Skip to content

Institutul Cantacuzino

Profesionalismul si experienta noastra pentru sanatatea dumneavoastra !

Search Results

Keyword: rezultate

Cabinetele medicale individuale, centrele de diagnostic, laboratoarele medicale, alte unitati sanitare de stat si private, institutii si firme pot incheia contracte de prestari servicii cu INCDMI Cantacuzino pentru analize medicale. Acestea se efectueaza cu plata pe loc sau lunar pe baza de factura.
Unitatile interesate sa incheie un astfel de contract se vor adresa laboratorului de analize medicale pentru a obtine formularul de contract.
Dupa completarea si semnarea in doua exemplare, acestea se vor transmite prin curier sau prin posta cu confirmare de primire pe adresa: INCDMI Cantacuzino, Laboratorul de analize medicale, Splaiul Independentei 103, 050096 Bucuresti. In cel mai scurt timp va vom remite un exemplar semnat de conducerea INCDMI Cantacuzino, pe adresa indicata de dumneavoastra in contract.
Pentru discutarea aspectelor legate de volumul prestatiilor, conditiile de recoltare si transport, eliberarea rezultatelor, tarife, discounturi, va invitam la sediul INCDMI Cantacuzino.

Activities and results:

Mosquitoes have been captured in Danube Delta and other study areas, using special traps and back pack aspirators (Fig 1-4)

Fig. 1 Collecting mosquitoes with the back-pack aspirator

Mosquitoes were rapidly distributed in cryotubes and placed in dry nitrogen shippers to preserve the ARN virus. Back in the laboratory they were identified and processed for West Nile virus (WNV) genome detection. Screening tests were performed using a reverse-transcription and real-time PCR kit (Taqman assay). RNA from positive samples has been subsequently used to amplify specific molecular targets. Amplification products have been sequenced and nucleotides sequences analyzed. Blood engorged mosquito females have been used to analyze the blood meal source.

Fig.2 Mosquitoes collected with the bird- baited trap

Fig.3. Fixing a CDC light trap

Fig.4. “BG sentinel” traps to collect mosquitoes

WNV circulating in mosquitoes in Romania and causing human disease has been genotyped, the genetic lineage has been established, and the viral genome of various virus isolates was partially sequenced. Sequencing and sequence analysis are still in process.
Mosquitoes which are acting as primary WNV vectors in the deltaic ecosystem and in urban ecosystem were identified and their relative infection rate with WNV was established… Secondary vectors were also identified and bio-ecological data on vector populations were collected. The data base analysis is in process.
During the entomological investigations an invasive mosquito species, with high vector potential was found for the first time in Romania. Public Health authorities were informed in timely manner to take control measures.

Impact of obtained results: Although only partial results are discussed at this stage, the findings regarding both the vectors and the West Nile virus (WNV) strains circulating in Romania are valuable. Our contribution to the data base of the consortium, and the analysis of our results in comparison with those obtained by the other partners, will fundament the model of emergence and of endemicity of WNV in Europe, a model with a significant public health impact, in respect to prevention and control of West Nile fever.

 

BIOLOGY AND CONTROL OF VECTOR-BORNE INFECTIONS IN EUROPE

 EDENext

ABSTRACT

Following the unprecedented epidemic of West Nile fever in southeasternRomaniain 1996,  West Nilevirus (WNV) which is spreading along bird migration pathways and is circulating in bird-mosquito cycles, became endemic in this country. Another significant outbreak was recorded in 2010 year produced by a strain belonging to a differentWest Nilevirus genetic lineage. Multiple strains of West Nile virus were detected and caused outbreaks in other Southern European countries, as well as inCentral Europe, becoming a real threat for European citizens, in the context of climate and  environmental changes. The partnership EDENext project on the biology and control of vector-borne infections in Europe aimed, in a coordinated international effort, to understand and explain eco-epidemiology of vector-borne infections, including mosquito-borneWest Nilevirus, as well as defining the risk of invasive vector species. Our goals were to understand the mechanisms of WNV emergence, maintenance and amplification in natural and urban ecosystems, and of its molecular evolution, via virus genome sequencing and bio-informatics analysis.

As a partner,  INCDMI Cantacuzino multidisciplinary team, involving entomologists, microbiologists, medical and veterinary doctors, as well as molecular biologists, participated in the study of emergence and spread of mosquito-borne virus infections and of the biology of the mosquito vectors.  Our work was based on two main areas of study: Danube Delta plus the Razim lagoon complex, and the urban area of Bucharest, plus the periurban Ilfov area. Regular monthly field trips were performed in Danube Delta and mosquitoes were collected using a variety of mosquito-traps. Weather parameters were monitored. In Bucharestarea mosquito collections were performed at the end of summer, in areas where human West Nilefever cases were recorded. Mosquitoes where identified and analyzed for the presence of WNV genome. In positive samples the virus was sequenced and a phylogenetic analysis was performed. As well we analyzed the source of blood of female mosquitoes to identify the preferred vertebrate hosts, thus identify the components of the transmission cycles in urban and periurban area.  We identified the principal and the secondary mosquito vectors of West Nilevirus in the deltaic ecosystem, as well as the bridge vectors which may transmit the virus to humans, and characterized the structure of mosquito community in different ecosystems. A significant progress has been made in the knowledge of the ecological succession of mosquito vector populations and their role in the maintenance and amplification of West Nilevirus. The urban vector of West Nile virus was confirmed and its role in the overwintering of West Nilevirus was revealed.  The virus infection rate in mosquitoes was calculated using a dedicated software, and statistical analysis of the correlation between weather parameters and mosquito abundance, on one side, and the West Nilevirus infections rate in mosquito populations, on the other side,  was performed. Scientific results new to science pointed out to the mechanisms of introduction of West Nile virus into Romaniaand its maintenance in mosquito population explaining the endemization process. The preferred hosts of urban vectors were identified and the mechanisms of virus maintenance via vertical transmission was demonstrated. Entomological investigation of urban area of  Bucharestfound the presence and establishment in the city of the invasive vector species Aedes albopictus, the Asian tiger mosquito, which was involved in autochthonous transmission of imported Dengue and Chikungunya viruses in southern France, Italy and Croatia in recent years. These findings were immediately communicated to public health authorities and a methodology for control was also distributed. We became aware of the risk of dengue virus introductions via infected travelers and performed a study on the molecular epidemiology of dengue viruses imported into Romania, as it was known that some dengue virus genotypes are more prone to transmission by Aedes albopictus than others. An in depth molecular study of West Nile viruses circulating in southeastern Romania documented the mechanism of endemization of the virus in this area and the variety of virus lineages  circulating in mosquito populations in Danube Delta. Weather conditions correlated withWest Nile virus upsurge and outbreak risk were determined. Our data are used for a standardized methodology for surveillance of mosquito vectors and for risk assessment forWest Nile virus transmission,  taking into account weather, environmental and vector populations and mosquito species community parameters. These results are completing a very complex puzzle of eco-epidemiology of West Nile virus inEurope, and are fundamental for risk assessment at continental level, and for better programs of control of transmission to humans.

 

Brief presentation of the goals of project (source: http://www.edenext.eu/ )

The EDENext Consortium is investigating the biological, ecological and epidemiological components of vector-borne disease introduction, emergence and spread, and the creation of new tools to control them. Due to environmental and socio-economic changes, vector-borne diseases (VBD) are becoming an increasing challenge for human and veterinary public health not only in Europe, but across the globe.
Emerging infectious diseases (EID) are often detected in Europe and North America but also pose major risks for developing countries, where many factors favour the emergence of VBD and there are limited health facilities to prevent, monitor or control their spread. Therefore the work of EDENext is not only as a means of protecting and improving public health and the welfare of European citizens, but part of a coordinated international effort.

EDENext builds on the concepts, methods, tools and results of the earlier EDEN project (Emerging diseases in a changing European environment). It is using the same general approach of understanding and explaining biological, ecological and epidemiological processes in order to develop a set of state-of-the-art methods and tools to improve prevention, surveillance and control of vector populations and VBD. However, while EDEN focused on the effects of environmental changes on the emergence of VBD, EDENext is seeking to explain and model the processes leading to the introduction, establishment and spread of vectors and/or VBD, and to assess the possible control strategies to break the epidemiological cycles of VBD. EDENext is a public health oriented project.

Following the successful formula established by EDEN, the project is organised around a set of vertical disease-related activities linked by horizontal themes which provide integrated technical input to the vertical groups, minimising duplication and ensuring a coordinated approach throughout the project.

Role of the National Institute of Research and Development for Microbiology and Immunology Cantacuzino in EDENext project.

INCDMI Cantacuzino: partner 22, acronym NIRDMI.

Background: NIRDMI team is involved in the following WP of EDENext project: “Emergence and spread of mosquito-borne diseases”. The main focuses of our activity are the mechanisms of emergence, of amplification and endemic maintenance of the West Nile virus (WNV) in the Danube Delta, as well as in other areas of virus activity. WNV is a mosquito-borne virus endemic in Romania. In 1996 and 2010 significant WNV outbreaks in humans have occurred, and the virus is transmitted to humans year after year, human cases being recorded in every transmission season. The bio-ecology of mosquito vectors and is studied, as well as the influence of climate changes on vectors and virus transmission.

The objectives of our activity are addressing both vectors and virus:

  • Mosquito vectors: we aim at identifying main mosquito-vectors of WNV, their blood-meal host preference, the dynamics of their populations across the transmissions season under the weather influence, their survival rate over winter, the WNV infection rate of different mosquito species;
  • West Nile virus (WNV): our goals are to understand the mechanisms of WNV emergence, maintenance and amplification in natural and urban ecosystems, and of its molecular evolution, via virus genome sequencing, and bio-informatics analysis.

Project title: EDENext—Biology and control of vector-borne infections in Europe
Website: http://www.edenext.eu/
Grant No: 261504

Call identifier: FP7-HEALTH-2010-single-stage
Type of project: collaborative project
The project is involving 46 partner institutions from 21 countries
( http://www.edenext.eu/the-project/who-we-are )

Date of start: 2011/01/01
End: 2014/12/31

The National Institute of Research and Development for Microbiology and Immunology Cantacuzino is partner 22 with the acronym NIRDMI.

The total budget of the project for NIRDMI partner is 254160 euro:

  • an amount of 190620 euro (75%) is provided by EC;
  • an amount equivalent to 25%, the co-financing of 252502 LEI, is provided by the Executive Agency for Higher Education, Research, Development and Innovation Funding (UEFISCDI) in the framework of the National Program PNII, Capacities, Module III FP7, project 147-1EU/2011.

