Parteneriate in domenii prioritare , contract PAR 61/026

Titlul: Realizarea unui nou test tuberculinic cutanat pentru revelarea hipersensibilitatii de tip intirziat prin tehnologii avansate, cu utilizarea antigenelor recombinante specifice pentru diagnosticul tuberculozei latente si active

Coordonatorul proiectului: INCDMI Cantacuzino, Bucuresti, are experienta cea mai bogata in acest domeniu. Incepind din 1965, Institutul Cantacuzino produce PPD IC-65, reactiv biologic de uz uman, aprobat de Agentia Nationala a Medicamentului care este utilizat de intreaga retea nationala de penumoftiziologie.

Partenerul 1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, Bucuresti, coordoneaza reteaua de tuberculoza din Romania. Toti participantii la proiect au activitate in proiecte de colaborare internationale privind controlul si managementul tuberculozei.

Partenerul 2, Spitalul Clinic de Boli Infectioase si tropicale Victor Babes, Bucuresti, are cea mai mare competenta in domeniul clinic referitoare la infectiile HIV/SIDA asociate cu tuberculoza, la copii si la adulti.

Partenerul 3, Catedra de Microbiologie a Universitatii de Medicina si Farmacie Carol Davila, Bucuresti, are experienta practica si didactica in domeniul tuberculozei, a cercetarii si implementarii de proiecte la nivel national si international.

Proiectul se refera la realizarea unui nou test tuberculinic cutanat, un reactiv biologic, de uz uman, pentru evidentierea hipersensibilitatii de tip intirziat prin intradermoreactie ( IDR), pentru diagnosticul tuberculozei latente si active, aplicind tehologii avansate.

Obiectivul I : Prepararea PPD recombinant :

• cautarea secventelor de gene care codifica proteinele specifice doar pentru Mycobacterium tuberculosis;
• cultivarea M.tuberculosis H37Rv si M. bovis BCG;
• clonarea si supra-exprimarea proteinelor in E.coli ;
• purificarea proteinelor recombinante;
• formularea noului PPD

Etapa I: 15.09.2007- 15.12.2007

Activitatea I. Prepararea PPD recombinant (I)

• A fost efectuata documentarea referitoare la secventierea genelor codificatoare doar pentru proteinele specifice pentru M.tuberculosis ( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68)
• A fost initiata obtinerea unui PPD nedenaturat termic. La momentul raportarii, cultura de M.tuberculosis H37Rv pe mediul lichid Sauton, este incubata la 37 C.
• Cultivarea M.tuberculosis H37Rv (tulpina de referinta) si M.bovis BCG.                     Tulpinile, liofilizate, au fost cultivate pe mediul solid Lowenstein-Jensen, si incubate la 37ºC , 28 zile ( fiind lent crescatoare); au fost recoltate celulele bacteriene de M.tuberculosis H37Rv si M.bovis BCG crescute pe mediul Lowenstein-Jensen si au fost stocate la -80C; a fost initiata obtinerea  M.bovis BCG de pe suprafata mediului lichid Sauton. La momentul raportarii, cultura M.bovis BCG  era incubata la 37 ºC

.

Partnership in prioritary fields. contract PAR 61/026

Title : Development of a new reagent for TB skin testing, in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity by advanced technologies, using specific recombinant antigens for the diagnosis of latent and active tuberculosis

Project coordinator “Cantacuzino” Institute, Bucharest, possesses extensive experience in this field. Since 1965, PPD IC-65, biological reagent for human use, produced by “Cantacuzino” Institute, approved by National Agency of Drugs and it is used by all the medical and TB network.

Partner 1, “ Marius Nasta” Pneumophtisiology Institute, Bucharest, is dealing with TB network management in Romania. All the project participants are active in international collaborative research concerning TB control and management

Partner 2, „Dr. Victor Babes” Infectious and TropicalDiseasesClinicalHospital Bucharest, has the highest competence in the clinical field, of AIDS infections associated with tuberculosis, on children and adults.

Partner P3, Microbiology Chair of “Carol Davila “ University of Medicine and Pharmacy , Bucharest, has practical and teaching experience on TB, research and project implementation at national and international level.

The project deals with the development of a new reagent for tuberculosis (TB) skin test in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity (DTH), applying advanced technologies.

Objective I. Preparation of recombinant PPD :

• Search for gene sequences coding for proteins specific only to Mycobacterium tuberculosis,
• culture of M.tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG,
• cloning and over-expression of proteins in E.coli,
• purification of recombinant proteins,
• new PPD formulation

Stage I. 15.09.2007- 15.12.2007

Activity I Preparation of recombinant PPD ( I)

• Documentation for gene sequences coding for proteins specific only to M. tuberculosis( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68) was performed.
• The preparation of PPD  from unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv was started. At the end of the first stage, the culture of M. tuberculosis H37Rv on Sauton medium, was incubated at 37 ºC.
• Culture of M. tuberculosis H37Rv (reference strain) and M. bovis BCG (Romanian “daughter” strain) was started. M. tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG, freeze dried, were cultivated on solid Lowenstein-Jensen media, 28 days, at 37°C, being slow growers: the cells were stored at -80°C. M. bovis BCG culture on liquid Sauton medium was incubated at 37 ºC at the end of the first stage.

Etapa II : 15.12.07- 15.06.08

A fost continuat Obiectivul 1, prin:

Activitate I.2 continuare: Preparare PPD nedenaturat termic si obtinere corpi bacterieni din Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG si Activitate I.3  Clonarea si supra-exprimarea proteinelor existente doar in M. tuberculosis

Rezultate:

1. Testele de control (identificare, profilul biochimic si de contaminare bacteriana si fungica) au demonstrat puritatea si conformitatea culturilor de M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, subtulpina romaneasca.
2. Au fost preparate doua tipuri de PPD, PPD-ul obtinut din filtratul de cultura de M. tuberculosis H37Rv nedenaturat termic ( prin filtrare sterilizanta cu filtre cu diametrul porilor de 0.2 mµ) si PPD din filtratul culturii autoclavate de M. tuberculosis H37Rv.
3. Vectorii pET24a si pET28a au fost obtinuti ca stoc plasmidic folosind Qiagen Plasmid Maxi Kit.
4. Insertul (gena de interes) s-a obtinut prin amplificare enzimatica (PCR) folosind ca matrita ADN genomic preparat anterior si primerii (amorsele).
5. Testarea coloniilor care contin plasmidele corecte s-a facut prin miniprep si restrictie enzimatica sau prin PCR, folosind primeri complementari cu secvente din T7 Promotor si T7 Terminal. Pentru obtinerea plasmidelor prin miniprep s-a folosit kitul Qiagen (QIAprep).

Etapa III : 16.06.08-15.01.2009

A fost continuata prepararea PPD recombinant (2) si initiata realizarea obiectivului II al proiectului si anume:

Testarea in vivo a PPD recombinant (pe cobai si oameni, comparare cu PPD IC-65,de referinta si cu metoda cu IFN- γ).

In aceasta etapa, au fost prevazute urmatoarele activitati, care vor fi efectuate  pina la finalizarea proiectului:

Activitatea II.1. Testarea PPD recombinant pe cobai.

Activitatea II.2. Alegerea PPD recombinant cu un singur antigen sau cu un amestec multiantigenic.

Rezultate:

1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea proteinelor recombinante specifice M. tuberculosis, CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09). Continutul proteic al CFP10 purificat, determinat prin metoda Bradford, a fost de 0,41 mg/ml.

2.  Testarea pe cobai  a PPD r (CFP10) :

• Varianta 6, 500 UT/0,1 ml din PPD r (CFP 10 recombinant) ,a dat rezultatul cel mai bun. Dat fiind ca animalele imunizate raspund uneori aberant, cobaii sensibilizati cu 200 UT/ 0,1 ml, nu au prezentat nici o arie de eritem la PPDr, iar la cei sensibilizati cu 10 UT/0,1 ml, deci concentratia cea mai mica de proteina, aria de eritem a fost vizibila si potenta PPD r a reprezentat 31,26 % din aceea a PPD de referinta, IC 65 2 UT.
• Ca urmare a rezultatelor obtinute prin intradermoreactia la cele 6 variante de PPD recombinant , s-a initiat testarea hipersensibilitatii de tip intirziat pe 2 serii de cobai sensibilizati cu suspensii de M.tuberculosis si M.bovis BCG.
• Datele din literatura confirma faptul ca atunci cind se foloseste un singur antigen, chiar daca acesta este specific, intradermoreactia este mai slaba decit in cazul utilizarii unui amestec de mai multe antigene.

3.    In acest scop, in etapa III am inceput prepararea altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Etapa IV : 16.01.09- 15.12.09

Preparare PPD recombinant (2):

Activitate I.3 :Supraexprimare proteine specifice M. tuberculosis. Supraexprimare si extragere proteine recombinante

Activitate I.4 Purificarea proteinelor recombinante; Obtinere proteine recombinante purificate specifice

A fost continuata  activitatea, inceputa in etapa anterioara, de preparare a altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Obiectivul prevazut a fi realizat de Partenerul 1, in colaborare cu Coordonatorul de proiect,  a fost Activitatea II.2 Alegere antigen sau amestec multi-antigenic (a). Participantii la realizarea proiectului, din partea Partenerului P1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, au colaborat la studiile premergatoare, care trebuie efectuate vederea testarii unui PPD recombinant.

Rezultate:

1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea unei proteine recombinante specifice M. tuberculosis , MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64.

Din 500 ml cultura E.coli, s-au obtinut 97 mg proteina totala solubila si 0,8 mg MPT 64 purificat.

2.  Testarea pe cobai  a PPD r.

• In 3/4 experiente, CFP 10 a fost specific.
• In 2/4 experiente ESAT 6 a fost specific.
• In 2/3 experiente MPT 64 nu a fost specific.
• In viitoarea serie de experiente, dupa ce se imunizeaza cobaii cu M. tuberculosis si Mycobacterium bovis BCG, dupa 6-7 saptamini, trebuie testat un nr minim de cobai/antigen recombinant, iar in saptamina urmatoare se va face testarea pe un numar semnificativ.

3. Au fost stabilite conditiile de testare comparativa a PPD IC-65 fata de etalonul international OMS, si anume PPD RT 23, 2 UT, produs de Staatens Serum Institut, Copenhaga, Danemarca, la copii cu tuberculoza.

In urma calculelor statistice,se poate trage concluzia ca dimensiunile reactiilor locale in cazul Seriei experimentale  09-02 TC, 2 UT/ 0,1 ml pot fi   considerate ca fiind echivalente cu cele produse de  tuberculina de referinta, PPD RT 23, 2 UT.

Stage II. 15.12.2007 – 15.06.2008

The Objective I was pursued, by

Activity I.2. Preparation of non-thermally denaturated PPD and obtention of bacterial cells from Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG

Activity I.3. Cloning and overexpression of proteins uniques for M. tuberculosis

Results

1. Control assays (identification, biochemical profile, bacterian and fungical contamination) proved the purity and conformity of M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, Romanian sub-strain.

2. Two PPDs were prepared : PPD from the unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv (by sterilization through filters with 0.2 mµ pore size) and  PPD from heated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv.

