si purificarea in cantitati suficiente pentru imunizari si detectie. Pentru clonare s-a utilizat ADN-ul genomic din tachizoiti intrucit secventa care codifica NTP-aza nu continea introni Enzima a fost purificata din corpii de incluziune si utilizata ca atare.

Realizarea unui nou test tuberculinic cutanat, cu utilizarea antigenelor recombinante specifice pentru diagnosticul tuberculozei (TB) latente si active
Proiectul, in colaborare cu laboratorul de profil din institut, urmareste realizarea unui nou test tuberculinic cutanat pentru diagnosticul tuberculozei latente si active, prin intradermoreactie (IDR, testul Mantoux). Testul actual, IDR la derivatul proteic purificat (PPD) din Mycobacterium tuberculosis (M.tb), are o specificitate redusa pentru TB. Reactiile incrucisate se datoreaza vaccinarii cu BCG, o tulpina atenuata de M. bovis, sau infectarii cu mycobacterii netuberculoase (NTM).
Dintre proteinele din filtratul de cultura care sint exprimate si/sau secretate doar de M.tb si nu de BCG sau NTM, am clonat patru (ESAT-6, CFP10, MPT64, PPE68). Proteinele vor fi supra-exprimate in E. coli, si testate, ca atare sau in amestec, pentru obtinerea raspunsurilor IDR la cobai sensibilizati cu M.tb H37Rv.

Implementarea si optimizarea procesului tehnologic de obtinere a serurilor terapeutice cu componenta activa F(ab’)2 fata de agenti inalt patogeni bacterieni si virali.
Utilizarea anticorpilor policlonali ca agenti terapeutici cunoaste o revigorare deoarece acestia asigura o protectie semnficativa dupa expunerea la un agent toxic, in absenta unei vaccinari anterioare sau cind raspunsul imun este foarte scazut. Utilizarea exclusiva a fragmentelor F(ab’)2 bivalente comparativ cu utilizarea imunoglobulinei integrale reduce semnificativ reactiile de hipersensibilitate si sporeste gradul de siguranta a produsului final.
Obiectivul major al proiectului este punerea la punct, pe scara de laborator, a procedurilor de obtinere a unor seruri terapeutice, cu componenta activa reprezentata de fragmente F(ab’)2 bivalente, rezultate prin digestia enzimatica cu pepsina, in mediu acid, a plasmei (serului) hiperimune fata de agenti inalt patogeni bacterieni si virali (Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Influenza virus H5N1), cu rol potential in biosiguranta nationala. Avantajul major al metodologiei ce urmeaza a fi elaborata deriva din plasticitatea procedeului tehnologic care va putea fi adaptat pentru productia de seruri terapeutice fata de diferite antigene.

Toate aceste cercetari au fost finantate prin contracte de cercetare nationale (in cadrul programelor BIOTECH , VIASAN, Parteneriate in Domenii Prioritare) sau internationale (in cadrul Retelei Institutelor Pasteur si Asociate)

Publicatii (2000 – 2008):

  • Genetic and Biochemical Characterization of Salmonella enterica Serovar Typhi Deoxyribokinase – L.Tourneux, N.Bucurenci, C.Saveanu, P.A.Kaminski, M.Bouzon, E.Pistotnik, A.Namane, P.Marliere, O.Barzu, I.L.de la Sierra, J.Neuhard, A.M.Gilles, 2000, J.Bact., 182(4), 869 – 873
  • Sugar specificity of bacterial CMP kinases revealed by crystal structures and mutagenesis of Escherichia coli enzyme – T.Bertrand, P.Briozzo, L.Assairi, A.Ofiteru, N.Bucurenci, H.Munier-Lehmann, B.Golinelli-Pimpaneau, O.Barzu, A-M.Gilles, 2002, J.Mol.Biol., 315, 1099-1110
  • Comparative modelling and immunochemical reactivity of Escherichia coli UMP kinase – G.Labesse, N.Bucurenci, D.Douguet, H.Sakamoto, S.Landais, C.Gagyi, A-M.Gilles, O.Barzu, 2002, Biochem.Biophys.Res.Commun., 294, 173-179
  • UMP kinase from the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis is strongly dependent on GTP for optimal activity – Cristina Gagyi, Nadia Bucurenci, Ovidiu Sirbu, Gilles Labesse, Mihaela Ionescu, Augustin Ofiteru,Liliane Assairi, Stephanie Landais, Antoine Danchin, Octavian Barzu and Anne-Marie Gilles, 2003, Eur.J.Biochem., 270, 3196–3204
  • Factors associated with virulence and survival in environmental and clinical isolates of Vibrio cholerae 01 and non 01 in Romania – Anca Israil, Carmen Balotescu, Nadia Bucurenci, Nadia Nacescu, Claudia Cedru, Cornelia Popa, C.Ciufecu, 2003, Roum. Arch. Microbiol. Immunol., 62(3-4), 155-177
  • Comparative study of different methods for detection of toxic and other enzymatic factors in Vibrio cholerae strains – Anca Israil, Carmen Balotescu, Maria Damian, Cristina Dinu and Nadia Bucurenci, 2004, Roum. Arch. Microbiol. Immunol., 63 (1-2), 63-77
  • Characterization of Vibrio cholerae strains isolated in the Republic of Moldavia between 1995-1999 – Anca Israil, Carmen Balotescu, Ionela Alexandru, Radu Cojocaru, Nadia Bucurenci, Valeriu Chicu, Ludmila Mutoi, 2005, Roum. Biotechnol. Lett., 10 (6), 2441-2445
  • Calorimetric and crystallographic analysis of the oligomeric structure of Escherichia coli GMP kinase – Guillaume Hible, Louis Renault, Francis Schaeffer, Petya Christova, Adriana Zoe Radulescu, Cecile Evrin, Anne-Marie Gilles, Jacqueline Cherfils, 2005, J.Mol.Biol., 352, 1044-1059
  • Structural and functional consequences of single amino acid substitutions in the pyrimidine base binding pocket of Escherichia coli CMP kinase – Augustin Ofiteru, Nadia Bucurenci, Emil Alexov, Thomas Bertrand, Pierre Briozzo, Hélène Munier-Lehmann, Anne-Marie Gilles, 2007, FEBS Journal, 274(13) , 3363–3373
  • Regulatory mechanisms differ in UMP kinases from gram-negative and gram-positive bacteria – Evrin C, Straut M, Slavova-Azmanova N, Bucurenci N, Onu A, Assairi L,Ionescu M, Palibroda N, Barzu O, Gilles AM., 2007, J.Biol. Chem, 282(10), 7242-7253
  • Fluorescent Study of the Interaction between Staphylococcus aureus UMP kinase and UTP – C.Chilom, D. Gazdaru, N. Bucurenci, M. Straut, A. Popescu, 2007, J.of Optoelectronics and Advanced Materials, 9(8), 2585-2588
  • Characterization of Guanylate Kinase from gram positive and gram negative microorganisms; preliminary results – Ana-Maria Ruxandra Eftimie, Florina Toma, Adriana-Zoe Costache and Nadia Bucurenci, 2007, Roum. Arch. Microbiol. Immunol., 66(1-2), 22-25
  • Stereoselective synthesis of L-[15N] amino acids with glucose dehydrogenase and galactose mutarotase as NADH regenerating system – Maria Chiriac, Iulia Lupan, N. Bucurenci, O. Popescu, N. Palibroda, Journal of Labelled Compounds and Radiopharmaceuticals , 2008, 51 (4) , 171-174