Team: Dr. Cornelia S Ceianu (team coordinator, virologist), Dr Gabriela Oprisan (molecular virologist), Dr Daniela Badescu (microbiologist), Dr Ani Ioana Cotar (molecular microbiologist), Dr Elena Falcuta (entomologist), Dr Liviu Prioteasa (entomologist), Raluca Ioana Panculescu-Gatej (PhD fellow, biochemist), Sorin Dinu (PhD fellow, biochemist, Dr Coman Cristin (veterinarian), Ghergus Marinela (economist, financial manager). The following technicians were also involved in project activities: Valentina Teodorescu, Anca Stefan, Silvia Enache, Dana Popescu.

Two PhD theses are developed within this project by PhD fellows Sorin Dinu and Raluca Ioana Panculescu-Gatej.

Activitati si rezultate:

Au fost capturati tantari in zonele de studiu din Delta Dunarii utilizand capcane si aspiratoare speciale ( Fig 1-4)

Fig. 1 Colectarea tantarilor vectori cu ajutorul aspiratorului.

Tantarii au fost rapid distribuiti in criotuburi si plasati in recipiente de transport cu azot lichid, in vederea prezervarii virusului. In laborator au fost sortati, identificati si procesati pentru detectia genomului virusului West Nile. Testele de screening s-au efectuat cu ajutorul unui kit pentru revers-transcriere si amplificare genica in timp real. Ulterior au fost amplificate alte tinte moleculare din probele pozitive, iar ampliconii au fost secventiati. Secventele de genom viral au fost analizate. Tantarii hraniti cu sange au fost procesati pentru identificarea sursei pranzului sanguin.

Fig.2 Tantari colectati cu ajutorul capcanei cilindrice amorsate cu pasare

Fig.3. Montarea unei capcane luminoase (CDC light trap)

Fig.4. Capcane “BG sentinel” pentru colectarea tantarilor vectori

Virusul WN circulant in Romania a fost genotipat, a fost stabilita linia genetica din care face parte, genomul acestuia a fost partial secventiat. Secventierea si analiza filogenetica a secventelor obtinute se desfasoara in continuare.
Au fost identificati vectorii primari ai virusului West Nile in ecosistemul Deltei Dunarii
si in ecosisteme urbane si s-a stabilit rata de infectie cu virus WN. S-au identificat si speciile de tantari care actioneaza ca vectori secundari ai virusului WN. Au fost colectate date de bio-ecologie a tantarilor, iar baza de date acumulate este in curs de analiza.
In cursul investigatiilor entomologice a fost gasita, pentru prima data in Romania, o specie invaziva de tantari, cu un potential vector semnificativ, iar autoritatile de sanatate publica au fost informate rapid pentru a lua masurile de control necesare.

Impactul rezultatelor: Cu toate ca in acest stadiu discutam doar rezultate partiale, datele obtinute de noi in legatura cu tantarii-vectori si tulpinile de virus WN circulante in Romania sunt deosebit de valoroase. Contributia noastra la baza de date a consortiului si analiza comparativa a rezultatelor noastre, in raport cu cele obtinute de alti parteneri de proiect, vor fundamenta modelul emergentei si al endemicitatii virusului WN in Europa, care va avea un impact semnificativ la nivelul sanatatii publice, pentru preventia si controlul febrei West Nile.

 

BIOLOGIA SI CONTROLUL INFECTIILOR TRANSMISE PRIN VECTORI IN EUROPA

OBIECTIVE GENERALE URMĂRITE

- Definirea factorilor care moduleaza circulatia diverselor tipuri genetice de virus West Nile si care favorizeaza aparitia epidemiilor in tara noastra si in Europa. Obiectivul a fost realizat 100%.

- Identificarea riscului de circulatie si de transmitere la om a virusurilor transmise de tantari unor virusuri care au ca vectori tantarii –specii autohtone si specii invazive importate. Obiectivul a fost realizat 100%.

ETAPA 1. Elaborarea, armonizarea, standardizarea  si implementarea metodologiei  lucru in laborator si teren: a fost elaborata si testata o metoda standardizata de colectare a probelor biologice, de conservare si transport, de procesare a acestora in laborator si de analiza preliminara,  prin screening molecular, pentru detectia virusului West Nile. Aceasta metodologie de lucru a fost validata prin utilizarea sa in conditii de lucru deosebite , in diferite anotimpuri si zone geografice, cu diversi operatori.  A fost optimizata metoda moleculare de amplificare a unui marker variabil din genomul flavivirusurilor, pentru a fi utilizata in tipizarea tulpinilor circulante ale virusului West Nile si in analiza de epidemiologie moleculara. A fost implementat un protocol de laborator pentru identificarea sursei pranzului sanguin al femelelor de tantari, care a fost utilizat pentru testarea probelor aduse de pe teren . A fost astfel validata ca metodologie de supraveghere a circulatiei a agentilor patogeni transmisi de tantari vectori,  utilizabila atat in studii prospective privind circulatia unor noi arbovirusuri , cat si in programele de monitorizare/supraveghere a activitatii unor agenti patogeni endemici, inclusiv virusul West Nile. Obiectivul a fost realizat 100%.

ETAPA 2.  Colectarea si procesarea probelor biologice si caracterizarea faunei de Culicidae in contextul arealelor de studiu . Au fost colectati si analizati peste 30000 de tantari, peste 200 exsudate cloacale si orale de la pasari domestice si salbatice care au fost analizate pentru prezenta virusului West Nile. Numarul mare de specimene colectate si analizate a permis analiza statistica si obtinerea unor rezultate semnificative, cu valoare confirmatorie. Am configurat principalele componente ( vectori) ale ciclului de transmitere a virusului West Nile in Delta Dunarii, vectorii principali, vectorii secundari si vectorii –punte ( „bridge-vectors”), precum si dinamica populationala a tantarilor vectori ai virusului West Nile  in cursul sezonului de transmitere. Investigatia entomologica din orasul Bucuresti a pus in evidenta, pentru prima data in Romania, o specie invaziva de tantari – tantarul tigru asiatic, un potential vector periculos.   Obiectivele au fost indeplinite 100%.

ETAPA 3. Investigarea relatiei vector-gazda vertebrata si a rolului acesteia in mentinerea si amplificarea virusului West Nile Am stabilit  preferinta de hranire a tantarilor. Au fost secventiate 210 probe de provenite de la tantari hraniti si au fost comparate cu baza de date www.barcodingoflife.com. Astfel s-a putut stabili sursa preferata de sange in cazul femelelor de tantari. Studiul nostru efectuat asupra unor tantari care se adapostesc afara (exofili) a demonstrat ca vectorul urban Culex pipiens sensu lato se hraneste de preferinta pe pasari comune sedentare care pot reprezenta amplificatori ai virusului West Nile in zone urbane si periurbane. A fost stabilita dinamica speciilor de tantari in cursul sezonului de activitate a acaestora, in raport cu peioadele de migratie a pasarilor in Delta Dunarii. Obiectivele fazei au fost indeplinite 100%. In plus, la recomandarea Coordonatorului (CIRAD), am efectuat monitorizarea speciei invazive Aedes albopictus   in orasul Bucuresti si am trimis , in timp real  o informare autoritatilor de sanatate publica precum si, la solicitarea Ministerului Sanatatii, o scrisoare metodologica privind masurile de preventie si control pentru a impiedica stabilirea acestei specii de tantari vectori in tara noastra.

ETAPA 4. Particularitatile circulatiei virusului West Nile in Romania, elaborarea hartilor de risc si evaluarea riscului de transmitere la om. Au fost caracterizate izolatele de virus West Nile obtinute si s-a stabilit filogenia lor moleculara. Datele moleculare aduc dovezi suplimentare privind endemicitatea acestui virus în ţara noastră.. Deasemenea am determinat zonele geografice si tipul de ecosistem in care circulatia virusului West Nile este activa si in care riscul de transmitere la om este crescut.  Factorii corelati cu riscul transmiterii la om a virusului West Nile au fost:  vecinatatea ecosistemelor umede populate de pasari acvatice migratoare si infestate cu tantari, abateri pozitive semnificative ale temperaturii medii lunare, o cantitate de precipitatii suficienta pentru mentinerea habitatelor larvare, dar sub media multianuala. Tara noastra se mentine intr-o zona favorabila introducerii virusului West Nile, prin pasari migratoare ori paraziti ai acestora, si in care virusul gaseste conditii favorabile transmiterii endemice. Obiectivul a fost indeplinit 100% .

Participantii aflati in stagiu doctoral si postdoctoral au efectuat cursuri de pregatire in domeniile: Utilizarea sistemului de informatii geografice (GIS), Biosiguranta pentru laboratoarele BSL 3 si 4, Entomologie medicala si controlul vectorilor, Diagnosticul virusului West Nile. De asemenea au participat cu comunicari stiintifice la patru Conferinte Nationale, la meeting-urile anuale ale proiectului, au efectuat o vizita de lucru pentru schimb de experienta, au participat la patru ateliere de lucru interrnationale, la  patru Conferinte internationale, si doua Congrese internationale.

In cursul proiectului au fost elaborate 2 teze de doctorat : unul dintre doctoranzi a obtinut titlul de „ doctor in biologie” , iar al doilea doctorand al proiectului isi finalizeaza teza.

Rezultatele se utilizeaza in sanatatea publica in evaluarea riscului, stabilirea zonelor afectate, organizarea supravegherii si controlului vectorilor, precum si a circulatiei virusului West Nile. Aceste rezultate se coroboreaza cu cele obtinute la nivelul intregului consortiu, fiind utilizate la elaborarea unor modele la nivel continental cu impact asupra imbunatatirii sanatatii cetatenilor europeni.

 

Scurta prezentare a obiectivelor proiectului (sursa: http://www.edenext.eu/)

Consortiul EDENext investigheaza componentele biologice, ecologice si epidemiologice implicate in introducerea, emergenta si controlul infectiilor transmise prin vectori; de asemenea elaboreaza noi metode pentru controlul acestora. Din cauza schimbarilor de mediu, climatice si socio-economice, bolile transmise de vectori reprezinta o provocare crescanda pentru sanatatea publica si animala atat in Europa, cat si la nivel global. Activitatea EDENext este orientata spre protectia si cresterea calitatii vietii pentru cetatenii europeni, ca parte a unui efort international pentru monitorizarea si reducerea impactului negativ al patogenilor transmisi de artropode si rozatoare.