3. The plasmids pET24a and pET28a were obtained using Qiagen Plasmid Maxi Kit.

4.The insert  was obtained by enzymatic amplification ( PCR) using as matrix the genomic DNA , previously prepared and the primers.

5. The screening of plasmid containing colonies was performed by miniprep and enzymatic restriction or PCR, using  complementary primers with T7 Promotor and T7 Terminal sequences. Qiagen (QIAprep) kit was utilized in order to obtain the plasmids by miniprep.

Stage III : 16.06.08-15.01.2009

Recombinant PPD preparation (2) was continued and initialized the  Objective II, namely:

In vivo testing of recombinant PPD (on guinea pigs, human, comparison with reference PPD IC-65 and IFN- _ assays)

The following activities, from this point till the completion of the project, were planned:

Activity II.1 Testing of recombinant PPD on guinea pigs

Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD

Results.

1. The overexpression and extraction of M. tuberculosis , CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09) specific recombinant proteins was performed. The protein content of purified CFP10, determined by Bradford assay , was 0.41 mg/ml.

2. PPDr ( CFP 10) guinea pigs testing

• 500 UT / 0.1 ml PPDr concentration  proveded the best result. Because sometimes the animals gave an abherant response, the 200 UT/0.1 ml sensitized guinea pigs, didn`t present any eritem area when PPDr was injected, while on those sensitized with 10 UT/0.1 ml, the lowest protein concentration, the eritem area was visible and PPDr potency represented 31.26 % from that of the reference PPD, IC 65 , 2 UT/0.1ml.
• Due to skin test results obtained with 6 different PPDr ( single or cocktails of recombinant antigens), the delayed type  hypersensitivity  was initiated, on two guinea pigs groups, immunized with M.tuberculosis and M.bovis BCG.
• Published data confirm the fact the, when using a single antigen, even if it is specific, the skin test is weaker then when using a multi-antigenic cocktail.

3. Therefore, in stage III, we started preparing other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Stage IV : 16.01.09- 15.12.09

Preparation of recombinant PPD (2)

Activity I.3. Overexpression and extraction of recombinant proteins, uniques for M. tuberculosis

Activity I.4. Purification of specific recombinant proteins

We continued the preparation of  other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

The Objective, planned to be performed by Partner 1, in collaboration with Project coordinator, was Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD (a). The participants, from Partner P1, Marius Nasta Pneumophtisiology Institute, collaborated to the mandatory studies, in order to test a recombinant PPD.

Results

1. The overexpression and extraction of a specific M. tuberculosis recombinant  protein, MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), using the recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, was accomplished.

97 mg of soluble total protein and 0,8 mg purified MPT 64 were obtained from 500 ml E.coli culture.

2.  PPDr guinea pigs testing

• In 3 out of 4 experiments, CFP10, proved to be specific.
• In 2 out of 4 experiments, ESAT 6, proved to be specific.
• In 2 out of 3 experiments, MPT 64, proved not to be specific.
• For the next series of experiments, 6-7 weeks after the guinea pigs immunization with M. tuberculosis and M. bovis BCG, a low number of animals/ recombinant antigen must be tested, followed by a next week testing on a significant number of animals

3. The conditions for comparative testing of PPD IC 65 against the WHO international tuberculin standard, PPD RT23, 2 TU/0.1ml, produced by Staatens Serum Institut, Copenhaga, Denmark, on children with tuberculosis,   were established.

Following statistic calculations, the conclusion was that tuberculin skin test reactions for experimental series 09-02 TC, 2 TU/ 0.1 ml could be equivalated with those evidentiated  by reference tuberculin, PPD RT23, 2 TU/0.1ml.

Acronim: HMGB

Titlu:

NOI COMPUSI NATURALI IMPLICATI IN MODULAREA ACTIVITATII HMGB-1, CITOKINA PROINFLAMATOARE TINTA IN TRATAMENTUL SOCULUI SEPTIC SI IN TERAPIA BOLILOR NEOPLAZICE MALIGNE

Director Proiect: Dr. Lidia Cremer

Proiectul este coordonat de Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

Parteneri :

1. Donatur GmbH, Germania (partener extern)
2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica, Bucuresti
3. Universitatea de Medicina din Craiova
4. Universitatea “Titu Maiorescu”, Bucuresti
5. 
   

Partenerul extern (Donatur GmbH din München, Germania) este o firma cu o experienta profesionala foarte vasta in izolarea si caracterizarea unor noi substante medicamentoase din extracte naturale.

Rezumatul proiectului:

Socul septic este un proces inflamator sistemic indus de infectii bacteriene severe. Mortalitatea mare este determinata in parte de endotoxine si de alte componente bacteriene, care prin activarea monocitelor, macrofagelor produc citokine proinflamatoare precum factorul de necroza tumorala-a (TNF-a), interleukina-1b (IL-1b), interleukina-23 (IL-23), dar si radicali toxici de oxigen sau azot, High-Mobility-Group Box-1 (HMGB-1) sau alti mediatori ai inflamatiei. HMGB-1 este o proteina cromozomiala, abundenta, conservata, fiind atat un factor de transcriere cat si o citokina intracelulara cu activitate proinflamatoare. Ipoteza ca HMGB-1 are un rol decisiv atat in socul septic cat si in alte procese inflamatoare cronice (artrita reumatoida) a fost confirmata de concentratia puternic crescuta a acestei citokine. Observatiile experimentale au relevat ca inhibarea activitatii HMGB-1 sau blocarea secretiei ei extracelulare este benefica pentru tratarea socului septic sever si a artritei reumatoide.

In ultimii ani au fost cercetate mecanismele moleculare prin care HMGB-1 participa la inducerea si evolutia socului septic, inclusiv la instalarea starii de sepsis si moarte. Cercetari mai recente au evidentiat faptul ca in socul endotoxic produs la animale se remarca in primele ore o crestere brusca a exprimarii citokinelor proinflamatoare (TNF-α sau IL-2), pe cand concentratia de HMGB-1 creste abia dupa 24 de ore si este maxima la 36 de ore cand se instaleaza faza de sepsis. Rezultatele slabe in tratarea socului septic cu  anticorpi anti-TNFα, respectiv cu receptor pentru IL-2 (IL-2R) au confirmat ipoteza ca blocarea actiunii acestor citokine proinflamatoare nu este o tinta decisiva. Astfel, atentia celor care cauta remediu pentru socul septic s-a orientat asupra HMGB-1, un posibil factor decisiv in “inflammatory over-reaction” a sistemului imun cu consecinte patologice dramatice.

O alternativa promitatoare pentru terapia socului septic sau a inflamatiei cronice (ex. artrita reumatoidă) ar fi găsirea unor produşi naturali capabili să moduleze exprimarea, transportul membranar, respectiv actiunea HMGB-1. Avantajul substantelor naturale mici in comparatie cu anticorpii monoclonali este evidentă, deoarece eficienta proteinelor monoclonale este limitata in timp din cauza formarii de anti-anticorpi, precum si din cauza altor efecte secundare alarmante. Identificarea unor substante naturale noi obtinute din plante, organisme marine sau surse bacteriene si obtinerea lor pe scara mai mare este o problema dificila, cu solutii diferentiate in fiecare caz. Autoritatile de omologare a medicamentelor au pretentii foarte exigente pentru validarea procesului tehnologic de obtinere, pentru controlul analitic al continutului, pentru dozarea sensibila a impuritatilor si limitarea stricta a tuturor acestora. Rezolvarea acestor probleme complexe conform prescriptiilor Agentiei Europene de Medicamente (EMEA) este o tinta cheie a prezentului proiect, in vederea asigurarii reproductibilitatii rezultatelor ce urmeaza a fi obtinute.

Pe de alta parte, s-a demostrat că in cazul bolilor neoplazice maligne, eliberarea proteinei HMGB-1 de catre celulele transformate malign este obligatorie pentru activarea celulelor dendritice ale gazdei, in vederea procesarii si prezentarii antigenelor tumorale. S-a evidentiat faptul că HMGB-1 interactioneaza cu receptorii Toll-like-4 (TLR-4) de pe celulele dendritice, care sunt implicati selectiv in activarea limfocitelor T antitumorale in vivo. In privinta corelatiei dintre raspunsul la chimioterapie si expresia HMGB-1, s-a demonstrat recent că celulele maligne HMGB-1 negative („deficiente”) sunt de 3-10 ori mai rezistente la acţiunea chimioterapicelor, comparativ cu celulele maligne pozitive pentru HMGB-1. Celulele HMGB-1 deficiente se caracterizeaza prin compromiterea inhibarii ciclului celular si prin reducerea activarii caspazelor. Aceste date au impus HMGB-1 ca proteina tinta pentru modularea chimioterapiei.

Datele de literatura relatate mai sus au determinat elaborarea propunerii acestui proiect de cercetare care va urmari:

-          identificarea şi tehnologia de obţinere a unor compusi naturali obtinuti din plante care, prin modularea activitaţii sau prin inhibarea eliberării extracelulare a HMGB-1, ar deveni o opţiune terapeutică pentru socul septic sever sau pentru posologii in inflamatii acute sau cronice;

-          identificarea unor compusi obtinuti din extracte bacteriene, compusi cu  acţiune de agonist ai TLR, cu capacitate de a eficientiza chimio- si radioterapia bolilor tumorale.

Rezultatele stiintifice obtinute vor constitui baza dezvoltarii unor biotehnologii performante in domeniul produselor naturale bioactive, in scopul obtinerii de bioproduse de inalta selectivitate.

Obiectivele generale ale proiectului vizeaza dezvoltarea de terapii medicale şi eficientizarea sistemului de sănătate publică si urmaresc:

-       izolarea prin biotehnologie extractiva de noi compusi naturali capabili sa moduleze producerea sau inhibarea HMGB-1 de catre celulele mieloide sau tumorale;

-       identificarea si obtinerea prin tehnologiile elaborate a unor compusi naturali cu potential de utilizare ca medicamente cu actiune antiinfectioasa, antiiflamatoare sau antitumorala.

Obiective specifice ale proiectului:

1. I.      Adaptarea unor tehnologii pentru obtinerea din extracte de plante sau bacteriene a unor compusi naturali cu activitate de modulare a producerii HMGB-1;
2. II.      Caracterizarea analitica a fractiunilor si/sau a compusilor naturali obtinuti;
3. III.      Elaborarea de modele experimentale in vivo si in vitro si aplicarea acestora in vederea caracterizarii fractiunilor si/sau compuslor naturali obtinuti, ca agenti antiinfectiosi, antiinflamatori sau antitumorali;
4. IV.      Obtinerea de fractiuni sau compusi naturali adecvati unor teste farmacologice si efectuarea acestor teste; elaborarea tehnologiei de obtinere la nivel de laborator a unui compus natural promitator.

Etapa I (raportare 6 februarie 2009): Analizarea tehnologiilor  de  obtinere  si  a  metodelor

de testare a extractelor de plante sau bacteriene cu capacitate de modulare a producerii HMGB-1

Rezumatul Etapei 1:

In prima etapa de derulare a proiectului de cercetare s-au realizat studii documentare privind modelele experimentale in vitro si in vivo aplicabile pentru evidentierea activitatilor imunologice si farmacologice ale extractelor de plante, potential utilizabile in tratamentul antiinflamator, cel al socului septic sau in chimio si radioterapia bolilor neoplazice maligne.

Pentru identificarea extractelor naturale cu prezumtiva actiune de modulare a factorului HMG1, au fost alese cateva plante care au actiune antiinflamatoare confirmata de date farmacologice si imuno-farmacologice controlate.

S-a procedat la prepararea unor extracte primare, fractionarea lor prin extractii selective, apoi caracterizarea compozitiei extractelor.

In vederea studierii activitatii antiinflamatoare si/sau imunomodulatoare a compusilor izolati, au fost selectate si precizate urmatoarele modele experimentale in vitro si in vivo:

- stimularea monocitelor/macrofagelor umane cu LPS la nivel de TLR-4 si cuantificarea expresiei Dectin-1 prin tehnica citometriei in flux;

- modularea producerii de TNFa si NO in macrofage murine activate la nivel de TLR-4;

- testarea capacitatii antioxidante si modularea producerii speciilor reactive de oxigen din macrofage murine si celule polimorfonucleare umane;

- modularea producerii de citokine in vitro (TNFa, IL-10, IL-12p40 etc) de catre macrofage murine si celule PMN umane activate la nivelul receptorilor TLR si Dectin-1;

- modularea socului endotoxic in vivo (soareci Balb/c);

- modularea secretiei extracelulare a HMGB-1 din celule mieloide activate;

- inhibarea cresterii celulelor tumorale utilizand modele experimentale in vitro si in vivo;

Pentru studierea activitatii farmacologice, au fost elaborate si precizate urmatoarele modele experimentale in vivo:

- peritonita septica indusa prin ligaturarea si perforarea cecului;

- metode farmacologice de testare a activitatii antiinflamatorii: modelul edemului urechii de soarece sau sobolan; modelul edemului labei de sobolan (prin diferiti agenti iritanti).

Oiectivele primei etape de executie a proiectului au fost realizate in intregime, ceea ce va permite ca in final sa putem identifica compusi antiinflamatori eficienti.

Etapa 2 (raportare 15 decembrie 2009): Obtinerea de substante active, caracterizarea capacitatii lor antiinflamatoare si de ameliorare a socului septic

Rezumatul Etapei 2:

In a doua etapa de derulare a proiectului de cercetare au fost purificate o serie de extracte naturale si s-au realizat studii privind capacitatea antioxidanta a acestora si potentialul lor de a inhiba SRO si NO.

Utilizand metode cromatografice performante (HPFC, HPLC preparativa), partenerul Donatur GmbH a obtinut extracte naturale pe care le-a testat din punct de vedere al activitatii lor biologice. Unele dintre acestea au inhibat semnificativ maturarea celulelor dendritice in vitro, proliferarea limfocitelor T alogenice, dovedind astfel posibila eficacitate in boli autoimune. Dintre fractiunile cu efect de suprimare a maturarii celulalor dendritice, unele s-au dovedit toxice. Examinarea influentei extractelor purificate analizate asupra ATP-azei de sodiu/potasiu, respectiv de calciu, a dovedit ca actiunea lor asupra ATP-azelor de ioni alcalini are o semnificatie redusa.

Sase extracte izolate si purificate de catre partenerul Donatur GmbH au fost investigate in cadrul Laboratorului Imunomodulare in ceea ce priveste capacitatea antioxidanta si potentialul de a inhiba SRO si NO.

Utilizand modele experimentale atat in sistem acelular (ORAC, capacitatea antioxidanta totala, Griess acelular), cat si in sistem celular (chemiluminometrie cu luminol) s-a demonstrat ca:

- Extractul purificat MCS A213 (1, 5 si 10μg) este un potential epurator al radicalilor de oxigen;

- Extractele MCS Db213, MCS De213, OCS CD154 si OCS D155 manifesta proprietati imunomodulatorii;

- MCS Ab213 reprezinta un potential agent terapeutic antiinflamator, scazand (dependent de doza) productia de SRO in celule PMN umane nestimulate sau stimulate cu Pam3Cys;

- Compusii testati nu si-au dovedit calitati de epuratori ai speciilor reactive de azot.

Consideram ca prin aplicarea modelelor experimentale elaborate si precizate in aceasta faza de derulare a proiectului se vor putea selecta compusi bioactivi eficienti in tratamentul proceselor inflamatorii, in special cronice, stiut fiind ca acestea favorizeaza dezvoltarea bolilor neoplazice maligne.

Crescătoria de animale de laborator- ANIMALERIA-SPF

Animaleria SPF a fost amenajată în cadrul Institutului Cantacuzino, Staţiunea Băneasa în anul 1998. Amenajarea ei s-a făcut într-un pavilion construit în anul 1944, la care s-a consolidat doar parterul unde s-a amenajat Animaleria. Animaleria a fost construită de către filiala din Ungaria a firmei americane Charles River. De asemenea animalele şi toate echipamentele au fost livrate de această firmă. Laboratorul de experimentare a fost amenajat la etajul Animaleriei în 1999. Animaleria SPF este singura crescătorie de animale de laborator libere de germeni patogeni din ţară, iar performanţele experimentale ale acestor animale sunt de nivel internaţional. Facilităţile majore sunt oferite de animalele libere de germeni patogeni specificaţi şi de laboratorul de experimentare.

Caracteristicile animalelor produse în Animaleria SPF (animale libere de germeni patogeni şi cu o stabilitate microbiologică şi genetică maximă) şi a laboratorului de experimentare (aparatură de ultimă generaţie şi de maximă precizie) conduc la performanţă în toate cazurile de utilizare a acestora. Prin calitatea animalelor şi a furajelor produse, a testelor efectuate (calitate confirmată de controalele sanitare efectuate regulat la laboratoare neutre, controale efectuate în conformitate cu reglementările europene în domeniu) toate experimentele şi testările efectuate au demonstrat superioritatea acestui tip de animale. Implementarea legislaţiei comunitare privitoare la protecţia animalelor utilizate în scopuri experimentale va conduce în viitor la utilizarea doar a acestui tip de animale.

La infrastructura prezentă vor fi interconectate structuri de cercetare ce ar crea noi servicii suport:

- laborator de anatomie patologică

- laborator de monitorizare a sănătăţii animalelor de laborator

- laborator de fertilizare in

- laborator de recoltare şi congelare ovocite, spermă şi embrioni de animale de laborator

Scurta descriere a infrastructurii

Întreg ansamblul animaleriei se bazează pe”bariera” sanitară ce protejează animalele SPF din interior.

Animalele SPF

Animalele de laborator SPF (specific pathogen free) reprezintă o categorie de animale libere de germeni patogeni.Aceste animale sunt menţinute în condiţii sterile în care tot ceea ce vine în contact cu ele este controlat şi sterilizat.

Calitatea lor este controlată trimestrial prin examene bacteriologice, serologice, parazitologice şi anatomopatologice efectuate la Institutul de Diagnostic şi Sănătate Animală din Bucuresti si Institutul AnLab din Praga, Cehia.

Controalele se fac în conformitate cu recomandările Federaţiei Europene pentru Ştiinţa Animalelor de Laborator.

Acest tip de animale reprezintă o categorie standardizată de animale de laborator apropiată de visul oricărui cercetător, respectiv “reactivul biologic”.

Echipamente

Echipamentele ce participă la menţinerea “barierei” sanitare sunt:

-Instalaţia de climatizare

Instalaţia de climatizare este instalaţia ce asigură menţinerea unui microclimat corespunzător şi uniform în interiorul Animaleriei. Ea este compusă dintr-un sistem de trei tipuri de filtre ( grosier, mediu şi HEPA) ce filtrează aerul la intrare şi un tip de filtre la evacuare.

Parametrii asiguraţi sunt : temperatura, umiditatea relativă şi suprapresiunea.

Instalaţia este controlată de computer, parametrii fiind înregistraţi şi arhivaţi.

-          Instalaţia de filtrare a apei

Este compusă de o baterie de filtre cu trei tipuri de filtre.

-          Sistemul de sterilizare.

Este alcătuit dintr-un autoclav Getinge cu dublă deschidere, sas cu lampă cu ultraviolete şi sas cu baie bactericidă.

-          Sistemul de iluminat

Controlat electronic asigură 12 ore lumină / 12 ore întuneric.

-          Echipamente specifice

Sunt reprezentate de cutiile de adăpost, biberoane de adăpare, refturi, instalaţii de umplere a biberoanelor, cărucioare de transport furaje,cutii etc.

Personalul

Personalul este constituit exclusiv din femei. O parte lucrează în interior ( majoritatea),restul în exterior. Cu excepţia tehnicienei toate celelalte sunt muncitoare necalificate (pentru că nu există încadrare pentru ceea ce fac ele), dar instruite, pricepute şi cu dragoste de animale. Majoritatea lucrează de la înfiinţarea Animaleriei.

La intrarea în Animalerie personalul se dezbracă complet, face duş ( inclusiv pe cap ), se îmbracă cu un echipament specific (asemănător cu al cosmonauţilor) şi pătrund în crescătorie unde rămân până termină toate activităţile specifice ( aproximativ 6-7 ore).

La ieşire circuitul este invers , doar nu mai fac duş. Echipamentul este spălat zilnic.

Personalul a completat o declaraţie pe proprie răspundere prin care nu au voie să crească acasă

animale indiferent rasa, iar dacă sunt bolnave ( indiferent boala ) nu pătrund în Animalerie.

LABORATORUL DE EXPERIMENTARE

Echipamente

Echipamentele din cadrul laboratorului de experimentare sunt următoarele:

-          rafturi şi cuşti pentru animale

-          pletismometru

-          balanţe analitice

-          balanţe electronice

-          sisteme de anesteziere

-          boxe cu aer cu flux laminar

Animalele utilizate provin din Animaleria SPF.

Personalul

Personalul laboratorului este format dintr-un medic veterinar, tehnician şi un îngrijitor. Personalul este calificat în ştiinţa animalelor de laborator, putând efectua toate tipurile de experimente pe animale de laborator.

Domeniile stiintifice deservite

Stiintele vietii

Serviciile oferite utilizatorilor infrastructurii de cercetare

Animale de laborator SPF:

- şoareci – 7 tulpini

• CD1   ->detalii
• NMRI  ->detalii
• BALB/c  ->detalii
• C57BL/6  ->detalii
• B6.129P2-Apoe^tm1Unc/J  ->detalii
• Hibrizi F1 ,CB6F1 IC  ->detalii
• CD1- Nuzi  ->detalii

- şobolani – 4 tulpini

• Wistar  ->detalii
• Brown Norway  ->detalii
• WAG/Rij  ->detalii
• CD-SD  ->detalii

Descrierea tulpinilor este in amănunt in paginile atasate

Laboratorul de experimentare este utilizat pentru efectuarea următoarelor tipuri de experimente si servicii auxiliare:

-          Teste antiinflamatorii

-          Teste de patologie experimentală

-          Teste de simulare a unor afecţiuni

-          Teste de supraveghere bacteriologică

-          Cazare si îngrijire pe timpul experimentării

-          Anestezie

-          Eutanasie

-          Recoltări probe

-          Administrări substante

-          Operatii chirurgicale

Institutii românesti utilizatoare:

Există instituţii care de la înfiinţarea Animaleriei SPF au generalizat utilizarea acestui tip de animale, altele trecînd la utilizarea lor pe parcurs :

- Institutul de Controlul medicamentului de uz veterinar

- Agenţia Naţională a Medicamentului

- Compania ROMVAC S.A.