EDENext se bazeaza pe conceptele, metodele si rezultatele unui proiect anterior: proiectul EDEN, desfasurat in PC6 ( EDEN project (Emerging diseases in a changing European environment).
Proiectul abordeaza procesele biologice, ecologice si epidemiologice care guverneaza circulatia agentilor patogeni transmisi prin vectori, si dezvolta metode avansate si instrumente utilizabile pentru preventia, supravegherea si controlul populatiilor de vectori si a bolilor infectioase transmise de acestia. In timp ce proiectul EDEN s-a focalizat pe influenta schimbarilor de mediu asupra populatiilor de vectori, noul proiect, EDENext, este orientat spre sanatatea publica, spre intelegerea mecanismelor emergentei si a evaluarii strategiilor de control prin intreruperea ciclurilor epidemiologice ale infectiilor transmise prin vectori.

Proiectul EDENext este structurat pe subproiecte verticale dedicate unor grupuri de vectori (tantari, capuse, rozatoare, flebotomi) si patogeni/paraziti pe care acestia ii transmit, conectate prin teme orizontale care asigura subproiectelor un input tehnic integrat, reducand la minimum activitatile redundante si asigurand o abordare coordonata la nivelul intregului proiect.

Rolul Institutului National de Cercetare–Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie Cantacuzino (partenerul no.22, cu acronimul NIRDMI) in proiectul EDENext

Echipa INCDMI Cantacuzino participa la pachetul de lucru cu tema: “Emergenta si raspandirea bolilor transmise prin tantari-vectori” si investigheaza mecanismele emergentei, amplificarii si mentinerii la nivel endemic a virusului West Nile (WN) in Delta Dunarii si in alte zone din tara. Virusul WN este transmis de tantari si este endemic in Romania. In 1996 si 2010 au avut loc epidemii semnificative de meningo-encefalita West Nile, virusul fiind transmis la om si in perioadele inter-epidemice. Se investigheaza bio-ecologia tantarilor vectori, ca si influenta modificarilor climatice asupra populatiilor de vectori si asupra circulatiei si mentinerii endemice a virusului West Nile.
Obiectivele activitatii noastre sunt legate atat de tantarii vectori, cat si de agentul patogen viral luat in studiu:

1. Tantarii vectori:
Obiectivele noastre sunt: identificarea principalilor vectori ai virusului WN, a preferintei lor de hranire (pranz sanguin), a altor trasaturi biologice ale vectorilor ca diapauza, rata de supravietuire peste iarna, precum si susceptibilitatea la infectia cu virus WN a diferitelor specii de vectori.

2. Virusul West Nile:
Obiectivele noastre sunt: intelegerea mecanismelor emergentei virusului WN, ale mentinerii si amplificarii virusului, ale persistentei peste iarna; secventierea genomului viral, analiza filogenetica si descifrarea mecanismelor moleculare de evolutie a virusului WN.
Aceste investigatii sunt desfasurate de o echipa multidisciplinara complexa care include microbiologi, biochimisti, entomologi, specialisti in biologie moleculara, medic veterinar, cu expertiza complementara pentru indeplinirea obiectivelor proiectului.

 

Titlul proiectului: Biologia si controlul infectiilor transmise de vectori in Europa. Acronim EDENext

Site web: http://www.edenext.eu/

Identificatori: competitia FP7-HEALTH-2010-single-stage, grant no 261504
Tip de proiect: proiect colaborativ

La proiect participa, in calitate de parteneri, 46 institutii din 21 de tari. (http://www.edenext.eu/the-project/who-we-are)

Data inceperii proiectului: 01/01/2011.
Data incheierii proiectului: 31/12/2014

Institutul National de Cercetare – Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie Cantacuzino este partenerul nr. 22, cu acronimul NIRDMI.

Bugetul total al proiectului este 254 160 euro:

  • Un cuantum de 75% din bugetul proiectului este asigurat prin grantul European (190620 euro);
  • Un cuantum de 25 %, reprezentand cofinantarea proiectului (252 502 LEI) este furnizat de catre UEFISCDI prin Programul Capacitati ( PNII), Modulul III FP 7, proiectul 147-1EU/2011.

 

Echipa: Dr. Cornelia S Ceianu (coordonator echipa), Dr Gabriela Oprisan, Dr Daniela Badescu , Dr Ani Ioana Cotar , Dr Elena Falcuta , Dr Liviu Prioteasa , Doctorand Raluca Ioana Panculescu-Gatej , Doctorand Sorin Dinu , Dr Coman Cristin, Ghergus Marinela (economist, manager financiar). Urmatorii asistenti medicali au participat de asemenea la activitatile proiectului: Valentina Teodorescu, Anca Stefan, Silvia Enache, Dana Popescu.

In cadrul proiectului se desfasoara activitatea experimentala pentru doua stagii doctorale (doctoranzi Sorin Dinu si Raluca Ioana Panculescu-Gatej).

Rezumat Etapa I – 2012
Stabilirea metodologiei de lucru si a algoritmului de recrutare a pacientilor

Terapia curentă anti-HCV cu interferon pegilat asociat cu ribavirină (PEG-IFN/RBV) nu este eficientă la toţi pacienţii (cazul majorităţii celor infectaţi cu genotipul 1b) datorită selectării mutaţiilor de rezistenţă şi a unei sensibilităţi mai scăzute la antivirale a acestui genotip. In plus, terapia este greu suportată de pacienţi şi are efecte adverse. In urma unui studiu anterior al grupului nostru de cercetare privind distribuţia genotipurilor HCV în Romania, am identificat genotipul 1b ca fiind predominant (86.4%), urmat de 1a (10.7%) şi de 4a (2.9%), acesta din urmă ca genotip emergent (Sultana C, 2011).

Proiectul îsi propune să definească factorii de predictie a răspunsului la terapia PEG-IFN/RBV prin analiza integrată a factorilor virali precum si a factorilor de gazdă. Unul dintre obiectivele proiectului HepGen este de a produce informatii care conduc la deciziile de tratament, bazate atit pe informatii privind virusul cit si pe cele privind profilul genetic al pacientului.

Obiectivele etapei 1 (conform Planului de realizare) sunt:

- Elaborarea modelului experimental pe baza documentatiei din literatura de specialitate
– Constructie pagina web a proiectului
– Selectarea si optimizarea protocoalelor de lucru pentru si studierea markerilor virali de resistenta la tratment
– Stabilirea criteriilor de constituire a loturilor de pacienti inclusi in studiul prospectiv
– Constituirea unui lot pentru studiul retrospectiv. Distribuirea probelor in cadrul consortiului
– Alcatuirea bazei de informatii referitoare la pacientii inclusi in studiu
– Stabilirea protocolului de lucru pentru dozarea unor markeri serologici predictivi pentru evolutia raspunsului la tratament
– Optimizarea protcolului de lucru pentru studierea unor markeri genetici umani
– Determinarea incarcaturii virale pre/post-tratament la 4, 12, 24/48 saptamani si la sase luni dupa tratament
– Kick-off meeting

Elaborarea modelului experimental pe baza documentatiei din literatura de specialitate
In aceasta faza institutia coordonator a fost implicata, impreuna cu toti partenerii, in Elaborarea modelului experimental pe baza documentatiei din literatura de specialitate (activitatea I.1 din planul de realizare).

Constructie pagina web a proiectului (I.2): pe site-ul institutiei coordonator INCDMI Cantacuzino http://www.cantacuzino.ro/ro/
exista link catre proiectul HepGen nr 88/2012: http://www.cantacuzino.ro/ro/?p=1713
unde sunt postate date despre proiect (Prezentare generala, Componenta Parteneriatului, Bugetul proiectului, Rezumatul si Obiectivele). Toate documentele postate pe site sunt create cu concursul tuturor partenerilor din consortiu.

Selectarea si optimizarea protocoalelor de lucru pentru studierea markerilor virali de resistenta la tratment

Factorii virali care concura la raspunsul la tratament sunt: genotipul HCV, incarcatura virala inainte de tratament, cinetica virala sub tratament si diversitatea virala.
In timpul replicarii, HCV are particularitatea de a genera unele variante virale (cvasispecii) care difera intre ele prin mutatii (pina la 10% din intregul genom). Aceasta variabilitate virala importanta conduce la grade diferite de sensibilitate fata de terapia HCV (Asselah, 2010).
In literatura de specialitate au fost semnalate diferite zone din genomul virusului hepatitei virale care pot fi corelate cu rezistenta la tratament. Pentru a evalua contributia variabilitatii virale in raspunsul la tratament am ales 3 gene din structura HCV la nivelul carora se vor face comparatii de secventa intre virusurile provenite de la pacienti sensibili cu cele provenite de la pacienti rezistenti la tratament.

Am selectat, testat si optimizat RT-PCR in trei zone genomice, utilizand un lot de 20 de seruri constitutit de P1. ARN viral este extras din plasma/serul uman, reverstranscris si amplificat prin heminested/nested PCR. Primerii utilizati pentru amplificarea celor trei regiuni au fost selectati din literatura sau construiti in laborator. Ampliconii rezultati au fost purificati din gel si secventiati direct in ambele sensuri. Secventele au fost analizate si editate cu softul BioEdit. Rezultatele obtinute prin interogarea bancilor de secvente cu algoritmul BLAST au confirmat specificitatea fiecarei zone amplificate. Rezultatele optimizarilor au servit la alcatuirea a trei documente „Procedura standard de operare” ce vor fi utilizate pentru procesare si analiza probelor colectate in cadrul proiectului.

Optimizarea protcolului de lucru pentru studierea unor markeri genetici umani

In aceasta etapa au fost optimizate metodele moleculare de studiu al unor markeri umani (factori de gazda) care concura la raspunsul la tratament: grupul alelelor HLA-B27 (asociate cu clearance-ul viral spontan in cazul infectiei acute cu HCV) si doua dintre cele mai frecvente polimorfisme cu importanta farmacogenetica la pacienti cu HCV, identificate in gena ITPA in populatia caucaziana.
Optimizarea acestor metode moleculare a fost realizata pe 12 probe de sange periferic recoltat de la pacienti cu si fara infectie HCV in antecedente. Pe baza testelor de optimizare au fost realizate procedurile standard de operare (POS) ce vor fi utilizate in studiul markerilor genetici umani in cadrul proiectului.