- DSVSA Bucuresti

- Antibiotice Iaşi

- UMF Iaşi

- UMF Bucureşti

- ICCF București

Laboratorul de experimentare asigură efectuarea de experimente farmacologice preclinice, testări in vivo, proiecte de cercetare pentru institutele de cercetări din acest domeniu, precum şi pentru fabricile de medicamente de uz uman şi veterinar

Valoarea infrastructurii

2.000.000 $

Adresa infrastructurii:

Statiunea Băneasa, Soseaua Gheorghe Ionescu Sisesti, nr. 14 A, tel 0212694091, fax 0214906452

Foto 1. – Hrănirea şi adăparea şoarecilor si sobolanilor în animaleria SPF.

Foto 2. – Efectuarea schimbării cutiilor în animaleria SPF.

Director de proiect Dr. Anda Baicus

“Genotiparea tulpinilor de poliovirus izolate in Romania in perioada 2007-2010 de la cazurile cu paralizie acuta flasca (PAF)  si contactii sanatosi ai acestora ca obiectiv major al procesului de Eradicare a Poliomielitei”

SINTEZA LUCRARII FAZA 2009

Articole publicate de membrii echipei de cercetare pe durata derularii proiectului:

2009: A  Baicus, A Persu, M Popescu, A Penciu, S Stavri, A Soare,N Grecu, C Szmal, G Oprisan, Correlation between vaccine coverage against polio and circulation and genetic evolution of the poliovirus strains isolated in Romania in the framework of the global polio eradication strategy,Roum Arch Microbiol  Immunol., 2009, 4, 9-14.

2009: A Persu , A Baicus, S Stavri, M.Combiescu.  Non-polio enteroviruses associated with acute flaccid paralysis (AFP) and facial paralysis (FP) cases in Romania, 2001-2008, Roum Arch Microbiol Immunol., 2009, 68(1):20-6.

2007: A Baicus, A  Persu ,M  Combiescu ,  A Aubert-Combiescu.  The maintaining of the active laboratory-based surveillance of the acute flaccid paralysis (AFP) cases in Romania in the framework of the strategic plan of the global polio eradication initiative, Roum Arch Microbiol Immunol., 2007, 66(1-2):44-50.

Articol aflat in curs de redactare realizat in colaborare cu echipa din Institutul Pasteur Paris:

The frequency and biodiversity of polioviruses and enteroviruses nonpolio strains isolated from  healthy children living in a limited area in Romania

Situatia la nivel international

Poliomielita este o boala paralitica acuta avand ca etiologie poliovirusul. Poliovirusul, este un membru al genului Enterovirus aparţinând Familiei Picornaviridae. Particula virală are simetrie icosaedrică, este lipsită de anvelopă lipidică şi are un diametru de aproximativ 28nm, este stabilă la pH 3, rezistentă la eter, are o densitate de 1,34 g/cm³ în ClCs, un  coeficient de sedimentare de 160 S şi o greutate  moleculară de 8,5×10³ Kda. Capsida, alcătuită  din 60 de copii ale fiecăreia din cele 4 subunităţi proteice VP1, VP2, VP3 (proteine capsidale majore) şi VP4 (proteină capsidală minoră), înveleşte ARN genomic monocatenar, de polaritate pozitivă (aproximativ 7441 nt). Genomul viral este monocistronic, cu o regiune 5’ non-codantă (NC) (740 nt) ce conţine secvenţa semnal pentru iniţierea translaţiei şi care terminal este legată covalent de un oligopeptid VPg; urmează o lungă porţiune de lectură deschisă ce codifică o poliproteină de aproximativ 250 Kda şi o regiune 3’NC (70 nt), poliadenilată  terminal.  

Prevenirea poliomielitei, boală infecţioasă gravă prin mortalitatea indusă dar şi prin handicapurile motorii pe care le lasă în urma sa, se face cu ajutorul a două vaccinuri, ambele foarte eficace: vaccin polio inactivat (VPI) şi vaccin polio oral (VPO). Cele două  vaccinuri sunt de concepţie“ pasteuriană”: microorganism omorât (prin formol) (VPI), respectiv microorganism viu atenuat (VPO) [atenuare prin pasaje repetate în gazde diverse (animale sau culturi de celule) şi în condiţii particulare de creştere (temperaturi suboptimale)]. Punerea la punct a tehnicii culturilor de celule (Enders, Weller şi Robbins, 1949, Premiul Nobel), care a demonstrat că poliovirusul se poate multiplica şi în alte celule decât cele nervoase, a permis realizarea vaccinurilor antipolio. VPI a fost realizat de Dr. Jonas Salk în 1953 şi introdus pe scară largă în 1955 în ţările scandinave. În restul lumii cu excepţia Franţei şi Olandei, introducerea vaccinului nu a reuşit să elimine rapid poliomielita epidemică, ceea ce a contribuit rapid la succesul răsunător în  1959 al VPO (Sabin).

În mai 1988 a fost lansata de catre Adunare Mondială a Sănătăţii Initiativa de Eradicare Globala a Poliomielitei pana in anul 2000. Planul Strategic de Eradicare Globala a Poliomielitei  (PGEP) OMS cuprinde activitati prioritare pentru fiecare faza :

1. Certificarea eradicarii polio la nivel regional
2. Stoparea vaccinarii cu VPO ( vaccin polio oral)
3. Faza post vaccinare cu VPO

Obiectivele Iniţiativei de Eradicare a poliomielitei sunt: dispariţia cazurilor de poliomielită provocate de poliovirusul sălbatic, absenţa poliovirusurilor sălbatice în produse patologice şi în probele prelevate din mediul înconjurător.

La 20 de ani de la lansarea initiativei de Eradicare a Poliomielitei tarile in care au fost identificate tulpinile de poliovirus salbatic responsabile de aparitia endemiilor sunt: Afghanistan, India, Nigeria si Pakistan. Circulatia tulpinilor de poliovirus salbatic de tip 2 a fost ultima data identificata in octombrie 1999 totusi tulpini  circulante derivate din vaccin (VDPV) de tip 2 au fost identificate in Nigeria incepand cu anul 2006. Strategia OMS pentru anul 2007 a cuprins utilizarea in arii selectate cu risc endemic a vaccinului oral monovalent de tip 1 (mVPO 1) pentru eliminarea tipului 1 de poliovirus salbatic inaintea eliminarii tipului 3 de PV salbatic si utilizarea tintita a vaccinului monovalent tip 3 (mVPO3) .

Planul Strategic de Eradicare a Poliomielitei pentru perioada 2009-2013 cuprinde noi instrumente si tactici dezvoltate pentru intreruperea circulatiei tipului 1 si 3 de poliovirus salbatic in regiunile unde circulatia acestuia a fost identificata, pentru sustinerea unui nivel inalt al supravegherii epidemiologice si de laborator pentru cazurile de paralizie acuta flasca (PAF), pentru realizarea Certificarii si  pastrarii in siguranta a tulpinilor de poliovirus salbatic  precum si pentru eliminarea cazurilor de poliomielita paralitica asociata vaccinarii (VAPP) si a tulpinilor de poliovirus derivate din vaccin (VDPV)  urmate de pregatirea pentru faza post vaccinare cu vaccin polio oral (VPO). Vaccinarea de rutina ramane unul din obiectivele majore ale procesului de Eradicare; la nivel global acoperirea vaccinala cu 3 doze de vaccin polio oral trivalent (VPOT) a copiilor a fost estimata la 80% in anul 2006. La nivel regional estimarea OMS privind acoperirea vaccinala a fost de: 65% in Asia de Sud-Est, 75% Africa, 86% Mediterana de Est ,>93% in Pacificul de Vest, Europa si America, 77% in Afghanistan, 58% in India, 61% in Nigeria si 83% in Pakistan.

In iunie 2009 Comitetul de Avizare a Eradicarii Poliomielitei a recomandat introducerea in ariile cu risc a unui vaccin nou bivalent oral b OPV ( continand tipurile 1 si 3 de poliovirus) alaturi de  vaccinurile orale monovalent si trivalent. Riscul emergenţei şi circulaţiei tulpinilor VDPV rămâne o problemă pentru populaţia vaccinată de rutină cu VPO, chiar şi în acele părţi ale lumii în care circulaţia tulpinilor de poliovirus sălbatic a fost stopată; el este favorizat mai ales de existenţa unor grupuri mici populaţionale care trăiesc în condiţii socio-economice şi igienice precare şi la care acoperirea vaccinală nu este corespunzătoare, in grupuri care refuza vaccinarea din motive religioase.

Marea majoritate a tarilor au trecut la schema de vaccinare direct cu vaccin polio inactivat (VPI) sau au adoptat o schema tranzitorie de vaccinare VPI-VPOT (vaccin polio oral trivalent) urmată de vaccinarea numai cu VPI. VPI conferă protecţie individuală tuturor vaccinaţilor (min. 2 doze) iar administrarea ulterioară a una sau 2 doze VPOT completează imunitatea cu componenta ei locală intestinală, reducându-se foarte mult riscurile apariţiei cazurilor VAPP. Utilizarea numai a VPI exclude orice risc al aparitiei cazurilor VAPP sau tulpinilor VDPV. Din pacate mai exista probleme logistice, financiare si chiar stiintifice care au impiedicat introducerea vaccinarii cu VPI la nivel global.

Situatia la nivel national – Scurt istoric

România a introdus supravegherea poliomielitei paralitice la nivel naţional în 1949, dezvoltând şi menţinând un sistem de supraveghere cuprinzător din 1970 si a introdus supravegherea cazurilor de PAF în mai 1992, în conformitate cu recomandările OMS (Manual OMS, 1997, 2004). Supravegherea vizează investigarea tuturor cazurilor de paralizie acută flască (PAF) aparute la copii sub 15 ani, inclusiv cu sindromul Guillain –Barre. In cadrul acestei supravegheri pentru fiecare caz suspectat de PAF se investighează virologic şi 5 contacţi sănătoşi cu vârsta de până la 5 ani. Investigarea virologică se realizează în cadrul Centrului Naţional de Referinţă pentru Enterovirusuri (CNRE) din cadrul INCDMI „Cantacuzino” respectându-se protocolul standard recomandat de OMS. Deoarece se vizează şi studierea circulaţiei enterovirusurilor non polio alături de poliovirus pe teritoriul României, protocolul standard utilizat în cadrul Centrului National de Referinta pentru Enterovirusuri (CNRE) este mai extins decât minimul recomandat de OMS, gama produselor patologice investigate fiind mai diversă.