Stabilirea criteriilor de constituire a loturilor de pacienti inclusi in studiul prospectiv

Partenerul 1 a pus la dispozitia consortiului documentele elaborate de participantii acestuia pentru procedurile de recrutare si monitorizare a pacientilor in cadrul studiului. Aceste documente sunt:
1. Consimtamant informat – Anexele 1 si 2
2. Buletinul de insotire a probelor HepGen – Anexa 3
3. Conditii preanalitice pentru prelevarile de sange T0 – Anexa 4
4. Chestionar de recrutare pentru baza de date – Anexa 5
5. Model de introducere in baza de date – Anexa 6

Constituirea unui lot pentru studiul retrospectiv. Distribuirea probelor in cadrul consortiului: a fost agreat in consortiu numarul total de 20 cazuri, dintre care 10 pacienti cu raspuns virusologic sustinut (RVS) si 10 pacienti pentru care este documentata una din formele de esec terapeutic (non-RVS).

In spitalul Victor Babes (P1) a fost selectat un numar de 11 pacienti RVS si 11 pacienti non-RVS ca lot retrospectiv, dintre care de la 2 pacienti non-RVS au fost disponibile serurile de la intierea tratamentului si dupa tratament. Cele 24 de seruri au fost transmise coordonatorului pentru optimizarea protocoalelor de PCR si secventiere pentru markerii virali.

Determinarea incarcaturii virale pre/post-tratament la 4, 12, 24/48 saptamani si la sase luni dupa tratament:
S-au efectuat un numar de 7 recrutari de pacienti in studiul HepGen, la partenerul P1/SVB si 4 recrutari la partenerul P2/ICF (institutul Clinic Fundeni). Conform protocolului agreat in consortiu s-a efectuat incarcarea virala HCV la momentul de initiere a tratamentului (T0) atit la lotul retrospectiv cit si la primii 11 pacienti recrutati in proiectul HepGen si s-au preparat stocuri de ser pastrate la -80°C la P1/SVB. Pentru aceste stocuri s-a creat o baza de date pentru a inregistra toate modificarile operate in cadrul colectiei: transfer de alicote la parteneri pentru testari ARN-HCV sau biomarkeri de interes pentru studiu, efectuarea unor teste suplimentare la P1/SVB.

Serurile trimise catre coordonator au fost testate in laboratorul partenerului P1/SVB pentru ARN-HCV, printr-o metoda comerciala validata pentru diagnostic in vitro. Toate documentele de lucru si cele generate in cadrul activitatilor HepGen precum si inregistrarile fizice sau electronice legate de studiul HepGen sunt pastrate in laboratorul de Virusologie, Imunologie, Biologie Moleculara al P1/SVB, cu exceptia documentelor transferate la perteneri si coordonator in momentul transferului de produse biologice.

In urma cererii coordonatorului catre comisia de etica din INCDMI Cantacuzino privind aprobarea studiului si a documentelor anexate (Consimtamant informat al pacientului, Buletinul de insotire a probelor HepGen, Conditii preanalitice pentru prelevarile de sange T0, Chestionar de recrutare pentru baza de date) a fost obtinut avizul comisiei de etica : Raport de evaluare nr CE/16 din 26.11.2012.

Kick-off meeting

Coordonatorul a organizat la sediul sau (INCDMI Cantacuzino) o intilnire cu toti partenerii – Kick-off meeting (activitatea I.10 din planul de realizare) din 3 octombrie. O a doua intilnire cu toti partenerii a avut loc la sediul P1 (Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale “Dr V Babes”) in data de 26 octombrie.
In cadrul acestor intalniri s-au discutat urmatoarele:

  • tipul studiului
  • organizarea loturilor de pacienti
  • consimtamant informat : toti pacientii vor semna un formular de consimtamant informat inainte de inrolarea in studiu. Documentele anexate cuprind: consimtamantul principal, in care pacientul este informat despre participarea spitalului in cadrul proiectului de cercetare si posibilitatea de a face parte din lotul de studiu si consimtamantul pentru prelevare de probe in scopul testelor genetice, bazat pe standardul oferit de partenerul P4, care are expertiza in acest domeniu
  • Criteriile de constituire a loturilor de pacienti inclusi in studiul prospectiv: Criteriile de includere/excludere au la baza protocoalele CNAS in vigoare (Monitorul Oficial al Romaniei/ 10.06.2010/ pg 66-70), la care se adauga cateva criterii stabilite cu toti partenerii
  • Alcatuirea bazei de informatii referitoare la pacientii inclusi in studiu
  • Evaluarea fibrozei in cadrul lotului de studiu

 

 

Proiect 88/2012 HepGen

Raport stiintific si tehnic

 

Etapa II

1 ian 2013-30 noiembrie 2013

Studiul markerilor virali si genetici umani utilizabili pentru predictia evolutiei infectiei la pacienti tratati si netratati

 Rezumatul etapei

 

La INCDMI Cantacuzino (Co) au fost amplificate si secventiate in gena HCV core 101 probe (79 seruri provenite de la Spitalul V. Babes si 22 seruri provenite de la Inst. Clinic Fundeni) provenite de la pacienti naivi pentru tratament sau de la pacienti non-responderi la tratament. Genotipul 1b este majoritar (97%) dar circula si alte genotipuri (1a si 4a) in procent de 3%. Au fost selectaţi pacienţi cu hepatită cronică cu virus C subtip 1b din lotul retrospectiv furnizat de partenerul 1 (Spitalul V. Babes) pentru evaluarea profilului de rezistenţă la noile terapii cu antiproteazice a variantelor HCV circulante la pacienţii din ţara noastră. Pentru atingerea acestui obiectiv, a fost studiată regiunea NS3 protează prin secvenţierea directă. P1, Co si P4  au fost implicati in selectarea unor tulpini virale pentru secventierea integrala a genomului prin tehnologia next generation. In cursul anului 2013 au fost recrutati un numar total de 87 pacienti in cadrul Spitalului Victor Babes (SVB – P1) si s-au efectuat testari si stocuri pentru 20 pacienti recrutati la Institutul Clinic Fundeni (ICF). S-a efectuat monitorizarea in cursul tratamentului standard al hepatitei virale cronice de tip C pentru totalul de 106 pacienti recrutati de la inceputul proiectului. S-au alcatuit bazele de date cu informatii ale pacientilor si rezultatele investigatiilor efectuate in cadrul spitalului. Au fost efectuate un total de 343 teste de incarcatura virala HCV. RVR au obtinut 19 pacienti (18.1%). Pana la 1 noiembrie 2013 un total de 6 pacienti au incheiat tratamentul de scurta durata (6 luni), datorita raspunsului virusologic rapid, avand viremii nedetectabile la sfarsitul tratamentului Pe parcursul  etapei, Institutul Clinic Fundeni (P2) a evaluat 26 de pacienti cu infectie cronica VHC la care s-a initiat tratament cu Peginterferon (α2a sau α2b) si Ribavirina Pacientii au fost evaluati la momentul initierii tratamentului pentru evaluarea posibililor factori de risc in ceea ce priveste modalitatea de infectare, precizarea  datelor demografice, stabilirea comorbiditatilor, efectuarea  examenului fizic (inclusiv calcularea IMC) si recoltarea probelor biologice. De asemenea, pacientii au fost evaluati ecografic si prin efectuarea Fibroscan (ca si metoda non invaziva de evaluare a fibrozei hepatice). Partenerul 3 (Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”) a realizat prelucrarea si testarea  probelor (plasma, ser, ADN genomic, ARN plasmatic) recoltate de la 126 pacienti recrutati de partenerii 1 si 2, analiza markerului genetic uman SNP IL28B rs12979860, testarea nivelului seric al  IP10 – factor predictiv al raspunsului la tratament, optimizarea  protocolului de lucru pentru un nou marker seric de predictie a raspunsului la tratament- sCD26, ce va fi testat la toti pacientii inclusi in studiu. Partenerul 4 (Personal Genetics) a studiat factorii genetici de gazda HLA-B27 si ITPA prin metode bazate pe tehnologia PCR pe un lot constituit din 100 de pacienti infectati cu HCV. Activitatățile aferente acestei etape au avut drept scop secvențierea de mare randament (next-generation sequencing) a genomului HCV 1b provenind de la un număr de 11 pacienți și o secvență de control, în vederea caracterizării diversității genetice a virusurilor și identificării unor mutații asociate cu rezistența la tratament. Experimentul se bazează pe utilizarea platformei de pirosecvențare de mare randament Genome Sequencer FLX, produsă de Roche (454 Sequencing). In concluzie, toate activitatile prevazute in planul de realizare au fost indeplinite integral.

 Proiectul îsi propune să definească factorii de predictie a răspunsului la terapia PEG-IFN/RBV prin analiza integrată a factorilor virali precum si a factorilor de gazdă. Unul dintre obiectivele proiectului HepGen este de a produce informatii care conduc la deciziile de tratament, bazate, atit pe informatii privind virusul cit si pe cele privind profilul genetic al pacientului.

Studiul markerilor virali de rezistenta la tratament

Tulpinile HCV prezintă o diversitate genetică foarte mare datorită ARN replicazei care nu posedă mecanisme „proof-reading”. Conform clasificării actuale, tulpinile HCV sunt grupate în 6 genotipuri (1-6), acestea fiind divizate în multiple subtipuri virale cu o distribuţie geografică cunoscută. Genotipurile sunt diferite la nivelul secvenţei nucleotidice în proporţie de 31-33% iar subtipurile în proporţie de 20-25%. Genotipul viral este un predictor important al răspunsului la tratament. Genotipurile 1 şi 4 sunt în mod intrinsec mai rezistente la acţiunea interferonului alfa şi a ribavirinei comparativ cu genotipurile 2 şi 3. Proteina core rezultă prin clivarea poliproteinei virale de către enzimele gazdei. Această proteină înalt conservată conţine 191 resturi de amino-acizi (21 KDa) şi intră în structura nucleocapsidei virale. Recent s-a demonstrat că proteina de capsidă core este implicată în carcinogeneză. S-a constatat asocierea dintre mutaţiile din poziţiile 70 şi 91 din proteina core cu rezistenţa la PEG-interferon asociat cu ribavirină. În poziţia 70, arginina (R) este înlocuită cu glutamină (Q) sau, mai rar, cu histidină (H), iar în poziţia 91 leucina (L) este substituită cu metionină (M). Efectele mutaţiilor din poziţiile core 70 şi 91 asupra expresiei genei core şi a funcţiilor proteinei nu sunt cunoscute. Spre deosebire de Japonia, în Europa şi SUA aceste poziţii mutante din gena core a virusului hepatitei C sunt putin studiate iar rezultatele sunt contradictorii.

La INCDMI Cantacuzino au fost amplificate si secventiate in gena HCV core 101 probe (79 seruri provenite de la Spitalul V. Babes si 22 seruri provenite de la Inst. Clinic Fundeni) provenite de la pacienti naivi pentru tratament sau de la pacienti non-responderi la tratament. Prin secventiere probele de HCV au putut fi genotipate – genotipul 1b fiind majoritar (97%) si alte genotipuri (1a si 4a) in procent de 3%.

Privind cele doua mutatii din gena core, cu potential predictiv pentru raspunsul la tratament, 51% au prezentat numai mutatia 70, un procent mai mare (74%) au prezentat mutatia 91 iar 41,5% au prezentat ambele mutatii. Raspunsul viral concretizat prin negativarea incarcaturii virale, evaluat la 4 saptamini (RVR) si la 12 saptamini (EVR) poate anticipa raspunsul viral sustinut (SVR) dupa incetarea tratamentului. Rezultatele noastre indica faptul ca, dintr-un total de 74 de cazuri de pacienti naivi pentru tratament, 47% au obtinut EVR. Dintre pacientii care nu au avut EVR, respectiv o scadere a viremiei cu >2 log sau o negativare a acesteia la 12 saptamini de la inceperea tratamentului cu interferon si ribavirin, 54% prezentau virus cu ambele mutatii in gena core si numai 9.7% cu nici o mutatie in aceasta gena. Consideram ca aceste date indica un potential predictiv pentru raspunsul la tratament al muatiilor din gena virala core.

Studiul markerului genetic uman SNP IL28B rs12979860 de catre Partenerul 3 (Institutul de Virusologie „Stefan S. Nicolau”)

Au fost testati 126 de pacienti infectati VHC inclusi in studiu pana in aceasta etapa, (58.9% femei, cu varsta medie 49.2 ± 10.9 ani), netratati anterior. Majoritatea subiectilor recrutati prezinta viremii VHC inalte – valoarea medie a incarcarii virale initiale a fost de 2.4 ± 2.9 x 106 UI / ml (6.1 log UI/ml); numai 28.9% dintre pacienti au avut initial viremie VHC mai mica de 400.000 UI/ml.  A fost analizata prevalenta si polimorfismului regiunii rs12979860 din vecinatatea genei pentru IL28B la pacientii infectati VHC inclusi in studiul HepGen si efectul asupra raspunsului precoce la tratament Testarea s-a realizat prin reactia de discriminare alelica – Custom TaqMan Single Nucleotide Polymorhism Genotyping Assays (Applied Biosystem), pornind de la  ADN-ul genomic purificat din sange integral, conform protocolului optizat in etapa1.  Rezultatele preliminare indica faptul ca majoritatea pacientilor sunt heterozigoti CT (64.4%), in timp ce  homozigotismul este distribuit egal (17.8% CC si 17.8 % TT).  Rate semnificativ mai mari de RVR au fost obtinute la pacientii cu genotipul CC al IL28B (38.5% vs. 8.5%  dintre cei cu genotip CT, p=0.005). Polimorfismul IL28B este, de asemenea, asociat cu rate diferite de evolutie spre ciroza hepatica a pacientilor homozigoti CC fata de pacientii cu genotip heterozigot CT sau homozigoti TT, iar procentul scazut de homozigoti CC din studiul nostru (17.8% CC) ar putea indica o populatie cu multipli factori de predictie negativa.

Stabilirea unui protocol de lucru pentru analiza markerilor de rezistenta la noile tratamente antivirale

În mai 2011, Food and Drug Administration (S.U.A.) a aprobat utilizarea a doua noi antivirale din categoria DAA (“direct acting antivirals”). Cei doi compuşi peptidomimetici, telaprevir şi boceprevir, acţionează direct asupra complexului proteazic viral NS3-NS4A legându-se la centrul catalitic activ. Compuşii nu pot fi folosiţi individual ci doar în combinaţie cu interferonul alfa şi  ribavirina. Acest lucru este justificat de emergenţa rapidă a mutaţiilor de rezistenţă la noile chimioterapeutice. Utilizarea triplei terapii interferon alfa, ribavirină şi telaprevir/boceprevir creşte rata obţinerii răspunsului susţinut la genotipul 1 la aproximativ 70% dintre pacientii tratati. Telaprevir şi boceprevir induc selecţia şi expansiunea rapidă a unor populaţii virale minore ce prezintă rezistenţă  la aceste antivirale. Au fost descrise numeroase mutaţii localizate în regiunea codificatoare NS3 ce conferă grade diferite de rezistenţă la inhibitorii de protează: V36, T54, T55, R155, A156, V170 şi altele.  Terapia cu inhibitori de protează nu este încă introdusă ca tratament standard în România (ci doar pe loturi mici de pacienti, in studii clinice) si nu se cunoaşte profilul de rezistenţă la aceste chimioterapeutice a variantelor HCV circulante la pacienţii din ţara noastră. Pentru atingerea acestui obiectiv, a fost studiată regiunea NS3 protează prin secvenţierea directă. Au fost selectaţi pacienţi cu hepatită cronică cu virus C subtip 1b din lotul retrospectiv furnizat de partenerul 1 (Spitalul V. Babes). In Institutia coordonatoare (IC) ARN viral a fost extras din 140 µL ser utilizand kitul comercial QIAamp Viral Mini Kit (Qiagen). Reverstranscrierea genomului HCV s-a realizat utilizând primeri „random hexamers” (Promega) şi AMV RT (Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, Promega. Secvenţierea directă a ampliconilor am realizat-o cu kitul BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) conform instrucţiunilor producătorului. Fragmentele rezultate în urma reacţiei de secvenţiere au fost analizate prin electroforeză capilară (3130 Genetic Analyzer, Applied Biosystems). Analiza moleculară a regiunii NS3 protează. Pentru 18 din cele 24 probe ser analizate s-a obţinut un amplicon de dimensiunea aşteptată. Analiza mutaţională a întregului domeniu proteazic NS3 (181 amino-acizi) pentru cele 18 probe secvenţiate a relevat existenţa mutaţiei I132V la 12 pacienţi. ). In vitro, această substituţie conferă o rezistenţă scăzută la telaprevir (creştere de 2 ori a concentraţiei eficiente medie [EC50]) (Wyles DL, 2012). Este de menţionat că pacienţii înrolaţi în acest studiu nu au fost trataţi cu telaprevir/boceprevir, în Romania aceste două antivirale nefiind incluse în schema standard de tratament. Celelalte probe nu prezintă mutaţii de rezistenţă la inhibitorii de proteaze (Fig 1).

 

Studiul epidemiologic al factorilor genetici si non-genetici responsabili pentru esecul terapeutic (P1, P2)

P1 (SVB): Recrutarea de pacienti

In cursul anului 2013 au fost recrutati un numar total de 87 pacienti in cadrul Spitalului Victor Babes (SVB). Activitatile legate de recrutare au constat in: informarea pacientilor propusi pentru recrutare despre studiul in care sunt recrutati pentru obtinerea consimtamantului acestora, cu semnarea formularului de consimtamant informat, completarea chestionarelor de recrutare, introducerea in baza de date a studiului a datelor de chestionar si a rezultatelor investigatiilor biologice de ingrijire standard, prelevarea de produse biologice conform protocolului elaborat in etapa I a proiectului, efectuarea testului de incarcatura virala la initierea tratamentului, efectuarea si trasferarea stocurilor de sange si ser catre parteneri si coordonator. Pacientii au beneficiat de ingrijiri standard si investigatii suplimentare suportate de bugetul proiectului. Dintre investigatiile efectuate din bugetul proiectului, in laboratorul spitalului s-au efectuat incarcaturile virale de initiere a tratamentului (T0), tuturor pacientilor, si cea de la saptamana S04, doar pacientilor carora nu le-a fost prevazuta prin ingrijiri standard. Efectuarea testului de incarcatura virala la saptamana 4 de tratament  este inclusa in ingrijirile standard pentru acei pacienti care au avut incarcatura virala de la aprobarea dosarului de tratament peste valoarea de 600.000 UI/mL. Incarcaturile virale din bugetul proiectului au fost efectuate pentru pacientii recrutati la ambii parteneri care au efectuat recrutari in cadrul studiului. Activitatile de monitorizare au constat in consemnarea reactiilor adverse si a rezultatelor investigatiilor biologice si virusologice. Aprecierea raspunsului virusologic la 3 luni de tratament ca predictor al RVS este facuta in mod standard utilizand pragul de 2 log UI/mL de reducere a incarcaturii virale. In analizele noastre pe un lot de 72 pacienti care au fost evaluati la S12, pragul de 3 log este superior ca semnificatie statistica fata de cel de 2 log in separarea pacientilor pe criterii imunologice si genetice umane si virale (genotip HCV, prezenta markerilor de rezistenta la tratament in genomul HCV).

Pe parcursul  etapei, Institutul Clinic Fundeni (P2) a evaluat 26 de pacienti cu infectie cronica VHC la care s-a initiat tratament cu Peginterferon (α2a sau α2b) si Ribavirina („standard of care” pentru infectia VHC in Romania, la momentul actual) si care au indeplinit conditiile stabilite in cadrul consortiului in prima etapa a proiectului de cercetare. Toti pacientii au semnat Consimtamantul Informat pentru participarea la acest proiect de cercetare. Pacientii au fost evaluati la momentul initierii tratamentului prin stabilirea cat mai exacta a duratei infectiei VHC, evaluarea posibililor factori de risc in ceea ce priveste modalitatea de infectare, precizarea  datelor demografice, stabilirea comorbiditatilor, efectuarea  examenului fizic (inclusiv calcularea IMC) si recoltarea probelor biologice (pentru efectuarea  testelor  biochimice uzuale, lucrate in cadrul laboratorului local, si pentru efectuarea testelor speciale stabilite in cadrul consortiului. De asemenea, pacientii au fost evaluati ecografic si prin efectuarea Fibroscan (ca si metoda non invaziva de evaluare a fibrozei hepatice). Evaluarea non-invaziva prin Fibroscan a fost efectuata si pentru o serie de pacienti, participanti in cadrul proiectului HepGen , evaluati si urmariti  de catre partenerul P1.