Aspectul evoluţiei poliomielitei în perioada 1927-1960 a fost sporadică şi  epidemică, morbiditatea înregistrată pentru această perioadă fiind de 5 cazuri /100 000 locuitori. În  anii 1927,1946, 1953-1959 evoluţia a avut caracter epidemic, în special în anul 1957, indicele de morbiditate fiind mai mare de 15 ⁰/₀₀₀₀.  Introducerea şi utilizarea amplă a VPI în 1957 şi a VPO în 1961 a fost urmată de eliminarea virtuală a poliomielitei. Incidenţa raportată a poliomielitei paralitice a scăzut de la aproximativ 10 cazuri la 100 000 locuitori în 1949 la 0,1 cazuri la 100 000 locuitori la mijlocul anului 1980  (Strebel PM, Aubert-Combiescu A, 1994). In Romania incepand cu anii 60 vaccinarea cu VPO s-a făcut iniţial sub formă de campanii naţionale: toţi copiii care împliniseră vârsta minimă de vaccinare până la data campaniei din anul (sezonul) respectiv primeau câte două doze de vaccin la două luni interval. Campania consta din două runde, fiecare având o durată de 7-10 zile maximum. Cea de-a treia doză prevăzută prin programul naţional de vaccinări se administra în prima rundă a campaniei următoare. Deoarece în anii 60 nu exista o reţea de frig care să permită păstrarea stocurilor de vaccin în stare congelată la – 20⁰ C, fie şi la nivelul centrelor regionale de sănătate publică, singura soluţie era vaccinarea tuturor copiilor într-un interval cât mai scurt de timp cu vaccin adus de la depozitul central din Institutul Cantacuzino în camioane frigorifice. La noi în ţară s-a organizat câte o singură campanie pe an în perioada 1961-1978 şi câte două campanii în perioada 1980-1993. În 1969-1970 s-a trecut şi la noi la prepararea de vaccin oral trivalent compensat (VPOT), care ţine cont de „infecţiozitatea” (capacitatea de implantare în intestin) inegală a celor 3 tulpini Sabin. O doză de VPO „compensat“ conţine 1 000 000 DCP/₅₀ de virus Sabin 1, 40 000-80 000  DCP/₅₀ de tip 2 şi 250 000-500 000 DCP/₅₀ de tip 3. La câţiva ani de la introducerea VPO pe scară largă s-au înregistrat scăderi spectaculare ale incidenţei cazurilor de poliomielită paralitică, de ordinul a 99%, dar au început să apară cazuri de poliomieltă paralitică  asociată vaccinării  (VAPP). Începând cu 1970 România a participat pentru o perioadă de 15 ani, împreună cu alte 11 state la un studiu colaborativ OMS privind riscul apariţiei cazurilor de VAPP . Între 1970-1978 au apărut cazuri de VAPP cu o medie anuală de 16,9 (7,1 la recipienţi-copii vaccinaţi  şi 9,8 la contacţi-copii nevaccinaţi care se infectau cu virusul excretat de vaccinaţi) (Combiescu AA, lucrare nepublicată). Pentru a demonstra că factorul de risc VAPP la noi nu este dependent de anume proprietăţi intrinseci ale vaccinului, autorităţile sanitare din România ( Laboratorul de Control al Serurilor şi Vaccinurilor, Ministerul Sănătăţii ) au hotărât în 1978, stoparea utilizării stocurilor de vaccin existente (preparate cu virusurile de sămânţă OMS primite în 1974) în vederea utilizării unui VPOT în care componentele să fie preparate cu un nou virus de sămânţă OMS –B ( Behring).

În 1983 a fost introdus sistemul de vaccinare în 2 campanii anuale (primăvară, toamnă) fiecare defăşurându-se în 2 runde, 25-29 martie, 25-29 mai, respectiv 25-29 septembrie, 25-29 noiembrie. Schema de vaccinare era concepută astfel încât fiecare copil să primească 4 doze VPO în primii 10 ani de viaţă. Copiii născuţi între timp, primeau o doză de VPOT, fiind reluaţi apoi cu primovaccinare completă în campania următoare. În Noiembrie 1990 VPO produs în Institutul Cantacuzino a fost înlocuit cu VPO produs în Europa Occidentală şi aprobat de OMS, datorită ratei crescute de VAPP apărute în România pe o perioadă mai mare de două decade. În România în perioada 1984-1992 riscul estimat al apariţiei VAPP a fost 1 caz la 183 000 doze VPO (de 14 ori mai mare decât riscul estimat în Statele Unite pe baza datelor de supraveghere  Explicaţia riscului crescut de apariţie a cazurilor VAPP în România s-a bazat pe rezultatele studiului organizat cu ajutorul OMS şi a Programului PolioPlus – Rotary Internaţional, care a demonstrat că vaccinul produs în România nu a avut o neurovirulenţă reziduală ridicată sau o stabilitate genetică scăzută.

Un studiu caz/control efectuat în cooperare cu CDC – Atlanta a arătat că rata crescută a cazurilor VAPP poate fi dată de excesiva utilizare a injecţiilor  intramusculare cu antibiotice în intervalul de 30 de zile de la primirea VPO, crescând  riscul apariţiei  paraliziei cu un factor de 2 până la 10 ori (paralizia provocată) (Strebel PM , Ion Nedelcu N, Baughman AL, 1995). Din Aprilie 1992 nici un caz produs de poliovirusul sălbatic nu a mai fost raportat, sugerând că transmisia poliovirusului sălbatic a fost întreruptă în România. Din Aprilie 1995 s-a practicat vaccinarea în sistem continuu cu VPOT la 2,4,6,12 luni si 9 ani. Incepand cu anul 2007 numarul cazurilor VAPP a fost 0.  Din septembrie 2008 a fost adoptata schema tranzitorie de vaccinare impotriva poliomielitei  VPI/VPO, pentru ca apoi cu incepere din 2009 sa se stabileasca utilizarea vaccinului VPI la 2, 4, 6, 13-15 luni si apoi la 9 ani

Supravegherea de laborator a cazurilor PAF

Supravegherea cazurilor de PAF este realizata prin diagnosticul de laborator virologic la nivelul CNRE acreditat OMS, din cadrul Centrului National de Expertiza in Microbiologie Medicala – INCDMI Cantacuzino si este coordonata epidemiologic  de expertii epidemiologi din cadrul Centrului Pentru Prevenirea si Controlul Bolilor Transmisibile ISP Bucuresti si de expertii din cadrul Ministerului Sanatatii Publice.

In cadrul procesului de supravegherea a cazurilor PAF in perioada 2007-2009 au fost investigate virologic probe de la 55 de cazuri PAF, 110 cazuri cu paralizie faciala si 674 contacti sanatosi. Au fost izolate 9 tulpini de poliovirus in majoritate de la copii sanatosi vaccinati recent care s-au dovedit a fi vaccinale in urma investigatiilor moleculare.

In iunie 2002 , la o luna de la Certificarea Europei „polio free” a fost semnala in urma izolarii, circulatia unei tulpini derivate din vaccin VDPV recombinant Sabin 1/Sabin2/Sabin 1 intr-o populatie minoritara (Babdag- Tulcea) la care acoperirea vaccinala impotriva poliomielitei era < 50%. Avand in vedere acest eveniment epidemiologic, impreuna cu cu colegii din cadru Retelei Internationale a Institutelor Pasteur am decis sa investigam in cadrul unui proiect International circulatia tulpinilor de poliovirus in populatia  minoritara  din zona Babadag la 6 ani de la evenimentul epidemiologic din 2002 pentru a vedea implicatiile eventualei aparitii a unor tulpini modificate intr-o tara membra a UE si in contextul procesului de Eradicare Globala a Poliomielitei.

In perioada 2008 -2009 in fost colectate si investigate virologic probe de la copii  sanatosi  din Babadag cu varste de pana la 15 ani. Rezultatele studiului sunt concretizate intr-unarticol ce este in curs de redactare.

OBIECTIVE REALIZATE PENTRU FAZA ANULUI 2009

1.1. EXPERTIZA VIROLOGICA

 

1.2. EXPERTIZA MOLECULARA

.

1.2.1. Tehnica PCR-RFLP

PCR este o metodă rapidă de amplificare enzimatică a unui fragment specific de ADN. Evaluarea variaţiei genetice a tulpinilor de poliovirus izolate a fost realizată prin analiza polimorfismului segmentelor de ADN provenite dintr-o regiune a genomului (RFLP), ce au urmat revers transcrierii. După amplificare şi digestie enzimatică, migrarea în gel de agaroză permite punerea în evidenţă a unei benzi  suplimentare sau a absenţei altei benzi prin comparaţie cu tulpina vaccinală. Profilurile de restricţie ale tulpinilor vaccinale Sabin sunt conservate de-a lungul pasajelor inter- şi intraumane. Produşii de digestie au fost vizualizati prin migrarea în gel de  agaroză 3% şi au fost evaluate in raport cu un marker de masă moleculară şi o probă  de ADN  nelizat alături de lizate ale tulpinilor de referinţă.

¨       Au fost examinate  regiunile  VP3-VP1, VP1-2A, 3D utilizand perechile de amorse UG24-UC1, UG19-UC13, UG17-UC10 (10)

Secventele nucleotidice ale primerilor

UG24: (1913)-GACACCATGATTCCCCTTAA-(1932)

UC1: (2881)-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-(2862)

UG19: (2870)-GACATGGAATTCACCTTTGTGG-(2891)

UC13: (3648)-TAGTACTTAGCTTCCATGTA-(3629)

UG17: (6536)-TCAGTGGCCATGAGAATGGC-(6555)

UC10: (7464)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-(7441)

Rezultatele testelor de digestie enzimatica  si analiza profilurilor de restrictie enzimatica pentru tulpinile izolate in anul 2008-2009

2008	RsaI	DdeI	HinfI	RsaI	DdeI	HinfI	RsaI	DdeI	HinfI
23/2/08 PV1	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
366/2/08 PV2	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like
453/1/08 PV1	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
454/1/08 PV2	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S1+S2-like	S1+S2-like	S1 like
567/1/08 PV3	S3-like	S3-like	S3-like	S3-like	S3-like	S1/S3-like	S2-like	S2-like	S2-like

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 Secventierea produsilor de amplificare

Purificarea produşilor de amplificare

Secvenţierea prin PCR, integrată în sistemul automat cu fluorocromi permite secvenţierea directă a produsului obţinut prin PCR, fără clonare prealabilă. Principiul reacţiei constă în migrarea în gel de poliacrilamidă a ADN marcat cu 4 fluorocromi diferiţi. Funcţie de mărime, fragmentele de ADN sunt separate, traversează regiunea de la baza gelului, care este  supusă unui fascicul de laser  care îl baleiază în mod continuu. Fluorocromii sunt excitaţi de laser, emiţând fiecare o lungime de undă detectată cu ajutorul unei camere video cuplată la un spectrograf (CDD). Intensitatea emisiilor este colectată sub forma unor semnale electrice. Un program informatic cuplat la secvenţiator, permite analiza automată şi transformarea datelor în secvenţe nucleotidice. Reacţiile au fost făcute pe un secvenţiator automat (ABI Prism–Applied Biosystems) ce utilizează markeri fluorescenţi şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă.Produşii PCR au fost secvenţiaţi folosind primerii utilizaţi în tehnica PCR. Înaintea secvenţierii, produşii PCR au fost purificaţi direct după amplificare folosind coloanele Qiagen (QIAquick Spin Handbook – QIAquick PCR purification Kit) sau prin izolarea din benzile obţinute după migrarea produşilor PCR în gel de agaroză (QIAquick Spin  Handbook – QIAquick Gel Extraction  Kit). Secvenţierea nucleotidică a fost efectuată la Institutul Cantacuzino,  Laboratorul de Microbiologie Moleculara, si a fost confirmata de Institutul Pasteur Paris , pe un secvenţiator automat ABI 3100 Avant  (Applied Biosystems) care utilizează markeri fluorescenţi multipli şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă. În reacţia de secvenţiere s-a utilizat kitul „ABI Prism BigDye terminator v.3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems) ce conţine dNTPs, ddNTPs marcate, tampon, polimerază. S-a avut în vedere secvenţierea fiecarei catene de ADN, prin utilizarea unui singur primer inclus in reactie, sens sau antisens. Cantitatea de matriţă ADN adăugată în reacţia de secvenţiere depinde de mărimea ampliconului şi de calitatea ampliconului (concentraţie şi puritate). Astfel, pentru ampliconi de 0.1-2kpb se aplică regula: pentru fiecare 100pb (perechi de baze azotate) ale ampliconului se adaugă 10 ng matriţă. Cantitatea de ADN din probe a fost apreciată prin comparare cu un marker cantitativ (MassRulerTM Express DNA Ladder Mix, Forward), apreciindu-se la aproximativ 20 ng/μL. ADN purificat a fost diluat (cu apă distilată) astfel încât cantitatea necesară să se regăsească într-un volum de 6 μL.