Dupa initierea tratamentului antiviral, pacientii au fost evaluati la saptamana 4 si 12 (examen clinic, bilant biologic, determinare ARN-VHC, prezenta efectelor adverse, evaluarea tolerantei si aderentei pacientilor la tratament). In saptamana 24 de tratament, pacientii au fost evaluati clinic si prin teste biochimice uzuale, precum si din punct de vedere al efectelor adverse. Pacientii care nu au prezentat EVR, au fost evaluati si prin determinarea incarcaturii virale. Din cei 26 pacienti recrutati in cadrul IC Fundeni, repartitia pe sexe a fost relativ egala (14 femei, 12 barbati), varsta medie fiind 58,83 ani. La initierea biterapiei, 12 pacienti au prezentat valori ale viremiei VHC < 800000 UI/ml. 16 pacienti au fost naivi din punct de vedere al tratamentului antiviral, 10 pacienti fiind retratati. Din punct de vedere al fibrozei (evaluata non-invaziv prin Fibroscan), 2 pacienti au avut F0, 6 pacienti-F1, 8 pacienti-F2, 3 pacienti-F3, 7 pacienti-F4. Din numarul total de pacienti, 2 pacienti au intrerupt tratamentul din proprie initiativa, in saptamana 3 (datorita efectelor adverse altele decat hematologice, respectiv astenie fizica majora, tuse severa). Din cei 26 de pacienti, 4 pacienti (15,4 %)  au prezentat viremie nedetectabila la saptamana 4 de tratament (RVR)  si 11 pacienti (42,3%) au fost cu incarcatura virala nedetectabila dupa 12 saptamani de tratament antiviral. Ca si efecte adverse, pacientii au prezentat anemie (6 pacienti au prezentat anemie grad 1 si 6 pacienti au prezentat anemie grad 2), un pacient prezentand anemie grad 3, care a aparut in saptamana 11 de tratament si care a necesitat administrarea de masa eritrocitara si scaderea dozelor de Ribavirina). Din cei 26 de pacienti  urmariti, 7 pacienti au prezentat trombocitopenie grad 1 iar la 5 pacienti, trombocitopenia a fost de grad 2. Doi pacienti au prezentat neutropenie grad 1 si un pacient a necesitat reducerea temporara a dozei de Peginterferon datorita neutropeniei de grad 3 (aparuta in  cursul saptamanii 40 de tratament) (efectele adverse au fost gradate folosindu-se criteriile DIADS).

Studiul markerilor genetici umani ITPA si HLAB27 realizat de Partenerul 4 (PG)

      Lotul de studiu a fost constituit din 100 de pacienti infectati cu HCV, care au intrunit toate criteriile de selectie stabilite de consortiul partenerilor.   Studiul markerului genetic HLA-B27 a fost bazat pe metodologia multiplex PCR si hibridizare inversa (revers-hibridizare), fiind realizat cu ajutorul kitului IVD GenoQuick HLA-B27 (HAIN), conform recomandarilor producatorului si descrisa amanuntit in raportul anterior. Testarea moleculara in vederea detectiei grupului de alele HLA-B27 prin metoda utilizata a permis identificarea cu acuratete in probele analizate a urmatoarelor alele din grupul HLA-B27 (conform specificatiilor producatorului): *02, *03, *04, *05, *06, *07, *08, *09, *10, *11, *12, *13, *14, *15, *16, *17, *19, *20, *21, *24, *25, *27, *28, *30, *32, *33, *34, *35 si *36.

 

Cele doua polimorfisme din gena ITPA analizate au o frecventa relativ crescuta in populatia umana. Frecventa alelei minore (A) corespunzatoare polimorfismului ITPA 94C>A (rs1127354) raportata in baza de date SNP Database este de 0.081, iar in cazul polimorfismului IVS2 + 21 A>C (rs7270101) frecventa alelei minore C este de 0.074 (SNP Database, National Center for Biotechnology, accesat 22.10.2013). Datele obtinute de noi in lotul de 100 de pacienti infectati cu HCV sunt comparabile cu datele raportate in literatura. Reducerea activitatii enzimei ITPA poate reduce severitatea anemiei in grade diferite, in functie de polimorfismele existente in gena ITPA. Astfel prin realizarea acestui test molecular predictiv se poate realiza selectia pacientilor cu risc de anemie la terapia antivirala (destul de agresiva) cu interferon si ribavirina, care ar putea avea nevoie de trasfuzii de sange sau administrare de eritropoetina in timpul tratamentului.

          In cadrul esantionului de 100 de pacienti analizat in cadrul acestei etape a proiectului, a fost identificata prezenta alelei HLA-B27 in cazul a 6 pacienti infectati cu HCV. Prezenta unei alele HLA-B27 in pana la 8% din populatia de origine caucaziana a fost raportata in literatura, datele fiind similare cu cele obtinute de noi in acest studiu. Asociatia dintre prezenta unei alele HLA-B27 si clearance-ul spontan al HCV a fost raportata atat in populatia de origine caucaziana, cat si in cea de origine afro-americana (Neumann-Haefelin and Thimme, 2007). Monitorizarea in continuare a evolutiei pacientilor din studiul nostru va evidentia prezenta sau dimpotriva, absenta unei corelatii intre prezenta unei alele HLA-B27 si evolutia infectiei cu virusul HCV in lotul de studiu. 

 

Studiul nivelului plasmatic al sCD26 (P3)

Proteina CD26 sau proteina de membrană IV este o glicoproteina de 110 kDa care functioneaza ca dipeptidil-peptidaza (DPPIV) ce cliveaza penultima prolina sau alanina de la capatul ​​N terminal al multor peptide; inclusiv IP-10, aceasta clivare inducand pierdea activitatii chemotactice a IP-10, cu migrare scazuta a celulelor CXCR3 la nivel hepatic.

Optimizarea protocolului de lucru pentru studiul proteinei CD26 solubila

In scopul determinarii nivelului plasmatic al sCD26 am ales un test imunoenzimatic  tip sandwich cu sensibilitate crescuta, ce utilizeaza anticorpi monoclonali antiCD26 peliculizati pe suport solid si detecteaza forma solubila a proteinei cu ajutorul unor anticorpi policlonali conjugati cu biotina. Dupa adugarea substratului streptavidina –peroxidaza formeaza un produs colorat direct proportional cu cantitatea de sCD26 prezent in proba. Detectia cantitativa se realizeaza cu o curba standard, ce include 6 concentratii cunoscute de sCD26 (Fig 3). Probele de ser selectate aleatoriu de la donatori sanatosi testate pentru sCD26 au indicat valori variind intre 296- 1110 ng/ml, cu o medie de 591±179 ng/ml. Limita de detectie a testului este de 7.3 ng/ml sCD26.

In aceasta etapa am testat  83 de pacienti infectati VHC inclusi in studiu, pentru nivelul plasmatic al sCD26 ; rezultatele preliminare indica o valoare medie inalta la initierea terapiei:810 ± 285 ng/mL (120-1650 ng/mL). Valoarea baseline a proteinei sCD26 se coreleaza statistic semnificativ cu valoarea incarcarii virale ARN VHC la debutul terapiei, valoarea transaminazei ALT si procentul de homozigoti CC al IL28B in rs12979860 (cu semnificatie prognostica favorabila), si relativ semnificativ cu gradul de fibroza hepatica evaluata prin testul Fibroscan.

Secventierea integrala a ORF-ului HCV prin electroforeza capilara si o tehnica „next generation” (Co, P4)

Tehnicile de mare randament permit obținerea rapidă a secvențelor unui număr foarte mare de fragmente relativ scurte (30 – 400 baze) de ADN, într-un singur experiment de acest tip putând fi “citite” 0,4 – 30 miliarde de baze, în funcție de platforma utilizată. Volumul mare de informații astfel obținute permite descoperirea unor variante rare virale, identificarea unui număr mare de mutații și estimarea mai exactă a diversității virale prin analiza cvasispeciilor prezente la nivelul unei gazde. Datorită lungimii mai mari a fragmentelor citite, platforma de pirosecvențare 454/Roche permite asamblarea fragmentelor în genomuri complete, chiar daca numărul total al nucleotidelor citite este mai mic. Strategia aleasă pentru a obține ADN-ul necesar procedurii a constat în reverstranscrierea urmată de amplificarea (nested PCR) a 4 regiuni cu lungimi de aproximativ 2500 baze ce acoperă aproape întregul genom (9388 de baze din cele aproximativ 9600 care formează cadrul de citire – ORF, și regiunile netraduse de la capetele 5′ și 3′ – UTR), conform Yao E, 2005. Cei patru ampliconi obținuți de la fiecare pacient au fost apoi fragmentați aleator prin nebulizare, iar la capetele fragmentelor astfel obținute au fost apoi ligați adaptori ce permit amplificarea ulterioară în emulsie și secvențarea. Utilizarea metodei de ligare a unor adaptori la fragmentele bibliotecii permite multiplexarea reacției, fără a fi necesară secvențarea separată a ampliconilor proveniți de la cazuri diferite, prin utilizarea unor “etichete moleculare” (molecular IDs – MIDs) secvențe unice de 10 nucleotide incorporate în adaptori ce vor fi identificate automat de programul de secvențare.

Luând în considerare numărul de 400 milioane de baze ce pot fi citite într-un experiment folosind sistemul 454, lungimea de aprox. 10.000 baze a fragmentelor obținute de la fiecare pacient și numărul de 12 cazuri, rezultă o acoperire medie teoretică de aprox. 3333 ori a fiecărei poziții din genomul HCV. Această acoperire permite detecția variantelor uninucleotidice cu frecvență mai mare de aprox. 3% folosind instrumentele de analiză incluse în sistem (Amplicon Variant Analyzer), sau poate oferi o sensibilitate chiar mai mare (până la frecvențe mai mici de 1%) folosind instrumente software mai noi precum LoFreq, SNVer sau V-Phaser. Sensibilitatea metodei depinde însă de rata de eroare a procesului, datorată în special erorilor introduse de amplificarea PCR și a celor datorate pirosecvențării (homopolimeri, degradarea performanțelor peste o lungime de aprox 350 baze). Prin urmare, pentru a estima eroarea generală asociată metodei utilizate, am inclus în experiment și un genom HCV de control, constând în cDNA al unui izolat de HCV 1b (Con1), clonat în plasmidul pFK, a cărui secvență este cunoscută.

Lotul de studiu. Cei 11 pacienți incluși în acest experiment au fost selectați de partenerii de la Institutul Cantacuzino. Controlul pFK-Con1 a fost obținut prin amabilitatea prof. Ralf Bartenschlager, Univ. Heidelberg.

Prepararea bibliotecilor. Extracția ARN viral din ser, reverstranscrierea in cDNA si amplificarea PCR au fost realizate de catre Co, in Institutul Cantacuzino. Reverstranscrierea a fost realizată folosind primeri specifici, iar amplificarea a fost realizată utilizând PCR în două etape (nested PCR), cu primeri conținând poziții ambigue. Benzile de interes obținute au fost excizate din gel, purificate și produsul cuantificat prin fluorimetrie (sistem Qubit și kituri High-Sensitivity dsDNA). Dimensiunile fragmentelor au fost analizate prin electroforeză microcapilară, folosind sistemul Bioanalyzer 2100 și kituri High Sensitivity DNA de la Agilent. Ampliconii astfel obținuți au fost amestecați echimolar pentru fiecare pacient / control, astfel încât cantitatea totală de ADN să fie mai mare de 500 ng pentru fiecare reacție. Amestecurile de ampliconi au fost apoi fragmentate prin nebulizare cu azot sub presiune, produsul fiind purificat prin elutie pe coloane DNA MinElute (Qiagen). În conformitate cu protocolul producătorului (Roche Rapid Library Preparation Kit), a urmat apoi o etapă de reparare enzimatică a capetelor fragmentelor obținute și ligarea adaptorilor ce includ etichetele MID și sunt marcați fluorescent. Moleculele ADN cu dimensiuni mari de 100 pb au fost selectate prin adsorbție pe microparticule magnetice AMPure XP (Agencourt, Beckman Coulter). Bibliotecile astfel preparate au fost cuantificate prin măsurarea fluorescenței incorporate folosind un sistem Infinite M200 Pro cu placa pentru volume mici Nanoquant (Tecan), realizându-se apoi pentru fiecare probă o diluție stoc de 1 x 107 molecule /  microL. De asemenea, mărimea fragmentelor ce compun bibliotecile a fost analizată folosind electroforeza microcapilară. În final, cantități egale de fragmente provenind de la fiecare probă au fost amestecate, realizându-se astfel biblioteca finală pentru secvențare.

Amplificarea în emulsie. Următorul pas a constat în amplificarea clonală a fragmentelor de ADN, prin capturarea moleculelor de ADN pe microsfere de captură și includerea acestora în picături de mediu de reacție emulsionate în ulei. Urmează o etapă de PCR ale cărei recții se desfășoară clonal în interiorul picăturilor (emPCR). După amplificare, microsferele sunt recuperate din emulsie, iar cele care au găzduit o reacție eficientă de amplificare sunt selectate prin utilizarea de bile magnetice.

Secvențarea și analiza preliminară a datelor. În această etapă am utilizat ambele regiuni ale unei plăci de reacție PicoTiter (Roche), pe care am încărcat microsferele cu ADN. Kitul de reactivi utilizat a fost XLR70 Titanium Sequencing Kit. Datele brute (imaginile) au fost achiziționate folosind software-ul dedicat al sistemului, iar analiza de imagine a fost realizată pe computerul secvențatorului. Procesarea ulterioară a datelor a fost realizată pe un computer de tip cluster (Roche Titanium Cluster – 5 noduri de procesare, 20 procesoare, 32 GB memorie), folosind programul sistemului (gsRunProcessor) și algoritmul destinat analizei secvențelor obținute prin metoda shot-gun. A fost realizat un control de calitate al secvențelor pbținute folosind programul GS Run Browser (Roche). Analiza preliminara a datelor a fost realizată utilizând programul GS Reference Mapper (Roche) și a constat în asamblarea secvențelor citite în fragmente mai lungi (contigs), urmată apoi de compararea acestora cu secvența de referință a izolatului HCV Con1.

Bibliotecile realizate prin ligare au fost cuantificate folosind o curbă standard de fragmente cu concentrații cuprinse între 25 și 1,42 x 108 molecule / microL Rezultatele au fost reproductibile și conforme așteptărilor, pentru toate cazurile preparate obținându-se concentrații între 7 și 20 x 108 molecule / microL. Din punct de vedere al dimensiunii fragmentelor ce formează bibliotecile produse prin nebulizare, rezultatele au fost corespunzătoare tehnic cerințelor protocolului. Astfel, toate probele au generat fragmente cu dimensiunea medie între 500 și 900 bp, mai puțin de 10% din fragmente având lungimi mai mici de 350 bp. În urma filtrării pe baza unor criterii de calitate a rezultatelor brute, au rezultat 1.069.542 de secvențe totalizând 424.886.322 baze. Aceste rezultate sunt concordante cu rezultatele citate în literatura de specialitate, ceea ce califică experimentul de secvențare în categoria celor reuțite din punct de vedere tehnic.

 

În concluzie, rezultatele obținute în această etapă a proiectului se ridică, din punct de vedere calitativ și cantitativ, la nivelul propus în faza de design experimental. Ele vor permite analiza ulterioară a diversității genetice a HCV și identificarea unor mutații cu relevanță clinică.

Determinarea incarcaturii virale pre/post-tratament la 4, 12, 24/48 saptamani si la sase luni dupa tratament (P1)

Analiza raspunsului la tratament exprimat ca reducere a nivelului replicarii virale (SVB)

Incarcatura virala in sangele periferic este un indicator standard pentru evaluarea replicarii virale. Testarea acesteia este principalul indicator si predicitor al succesului terapeutic. Pentru evaluarea incarcaturii virale am utilizat doua metode bazate pe real-time PCR, ambele complet automatizate: Cobas Amplicor Cobas TaqMan (CAP-CTM), Roche si m2000 RealTime, Abbott. Cele doua teste au fost utilizate cu reactivi specifici, fiecare sistem fiind un sistem inchis. Toate testele atat cele specifice studiului (T0 si S04) cat si cele din cadrul ingrijirilor standard, au fost realizate cu metoda CAP-CTM, in timp ce unele probe (n=20) au fost testate cu ambele metode pentru a observa diferentele. In cursul studiului, la inceputul anului 2013, producatorul Roche a pus in vanzare exclusiv un test nou, avand modificat design-ul molecular, astfel incat s-au utilzat pentru monitorizarea pacientilor doua versiuni de test in mod succesiv. Evaluarea paralela pe aceleasi probe a celor doua versiuni CAP-CTM si a testului RealTime m2000 a aratat diferente <0.5 log UI/mL atat intre cele doua versiuni CAP-CTM cat si intre CAP-CTM v2.0 si m2000 Abbott, cea din urma fiind introdusa in martie 2013.

 

 

 

Proiect 88/2012 HepGen

Raport stiintific si tehnic

 

Etapa III

1 decembrie 2013 – 31 octombrie 2014

Corelatii intre factorii virali, ai gazdei si de mediu implicati in progresia bolii si emergenta rezistentei la antivirale

 

 

 

Lotul de studiu al proiectului a fost completat in aceasta etapa cu 107 pacienti infectati cu HCV, care au intrunit criteriile de selectie stabilite de consortiul partenerilor. Astfel, lotul de pacienti la care au fost studiati markerii genetici umani HLA-B27 si ITPA din cadrul acestui proiect a fost de 207 pacienti infectati cu HCV in faza cronica.  In cursul anului 2014, pana la 01Oct2014, au fost recrutati un numar total de 74 pacienti in cadrul Spitalului Victor Babes (SVB) pentru care s-au efectuat testari si stocuri. S-a efectuat monitorizarea in cursul tratamentului standard al hepatitei virale cronice de tip C pentru totalul de 180 pacienti aflati in tratament sau in perioada de urmarire conform protocolului. Au fost efectuate un total de 130 teste de incarcatura virala HCV, pentru pacientii SVB. Activitatile de monitorizare au constat si in consemnarea reactiilor adverse si a rezultatelor investigatiilor biologice si virusologice:

-         Raspunsul virusologic sustinul in cadrul lotului, pentru pacientii cu S72 calendaristic efectuat (N=71), este de 39,4%;

-         La fiecare moment de evaluare in cadrul protocolului (S04, S12, S24, S48), un procent de pacienti aflat intre 6,7% si 13,9%, au prezentat reactii adverse hematologice care necesita scaderea dozelor terapeutice standard sau intreuperea temporara/ definitiva a tratamentului.

Dintre investigatiile efectuate din bugetul proiectului, in laboratorul spitalului Victor Babes (P1)   s-au efectuat incarcaturile virale de initiere a tratamentului (T0), tuturor pacientilor, si cea de la saptamana S04, doar pacientilor carora nu le-a fost prevazuta prin ingrijiri standard (efectuarea testului de incarcatura virala la saptamana 4 de tratament  este inclusa in ingrijirile standard pentru acei pacienti care au avut incarcatura virala de la aprobarea dosarului de tratament peste valoarea de 600.000 UI/mL). Au fost efectuate un total de 130 teste de incarcatura virala HCV pentru pacientii SVB. Activitatile de monitorizare au constat si in consemnarea reactiilor adverse si a rezultatelor investigatiilor biologice si virusologice. Toate datele din chestionarul de initiere a tratamentului si din observatiile de monitorizare au fost incluse in baza de date electronica, conform structurii agreate de consortiu in etapele anterioare ale studiului, informatii ce au fost transferate partenerilor de consortiu la un moment de bilant in cursul anului 2014.

Analiza reactiilor adeverse la tratament: s-a urmarit centralizarea reactiile adverse hematologice gradul III, care au determinat modificarea dozelor de tratament, la toate momentele de evaluare in cadrul protocolului (S04, S12, S24, S48):

-         anemie cu hemoglobina =<10 g/ dL

-         neutropenie cu neutrofile =<750/ microL

-         trobopenie cu trombocite =<50.000/ microL

 

Din cei 26 pacienti recrutati in cadrul IC Fundeni, repartitia pe sexe a fost relativ egala (15 femei, 12 barbati), varsta medie fiind 59,07 ani. La initierea biterapiei, 12 pacienti au prezentat valori ale viremiei VHC < 800000 UI/ml. 17 pacienti au fost naivi din punct de vedere al tratamentului antiviral, 10 pacienti fiind retratati. Din punct de vedere al fibrozei (evaluata non-invaziv prin Fibroscan), 2 pacienti au avut F0, 6 pacienti-F1, 8 pacienti-F2, 4 pacienti-F3, 7 pacienti-F4. Din cei 26 de pacienti, 4 pacienti (15,4 %)  au prezentat viremie nedetectabila la saptamana 4 de tratament (RVR)  si 11 pacienti (42,3%) au fost cu incarcatura virala nedetectabila dupa 12 saptamani de tratament antiviral (EVR). 19 pacienti au obtinut RVS, au fost  7 pacienti non-responderi si 2 pacienti care au prezentat recadere la 24 saptamani post tratament antiviral.