Concluzie :

Toate tulpinile de poliovirus  izolate pe teritoriul Romaniei in perioada 2008-2009 au prezentat in urma investigatiilor moleculare RT-PCR-RFLP in regiunile VP1-2A, VP3-VP1, secventiere in regiunea VP1-2A  profiluri Sabin-like (au fost tulpini vaccinale). Investigarea regiunii 3D atat prin RFLP cat si prin secventiere au evidentiat aparitia recombinantilor dar numai intre tulpini vaccinale fapt care nu a creat conditii pentru cresterea neurovirulentei acestor tulpini.  Au fost secventiate si tulpini de EVNP izolate in aceeasi perioada si s-a constat circulatia  tulpinilor de ECHO 7. Capacitatea de detectie, investigare rapida si  aducerea la zi a  diagnosticului ramane un standard impus de OMS, dar care trebuie asigurat de fiecare tara. In acest sens prin derularea acestui proiect a crescut capacitatea de raspuns rapid in  cazul unor  situatii epidemiologice speciale.

Pe durata derularii proiectului au fost implicati in activitatea de cercetare:  2 studenti  UMF Carol Davila :  A. Soare, N. Grecu, 1 asistent de cercetare, 1 student Facultatea de biologie

FAZA DE RAPORTARE  2008

Evenimente aparute in Romania in contextul supravegherii cazurilor PAF  

In Romania supravegherea cazurilor de PAF este realizata prin diagnosticul virologic la nivelul Laboratorului infectii enterice virale acreditat OMS, din cadrul Centrului National de Expertiza in Microbiologie Medicala – INCDMI Cantacuzino.

In anul 2007 au fost investigate produse patologice recoltate de la 25 cazuri PAF, 48 cazuri de paralizie faciala si de la 300 de contacti sanatosi cu varsta < 5ani. Au fost identificate 4 tulpini de poliovirus si 49 tulpini de EVNP. In perioada iunie –noiembrie  2007 in contextul unei epidemii de meningita acuta cu lichid clar  la nivelul a 36 de judete si Municipiul Bucuresti au fost investigate in cadrul laboratorului probe de materii fecale si /sau LCR recoltate  de la 1150 de cazuri cu meningita acuta virala cu lichid clar, confirmate ca  avand etiologie enterovirala ( ECHO 4; LCR +)  214 cazuri (11). In acel moment s-a reliefat foarte clar necesitatea introducerii unei tehnicii de diagnostic rapid. Tehnica de biologie moleculara (secventiere la nivelul genomului) a fost aplicata in cadrul Laboratorului de Microbiologie Moleculara pentru confirmarea rezultatului obtinut prin tehnica clasica de seroneutralizare cu seruri polivalente respectiv monovalente fata de enterovirusurile non polio. Confirmarile s-au realizat si pe parcursul anului 2008 incercandu-se in continuarea gasirea unei solutii de diagnostic cat mai rapid in situatii epidemice. In anul 2008 au fost izolate doar 2 tulpini de PV.S-a constatat o scadere a numarului tulpinilor de PV izolate pe teritoriul Romaniei in perioada 2007-2008.Au predominat serotipurile de PV1 ( 4 tulpini), tipurile 2 si 3 au fost izolate da la cate un copil. Profilurile dupa investigarea in regiunea VP1-2A au fost Sabin –like, in regiunea VP3-VP1 o tulpina a prezentat  mutatii eveniment confirmat si prin tehnica de secventiere. Pentru investigarea regiunii 3 D  tulpina 25/2/07 a prezentat profil Sabin 3/Sabin2; tulpina 52/1/07 a prezentat un profil S2/S1(tab.5).Prin tehnica de secventiere a tulpinilor de PV izolate in anul 2007 s-a constatat  ca inafara de secventa 1P – de tip Sabin 3 si care prezinta mai multe mutatii in regiunea capsidei virale, celelalte 3 secvente investigate sunt de tip Sabin 1, mai stabile genetic si cu omologie de 99% fata de tulpina vaccinala de referinta.Expertiza epidemiologica a reliefat pentru perioada 2007-2008 absenta cazurilor de poliomielita paralitica asociata vaccinarii (VAPP)

OBIECTIVE REALIZATE PENTRU FAZA ANULUI 2008

 

 

1. 1.EXPERTIZA VIROLOGICA

• Preparare si intretinere linii celulare L20B, RD (testarea puritatii, stabilitatii, autenticitatii)
• Stabilirea sensibilitatii liniilor celulare (L20B, RD) fata de tulpinile Sabin
• Multiplicarea tulpinilor de poliovirusuri de referinta cu titrarea tulpinilor Sabin

1.2. EXPERTIZA MOLECULARA

Genomul enterovirusurilor prezintă zone extrem de variabile, care alternează cu zone conservate. Acestea din urmă pot fi utilizate pentru construirea unor sonde nucleotidice sau a unor primeri utilizaţi pentru amplificarea prin PCR. Aceste zone conservate se constituie deci în adevăraţi markeri moleculari, utilizabili în diagnosticul enterovirusurilor prin metodele moderne cum sunt hibridizare moleculară, PCR sau secvenţiere, care au cunoscut o dezvoltare continuă în ultimile decenii. Aplicaţiile tehnicii PCR se pot încadra în două grupe: cele în care se utilizează PCR preparativ pentru sinteza ADN (RT-PCR, secvenţiere, clonare, sinteza şi marcarea sondelor) şi cele analitice cum sunt: diagnosticul factorilor infectioşi, al bolilor genetice, epidemiologia moleculară, tehnici moleculare din medicina legală etc., care fac apel la anumiţi markeri moleculari, în funcţie de scopul propus.

Tipizarea virusurilor este necesară atât pentru investigaţii epidemiologice, pentru identificarea tipurilor de virusuri cu virulenţă crescută sau cu anumite caracteristici patogene şi stabilirea corelaţiilor cu imunitatea virală dar şi în analiza taxonomică, pentru obţinerea informaţiilor privind relaţiile filogenetice dintre virusuri. Noile tehnici moleculare şi în special PCR au permis dezvoltarea unor metode de tipare moleculară, complementare metodelor tradiţionale de tipare pe bază fenotipică.

În ciuda numărului mare de serotipuri enterovirale şi a gradului ridicat de variabilitate antigenică, serotipurile sunt stabile, reflectând probabil conservarea epitopilor importanţi pentru structura şi funcţia capsidei. În consecinţă, se pot identifica determinanţi genetici pentru fiecare serotip. Serotipurile sunt definite prin epitopii de neutralizare localizaţi în proteinele capsidei virale, în special pe VP1 dar şi pe VP2 şi VP3. Unii determinanţi de neutralizare ai PV sunt dependenţi de conformaţia proteinelor capsidei, care ajung în vecinătate prin pliere către suprafaţa virusului. Datorită acestei conformaţii de tip contiguu a determinanţilor de neutralizare s-a considerat, până nu demult, dificilă identificarea serotipului viral numai pe baza secvenţei de acizi nucleici. Recent, diferiţi autori au pus la punct sisteme de “serotipare” moleculară prin PCR şi secvenţiere, pe baza unor markeri moleculari situaţi în proteina capsidei virale VP1 (Oberste et al., 1999c; Caro et al., 2001).

Poliovirusurile prezintă o variabilitate legată de incapacitatea polimerazei virale de corectare a incorporării greşite a nucleotidelor, ceea ce determină apariţia de mutaţii punctiforme, cu o frecvenţă medie de 10^-4. Practic fiecare doză de VPO cu cele 3 serotipuri de poliovirus atenuat, conţine un procent de genoame mutante “contaminante”, critice pentru stabilitatea atenuării. Tipul 3 de poliovirus atenuat pare a fi cel mai putin stabil. O explicaţie ar fi că, pentru obţinerea tulpinii atenuate, este nevoie de un număr mic de substituţii de nucleotide, astfel că este favorizată selectarea cu uşurinţă a revertanţilor neurovirulenţi. Astfel, din 10 nucleotide care diferenţiază tulpina Sabin 3 de tulpina sălbatică neurovirulentă, numai două par să contribuie la atenuare: poziţia U₄₅₂ din 5′NCR şi U₂₀₃₄ din VP3. Reversia U₄₅₂ >C este însoţită de o creştere a neurovirulenţei şi conferă aparent un avantaj selectiv. Tulpina Sabin 2 a fost derivată dintr-o tulpină sălbatică cu neurovirulenţă scăzută. Până în prezent, numai două poziţii nucleotidice au fost considerate importante pentru fenotipul atenuat. Acestea sunt localizate în 5′NCR (A₄₈₁) şi în regiunea capsidei din VP3 (U₂₉₀₈). Tulpina Sabin 1 este considerată cea mai stabilă din VPO. Foarte puţine cazuri au fost semnalate cu aceasta tulpină (Minor, 1992). Toate aceste poziţii nucleotidice, care suferă mutaţii în cele 3 tulpini vaccinale Sabin, se constituie în tot atîţia markeri moleculari, pentru identificarea revertanţilor la neurovirulenţă prin RT-PCR, RFLP si secventiere. Mutaţiile care intervin în atenuare sunt de fapt mult mai numeroase şi sunt răspîndite pe întregul genom. Aceasta este, deci, o metodă pentru determinarea rolului tulpinilor Sabin în patogeneza cazurilor de paralizie persistentă asociată vaccinării (PPAV), prin evaluarea stabilităţii nucleotidelor critice pentru fenotipul atenuat la virusurile izolate de la pacienţi.

1.2.1. Tehnica PCR-RFLP

¨       Au fost examinate  regiunile  VP3-VP1, VP1-2A, 3D utilizand perechile de amorse UG24-UC1, UG19-UC13, UG17-UC10 (10)

Rezultatele testelor de digestie enzimatica  si analiza profilurilor de restrictie enzimatica pentru tulpinile izolate in anul 2007 -2008

Tulpini PV	RFLP VP1-2A			RFLP 3D			RFLP        VP3-VP1
	RsaI	DdeI	HinfI	RsaI	DdeI	HinfI	RsaI	DdeI	HinfI
25/2/07PV3	S3-like	S3-like	S3-like	S2-like	S2-like	S2-like	S3like +banda suplimentara	S3like	S3like
52/1/07PV2	S2-like	S2-like	S2-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
1552/3/07PV1	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
1572/2/07PV1	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
23/2/08 PV1	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like	S1-like
366/2/08 PV2	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like	S2-like

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2.2 Secventierea produsilor de amplificare  

1.2.2.1.Purificarea produşilor de amplificare

Probe analizate : 25/2/07 PV3; 52/1/07 PV1, 1552/3/07PV1, !572/2/07PV1

Produşii PCR au fost purificaţi în vederea secvenţierii cu kit Qiagen. Acest protocol permite purificarea ADN dublu şi monocatenar, cu dimensiuni cuprinse între 100 pb şi 10 kb. Produşii PCR au fost transferaţi pe coloane, după adăugarea a 5 volume de tampon PB la 1 volum de produs PCR şi centrifugaţi la o viteză de     13 000 rpm (1 min) pentru fixarea acizilor nucleici pe membrana din coloane. Coloanele au fost apoi spălate cu 750 ml de tampon PE (la care se adaugă etanol 100%  la prima deschidere a flaconului) şi centrifugate ca mai sus. Eluatul a fost eliminat într-un tub colector de 2 ml. S-a procedat la o centrifugare suplimentară de 1 min la aceeaşi viteză, pentru a se elimina etanolul rezidual din tamponul PE. În final, ADN a fost eluat într-un tub Eppendorf de 1,5 ml cu 50 ml de tampon EB (Tris HCl 10 mM pH 8,5) plasat pe centrul coloanei, prin centrifugare timp de 1 min la 13 000 rpm. ADN obţinut a fost stocat la -20°C până la utilizarea sa pentru secvenţiere.

Pentru obţinerea unor electroforegrame de calitate prin secvenţiere, a fost necesară purificarea produşilor PCR care prezentau benzi suplimentare, nespecifice. Produşii PCR au fost purificaţi prin tehnica de migrare în gel de agaroză si excizarea benzilor de interes.

1.2.2.2.Determinarea secvenţei acizilor nucleici

 Metoda de secvenţiere folosită în prezent este cea enzimatică, dezvoltată de Sanger. Această metodă se bazează pe utilizarea unor nucleotide modificate, 2′,3′didezoxiribonucleotid trifosfaţi (ddNTP), care joacă rolul de terminatori de lanţ în timpul reacţiei de polimerizare enzimatică a ADN. Datorită acţiunii ADN polimerazelor, ddNTP-urile sunt încorporate în catena în curs de elongare a ADN aşa cum sunt utilizate dNTP-urile normale. Diferenţa constă în faptul că un ddNTP încorporat declanşează, la un moment dat, blocarea elongării.

Secvenţierea nucleotidică a fost efectuată la Institutul Cantacuzino, Laboratorul de Microbiologie Moleculara, pe un secvenţiator automat ABI 3100 Avant  (Applied Biosystems) care utilizează markeri fluorescenţi multipli şi permite analiza într-un gel de rezoluţie foarte înaltă. În reacţia de secvenţiere s-a utilizat kitul „ABI Prism BigDye terminator v.3.1 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems) ce conţine dNTPs, ddNTPs marcate, tampon, polimerază. S-a avut în vedere secvenţierea fiecarei catene de ADN, prin utilizarea unui singur primer inclus in reactie, sens sau antisens.

Cantitatea de matriţă ADN adăugată în reacţia de secvenţiere depinde de mărimea ampliconului şi de calitatea ampliconului (concentraţie şi puritate). Astfel, pentru ampliconi de 0.1-2kpb se aplică regula: pentru fiecare 100pb (perechi de baze azotate) ale ampliconului se adaugă 10 ng matriţă. Cantitatea de ADN din probe a fost apreciată prin comparare cu un marker cantitativ (MassRulerTM Express DNA Ladder Mix, Forward), apreciindu-se la aproximativ 20 ng/μL. ADN purificat a fost diluat (cu apă distilată) astfel încât cantitatea necesară să se regăsească într-un volum de 6 μL.

Migrarea probelor prin capilare se realizează cu ajutorul injecţiei electrocinetice pe care aparatul o aplică automat, sub acţiunea unei tensiuni electrice şi un anumit timp, aceşti parametrii  fiind deja setaţi. Timpul de injecţie defineşte timpul cât stă proba in capilar şi cantitatea care este injectată în capilar. Laserul excită fluorocromii, care emit fiecare o lungime de undă diferită, detectată de o cameră video cuplată cu un spectrograf (CDD). Prin intermediul unor filtre, datele privind intensitatea emisiilor sunt colectate şi conservate sub forma unor semnale electrice. Un program informatic, cuplat la secvenţiator, permite analiza automatizată şi convertirea directă a datelor în secvenţe nucleotidice.

1.2.2.3.Analiza computerizata a secventelor

Secvenţa de ADN, identificată prin diferite tehnici de secvenţiere (radioactive sau neradioactive, automate), este analizată din punctul de vedere al compoziţiei în nucleotide, a zonelor repetitive, pentru determinarea unor motive specifice sau regiuni de control şi, în cazul secvenţelor monocatenare, a unor structuri secundare potenţiale. Dacă secvenţa conţine un cadru deschis de citire (“ORF, open reading frame”), secvenţa dedusă de aminoacizi poate fi analizată pentru utilizarea codonilor (“codon usage”), structuri secundare posibile etc. In acelaşi timp, secvenţele obţinute sunt comparate cu cele deja existente în băncile de date. Pentru stabilirea relaţiei filogenetice cu alte secvenţe se realizează alinieri cu cele cunoscute, rezultatul fiind exprimat grafic sub forma unor arbori.

Pentru acest studiu am utilizat programele BioEdit, Clustal W, Blast si Mega 4. Arborii filogenetici au fost construiti cu programul TreeView.

Rezultate poliovirusuri: caracterizarea moleculară a unor tulpini de poliovirusuri în vederea detectării unor variante virale mutante sau a virusurilor recombinante intra- sau interspecifice.

Ampliconii VP1-2A de poliovirusuri vaccinale au fost secvenţiaţi in ambele sensuri cu primerii sens UG19 si primerii antisens UC13. Cu ajutorul programului BioEdit secventele sens si antisens au fost aliniate si, pe baza acestui aliniament, a fost creata o secventa consens.

Tulpina 25/2/07 PV

Secventa 1P consens de 744 pb este de tip Sabin 3. Comparata cu tulpina de referinta Sabin 3 secventa consens se gaseste intre pozitiile nucleotidice 2860 si 3603.

In secventa de referinta Sabin 3 proteina de capsida VP1 este codificata de pozitiile nucleotidice 2477 si 3376 iar proteina nestructurala 2A este codificata de pozitiile nucleotidice 3377 – 3823.

Prin alinierea secventei  1P consens cu secventa de referinta Sabin 3 au fost identificate citeva pozitii in care apar mutatii punctiforme:  in regiunea genomica VP1: 2878 C>T; 2971 si 2973 A>G; 3269 G>A. In regiunea genomica 2A (mai consevata decit regiunea codificatoare a capsidei) a fost semnalata o singura mutatie: 3496 G>A. Aceste mutatii nu apar in pozitiile cheie de reversie la virulenta pentru tulpinile de poliovirus vaccinale de tip 3. Pe de alta parte aceste mutatii nu se traduc in modificarea structurii proteinei deoarece sunt de tip tranzitie (intre acelasi tip de baze: purinice – G sau A sau pirimidinice – C sau T) (Fig. 1). Mutatiile de tip transversie apar numai cind se modifica o baza purinica intr-una pirimidinica si invers.

Tulpina 52/1/07 PV1. Secventa 2 P consens, obtinuta din alinierea secventelor 2P sens si antisens, asa cum a fost prezentat mai sus, este de tip Sabin 1 si este asemanatoare cu aceasta in proportie de 99%. Singura mutatie a probei 2  fata de secventa Sabin 1 vaccinala este in pozitia 3589 din proteina 2A si este tot de tip tranzitie (G>A)

Tulpina 1552/3/07PV1

Secventa 3 P consens prezinta un scor de 99% cu Sabin 1 vaccinal (intre pozitiile nucleotidice 2915 si 3636 ale secventei acestuia). Singura diferenta apara ca amestec de cvasispecii in pozitia 3106 (pozitie degenerata Y, amestec de nucleotide C cu T) din secventa nucleotidica care codifica proteina de capsida VP1.

Tulpina 1572/2/07PV1

Secventa 4 P consens este tot de tip Sabin 1, cu o omologie de 99% datorata unei pozitii degenerate (M = amestec de nucleotide A cu C) la 3125 si unei mutatii de tip tranzitie in pozitia nucleotidica 3535 A>G. Secventa investigata se gaseste intre pozitiile nulceotidice 2920 si 3647 din Secventa Sabin 1.

In concluzie, in afara de secventa 1P – de tip Sabin 3 si care prezinta mai multe mutatii in regiunea capsidei virale, celelalte 3 secvente investigate sunt de tip Sabin 1, mai stabile genetic si cu omologie de 99% fata de tulpina vaccinala de referinta.

Tehnica de secventiere a tulpinilor de poliovirus in regiunea VP1-2A a fost optimizata si a permis evaluarea cu acuratete a mutatiilor prezente in tulpinile de poliovirus analizate.