Analiza corelatiilor datelor demografice, clinice, paraclinice cu obtinerea statusului SVR, respectiv cu non- raspunsul la tratament s-a facut prin aplicarea t-test si ANOVA (pentru variabilele continue cu distributie normala),  Mann Whitney U- test (pentru variabilele care nu au distributie normala),  Pearson chi2 test respective Fischer (pentru variabilele categoriale).

In aceasta etapa, la INCDMI Cantacuzino au fost amplificate si secventiate prin metoda clasica in gena HCV core 53 probe (25 seruri provenite de la pacienti naivi din Spitalul V. Babes si 28 seruri provenite de la Inst. Clinic Fundeni, dintr-un lot de pacienti supusi triterapiei). Analiza “in silico’ in regiunea core, realizata pe toti pacientii din lotul Hepgen (153 de tulpini analizate) a permis genotiparea si analiza celor doua pozitii mutante din gena core. Distributia genotipurilor HCV este urmatoarea: 1a – 5,2%; 1b – 91,5%; 3a – 1,96%; 4a – 1,3%. Genotipul 1b ramine majoritar dar se constata o crestere a prevalentei altor genotipuri si subtipuri, specifice utilizatorilor de droguri injectabile. Mutatia in pozitia 70 din gena core a fost prezenta in procent mai mare (56%) la nonresponderi decit la pacientii cu SVR (38,4%), distributia mutatiei 91 nu a fost semnificativa intre cele doua categorii de pacienti (68,7% la nonresponderi versus 69,2% la SVR). In schimb, ambele mutatii au fost prezente la un numar mai mare de nonresponderi decit la pacientii care au obtinut SVR (50% la nonresponderi versus 34,6% la SVR).

Pentru evaluarea profilului de rezistenţă la noile terapii cu antiproteazice a variantelor HCV circulante la pacienţii din ţara noastră la INCDMI Cantacuzino a fost studiată regiunea NS3 protează prin secvenţierea directă a probelor de la pacienti inrolati la P2  (14 seruri dintr-un lot de cu esec terapeutic la biterapie si retratati cu inhibitori de proteaza (3 pacienti tratati cu telaprevir si 11 pacienti tratati cu boceprevir). Pentru evaluarea cauzelor esecului la triterapie (telaprevir sau boceprevir si PEG-IF/ribavirina) in institutia Co (INCDMI Cantacuzino)  aceste probe au fost analizate prin PCR si secventiere capilara atit pentru mutatiile in regiunea core cit si pentru mutatiile in proteina tinta pentru terapia anti-proteazica – proteaza NS3. De asemenea, la P4 (PG) a fost evaluat profilul genetic al acestor pacienti in gena IL28B (polimorfismul rs12979860). In paralel, aceleasi investigatii moleculare au fost realizate pentru un lot control de 14 pacienti, tratati cu biterapia standard si naivi pentru triterapie. Lotul de pacienti tratati cu triterapie a prezentat un profil nefavorabil IL28B – 14,3% genotip TT si genotipul heterozigot CT in proportie de 85,7%. In lotul control, procentele au fost asemanatoare, cu predominanta genotipurilor nefavorabile pentru raspunsul la IFN/ribavirina (TT – 28,6%; CT – 64,3%). Un mic procent de pacienti a prezentat profilul favorabil CC (7,1%).  Privind genotipul viral, toti pacientii din cele doua loturi au fost infectati cu HCV genotip 1b. Mutatiile in gena HCV core (core70, core91 si ambele muatii) au fost prezente la 50% din lotul control. In schimb, in lotul de tratati cu tripla terapie, mutatiile core70 si dubla mutatie 70/91 au fost prezente la 61,5% din probele virale analizate iar mutatia core91 a fost prezenta in proportie de 92,3%. Mutatiile de rezistenta la telaprevir/boceprevir in gena virala NS3. La 4 pacienti cu recadere, tratati cu boceprevir din lotul cu tripla terapie, au fost identificate atit mutatiile de rezistenta la boceprevir: 54S, 156S cit si mutatiile de rezistenta la telaprevir (doua mutatii fiind comune pentru ambii inhibitori de proteaza): 54S, 132V, 156S. Cu exceptia a doi pacienti, mutatia 132V la telaprevir a fost detectata la toate cazurile de non-responderi si recadere la boceprevir sau telaprevir. Aceasta mutatie la telaprevir a fost prezenta si la 10 din cei 14 pacienti naivi pentru inhibitorii de proteaza.

Analiza moleculara prin secventiere next generation (tehnologia Next Gen Sequencing Roche FLX 454). P1, Co si P4  au fost implicati in selectarea unor tulpini virale pentru secventierea extinsa a genomului: 4 tulpini dintr-un lot retrospectiv de pacienti care au incheiat tratamentul – 2 cu raspuns sustinut (SVR) si 2 cu non-raspuns/recadere si 7 tulpini din lotul HepGen de la pacienti naivi pentru tratament, carora li s-a efectuat analiza virala la momentul T0, inainte de a primi prima doza din tratament.

Stabilirea corelatiilor intre markerii serologici (ITPA si HLA-B27), virali si genetici umani, determinarea incarcaturii virale pre/post-tratament la 4, 12, 24/48 saptamani si la sase luni dupa tratament si optimizarea protocolului de lucru pentru studiul SNP al markerilor genetici umani ITPA si HLA-B27 au condus la urmatoarele concluzii:

-         s-a constatat o asociere semnificativă din punct de vedere statistic (Fisher exact P=0.026) în cadrul lotului de femei între combinația de genotipuri A (wt/wt) a markerului ITPA și nivelul scăzut al hemoglobinei la săptămâna 4 de tratament. Aceasta semnificatie statistica nu s-a mai regasit la saptamana 12 in lotul de pacienti de sex feminin studiat (P=0.1467); nu s-a observat asociere semnificativa statistic intre nici o combinatie de genotipuri ITPA si nivelul scazut de hemoglobina în cadrul lotului de pacienți de sex masculin (P=0,12);

-         prezenta grupului aleleic HLA-B27 a fost detectata la 5,31 % pacienti cu HCV din lotul studiat, rezultat semnificativ statistic diferit de  prezenta acestui grul allelic HLA in populatia romaneasca generala (p=0.0470);

-         Analiza statistica a relatiei dintre prezenta grupului de allele HLA-B27 si raspunsul RVR al pacientilor din cadrul esantionului nostru nu a evidentiat diferente semnificative statistic intre esantionul de pacienti cu RVR la care a fost detectata alela HLA-B27 si la care nu a fost detectata alela HLA (p=0.28004).

           

 

 

OBIECTIVELE SPECIFICE ALE PARTENERIATULUI:

1. Imbunatatirea starii de sanatate a pacientilor si eradicarea hepatitei C prin transferul in clinica a datelor rezultate din cercetarea stiintifica

2. Dezvoltarea unui algoritm bazat pe factori virali si markeri genetici umani utilizabil in predictia raspunsului la tratamentul cu antivirale

3. Transferul rezultatelor proiectului la autoritatile decidente din domeniul politicii sanitare

4. Investigarea factorilor virali asociati raspunsului viral nul (genotip, variabilitate, cinetica incarcaturii virale)

5. Studii epidemiologice si corelarea factorilor virali cu factorii genetici si non-genetici umani

6. Elaborarea si transferul SOPs (“standard operating procedures”) si MOOs (“manual of operations”) intre partenerii consortiului

7. Construirea unor colectii de izolate virale, ADN uman si a unei banci de date pentru pacienti

8. Crearea unei retele de excelenta dedicata studiului hepatitei C conectata la retelele similare nationale si internationale

Tendințele Gripei în România: 2012 – 2013 Google
Risc Intens
Risc Ridicat
Risc Moderat
Risc Scazut
Risc Minim
Tendintele Gripei in Romania
iunie 2012
iunie 2013

Google Flu Trends, un instrument care furnizează estimări aproape în timp real ale incidenţei gripei în mai multe regiuni ale globului, este disponibil acum şi în România la adresa google.org/flutrends/intl/ro.

Google a constatat că anumiţi termeni de căutare referitori la gripă sunt frecvent utilizaţi în fiecare an în perioada epidemiilor de gripă. Comparând numărul de căutări online cu datele din sistemele tradiţionale de supraveghere a gripei, Google a dezvoltat Flu Trends, ce constituie un sistem util de avertizare în privinţa unor noi epidemii de gripă. 

În România, Google Flu Trends utilizează tendinţele observate în interogările de căutare timp de mai multe sezoane, coroborate cu datele oficiale furnizate de Institutul Naţional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie-Imunologie Cantacuzino (INCDMI – Cantacuzino). 

“Localizarea sistemului Google Flu Trends şi pentru România va furniza informaţii utile şi va semnala tendinţe care pot fi de un real ajutor sănătăţii publice. Folosirea căutărilor online pentru completarea supravegherii naţionale, convenţionale a gripei, va facilita şi va direcţiona măsurile de control, întrucât alerta debutului unei epidemii va putea fi făcută în avans cu cel puţin 7 zile faţă de raportările oficiale ale cazurilor”, a declarat dr. Viorel Alexandrescu, medic primar, doctor în ştiinţe medicale,  Şeful Centrului Naţional de Gripă din reţeaua OMS, INCDMI – Cantacuzino

“Google Flu Trends şi-a dovedit deja eficienţa în monitorizarea epidemiilor şi pandemiilor de gripă în aproape 30 de ţări, şi suntem foarte bucuroşi să colaborăm cu Institutul Cantacuzino pentru a pune la dispoziţia medicilor şi a publicului larg un instrument gratuit ce poate contribui la menţinerea sănătăţii pe perioada sezoanelor de gripă, prin detectarea timpurie a unei epidemii”, a declarat Dan Bulucea, director general Google România. 

Graficele Google Flu Trends sunt bazate pe date anonime şi cumulate provenind de la milioane de căutări Google efectuate în timp, iar rezultatele afişate sunt generate de un sistem automatizat. 
Mai multe informaţii despre Google Flu Trends puteţi afla accesând Flu Trends video.