Bibliografie

1. 1. Balanant J, Guillot S, Candrea A, Delpeyroux F,  Crainic R. The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment lengtb polymorphism assay. Virology 1991; 184:645-654.
2. Baicus A, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA. Immune status to polioviruses in the children population of Romania between 2002-2005 as indicated by serological investigation in cases of acute flaccid paralysis (AFP) and facial paralysis (FP) and its use as a “national reference value” to evaluate the vaccination coverage in particular groups of  healthy children. Rev med Chir Soc Med Nat  Iaşi 2006, 110: 1004-11.
3. Baicus A, Combiescu M, Persu A, Oprişan G, Aubert-Combiescu A, Delpeyroux F. The molecular characterization of poliovirus strains by the RT-PCR-RFLP assay and its use in the active surveillance for acute flaccid paralysis cases in Romania between 2001-2006.Roum Arch Microbiol Immunol. 2006 Jul-Dec;65(3-4):120-30.
4. Baicus A, Persu A., Popa MI, Baicus C. Immunity status against Coxsackieviruses B in 25 patients with acute myocarditis. Rom Arch Microbiol Immunol 2006; în vol. Nr. 3-4, 2006.
5. Baicus A, Persu A, Combiescu M  , Aubert-Combiescu A.  .The maintaining of the active laboratory-based surveillance of the acute flaccid paralysis (AFP) cases in Romania in the framework of the strategic plan of the global polio eradication initiative. Rom Arch Microbiol Immunol. 2007 Jan-Jun;66(1-2):44-50
6. Centers for Disease Control and Prevention. Certification of Poliomyelitis Eradication-European Region. Morbidity and Mortality weekly Report. 2002; 51: 572-4.
7. Combiescu M, Guillot S, Persu A, Baicuş A, Pitigoi D, Balanant J, Oprisan G, Crainic R, Delpeyroux F, Combiescu AA. Circulation of a type 1 recombinant vaccine-derived poliovirus strain in a limited area in Romania Arch Virol. 2007;152(4):727-38. Epub 2007
8. Georgescu MM, Balanant J, Macadam A, Otelea D, Combiescu M, Combiescu AA, Crainic R, Delpeyroux F. Evolution of the Sabin type 1 poliovirus in humans: characterization of strains isolated from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J. Virol. 1997; 71: 7758-776848.
9. Global Polio Eradication Initiative Strategic Plan 2004-2008.WHO 2003.
10. Global Polio Eradication Initiative., Monthly Situation Report (online), Geneva: WHO, 2009.
11. Guillot S, Caro V, Cuervo N, Korotkova E, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Delpeyroux F, Crainic R. Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol 2000; 74: 8434-8443.
12. Guillot S, Otelea D, Delpeyroux F, Crainic R.Point mutation involved in the attenuation /neurovirulence alternation in type 1 and 2 oral polio vaccine strains detected by site- specific polymerase chain reaction. Vaccine 1994; 12: 503-507.
13. Nedelcu NI, Strebel PM, Toma F, Moroeanu SB, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Plotkin SA, Sutter RW. Sequential and Combined use of inactivated and oral poliovirus vaccines: Dolj district, Romania, 1992-1994. J of Infectious Diseases. 1997;175(Suppl 1): S241-6.
14. Otelea D, Guillot S, Furione M, Combiescu AA, Balanant J, Candrea A, Crainic R. Genomic modifications in naturally occuring neurovirulent revertants of Sabin 1 polioviruses. Dev Biol  Stand 1993; 78: 33-38.
15. Strebel PM Combiescu AA., Nedelcu  IN, et al. Paralytic poliomyelitis in Romania , 1984-1992: evidence for a high risk of vaccine-associated disease and reintroduction of wild –virus infection. Am J Epidemiol. 1994; 140: 1111-24.
16. Strebel PM, Nedelcu IN, Baughman AL, Sutter RW, Cochi SL. Intramuscular injections within 30 days of immunization with oral poliovirus vaccine—a risk factor for vaccine-associated paralytic poliomyelitis. N Engl J Med. 1995; 332: 500–06.
17. WHO Expanded Programme on Immunization. Global eradication of poliomyelitis by the year 2000. Weekly Epidemiological Record 1988; 63: 161-162.
18. WHO. Progress towards the global eradication of poliomyelilis, 2002. Wkly. Epidemiol. Rec 2003; 78: 138-144.
19. Wright PF , Kim –Farley  RJ, De Quadros CA, Robertson SE, Scott RM , Ward NA, Henderson RH. Strategies for the global eradication of poliomyelitis by the year 2000. N. Engl. J. Med. 1991; 325: 1774-1779.
20. WHO, Polio laboratory manual WHO/IVB/04.10, WHO, Geneva, Switzerland, 1997/2004.
21. Centers for Disease Control and Prevention, Progress toward interruption of wild Poliovirus transmission-worldwide, 2008, MMWR, 58, 308, 2009.
22. WHO, Global polio eradication initiative strategic plan 2009-2013, Euro Immunization Monitor, 4, 2009.
23. Centers for Disease Control and Prevention, Poliovirus infections in four unvaccinated children, Minnesota, MMWR, 54, 1, 2005.
24. WHO, Summary of discussions and recommendations of the 13th informal consultation of the WHO Global Polio Laboratory Network, Weekly Epidemiol. Rec., 82, 297, 2007.

 

Titlul proiectului: Markeri moleculari utili in diagnosticul si epidemiologia  toxiinfectiilor alimentare produse de bacilli gram negativi

Acronim: TIAGEN

Rezumat

In ciuda progreselor evidente inregistrate in ultimul timp atat in domeniul medical cat si in cel al tehnologiilor alimentare, toxiinfectiile alimentare (TIA), definite ca boli consecutive consumului de alimente sau apa contaminata, continua sa reprezinte o problema de sanatate publica majora. Se cunosc mai mult de 250 tipuri de toxiinfectii alimentare, multe dintre acestea fiind determinate de toxine sau diferite substante chimice periculoase care contamineaza alimentele. Microorganismele sau toxinele elaborate de acestea reprezinta o amenintare pentru sanatatea publica datorita ratei inalte de multiplicare a acestora si cailor multiple de raspandire.

Daca pentru toxiinfectiile produse de agenti bacterieni cu patogenitate recunoscuta (Salmonella, Shigella, etc) metodologiile de diagnostic sunt clare si dau rezultate specifice, selective si reproductibile, nu acelasi lucru se poate spune despre diagnosticul toxiinfectiilor alimentare determinate de agenti bacterieni pana nu demult nerepertoriati ca patogeni (patotipuri enterice de E. coli si in special patotipul emergent VTEC) sau bacterii greu/dificil cultivabile (Campylobacter, forme viabile dar noncultivabile a patogenilor recunoscuti-VBNC).

Proiectul isi propune o evaluare a metodelor clasice utilizate in laboratorul de microbiologie si fundamentarea necesitatii introducerii metodelor moleculare pentru diagnosticul de laborator si epidemiologia toxiinfectiilor alimentare produse de bacili gram negativi. Rezultatele obtinute vor fi analizate in consortiu alcatuit din cercetatori din domeniul academic, cercetare fundamentala si aplicativa, medici specialisti in boli infectioase si epidemiologi, in vederea elaborarii unui ghid national privind diagnosticul si epidemiologia acestor imbolnaviri.

Probele patologice/tulpinile izolate si caracterizate prin metode clasice in laboratorul clinic al partenerului 2 vor fi expediate coordonatorului pentru analiza moleculara. Se va utiliza tehnica PCR pentru detectarea unor structuri genetice specie specifice, precum si gene responsabile pentru sinteza factorilor de virulenta bacteriana. Metodele moleculare, optimizate pe tulpini izolate si caracterizate, vor fi utilizate pentru diagnostic direct in produsul patologic. Va creste in felul acesta operativitatea in focar ca urmare a rapiditatii raspunsului, dar mai ales va creste specificitatea in cazul infectiilor datorate agentilor bacterieni conditionat patogeni, greu cultivabili sau noncultivabili.

Activitatea multidisciplinara, integrata si colaborativa a colectivului de cercetatori si specialisti din domeniul bolilor infectioase, dezvoltarea unui sistem bazat pe activitate de laborator microbiologic si introducerea metodelor genetice de diagnostic si analiza epidemiologica vor conduce la dezvoltarea unui algoritm de prevenire si control al toxiinfectiilor alimentare cu bacili gram negativi. Activitatea se inscrie in strategia de lucru a Centrului European de Prevenire si Control al Bolilor Transmisibile (ECDC) privind sporirea rolului laboratorului in controlul bolilor infectioase si introducerea metodelor de microbiologie moleculara in diagnosticul si epidemiologia acestora. Implementarea rezultatelor stiintifice ale studiului de fata in practica medicala va contribui la cresterea competitivitatii in cadrul largit al ECDC in care Romania este parte integrata.

Obiectivele generale si rezultate estimate

Obiectivul general al proiectului consta in optimizarea metodelor de diagnostic microbiologic al toxiinfectiilor alimentare in vederea participarii eficiente a laboratorului la activitatea de supraveghere si control a acestui tip de imbolnaviri.

Obiectivele specifice ale proiectului constau in:

1. Realizarea masei critice de cercetatori implicati in studiul unor boli transmisibile prioritare pentru Romania si Europa in contextul globalizarii circulatiei si comertului cu produse alimentare
2. Optimizarea supravegherii cu laboratorul a toxiinfectiilor alimentare in vederea operativitatii raspunsului in focar
3. Cresterea calitatii actului medical prin reducerea numarului de raportari de „boala diareica cu agent etiologic necunoscut”
4. Armonizarea metodelor de lucru cu cele la nivel european in conformitate cu recomandarile ECDC
5. Cresterea competitivitatii in cadrul grupului de lucru „wood and water diseases (FWD)organizat la nivelul ECDC

Institutia coordonatoare

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino”

Director de proiect: Maria Damian, CS I, mdamian@cantacuzino.ro

Splaiul Independentei 103, Sector 5 Bucuresti

Tel: +4021.5287276

Fax: +4021. 5287305

www.cantacuzino.ro

e-mail: office@cantacuzino.ro

Componenta consortiului

Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” Bucuresti

Responsabil stiintific: Prof. Dr. Marian Negut, mnegut@cantacuzino.ro

www.univermed-cdgm.ro

Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale “Dr. Victor Babes”, Bucuresti

Responsabil stiintific: Dr. Maria Nica, nicamaria_lab@yahoo.com

www.spitalulbabes.ro

Autoritatea contractanta

Centrul National de Management Programe

www.cnmp.ro

Durata proiectului: 2007-2011

Responsabilitatile aferente fiecarui participant (vezi „Planul de realizare al proiectului”)

Bugetul proiectului: 1900000 lei (vezi „Informatii financiare despre proiect”)

Publicatii (vezi lista de publicatii)

Manifestari stiintifice (vezi lista manifestarilor stiintifice)

Reuniuni ale partenerilor

1. 10.12.2008: Reuniune pentru lansarea proiectului

Participanti: Responsabilii stiintifici impreuna cu echipa de lucru a fiecarui partener implicat in proiect

Subiecte dezbatute:

1. prezentarea participantilor
2. discutarea planului de realizare al proiectului
3. prezentarea, de catre responsabilii stiintifici ai partenerilor, a activitatilor care urmeaza a fi derulate in etapa 1
4. discutarea modalitatilor operationale pentru realizarea activitatilor propuse
5. termene de realizare
6. discutarea bugetului alocat pe parteneri si categorii de cheltuieli

Lista de publicatii / comunicari stiintifice

1. Buiuc D, Neguţ M – Tratat de microbiologie clinică, ed.a 3-a, Ed. Medicală, 2009.
2. Maria Damian, Dorina Tatu-Chiþoiu, Codruta-Romanita Usein, Gabriela Oprisan,

Andi-Marian Palade, Sorin Dinu, Camelia Szmal, Simona Adriana Ciontea, Stefania Ceciu, Maria Condei, Ana Persu, Anda Bãicus, Mariana Pop, Ionela Neagoe, Dan Steriu, Radu Codreanu, Marian Graur, Michaela Carmen Cretu, Suzana Cilievici, Maria Nica, Alexandru Ecovoiu and Lucian Gavrilã. Laboratory diagnosis of infectious diarrhoea syndrome; a three years study in two hospitals of infectious diseases. Rom Arch. Microbiol Immunol, 2:89-94, 2009.

3. Maria Damian. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a bolilor infectioase. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009;

152.

4.  Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian Negut. Metode moleculare utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a patogenilor enterici. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, ed III, 2009.

5. Maria Damian, Andi Palade, Madalina Baltoiu, Codruta-Romanita Usein, Simona Ciontea, Stefania Ceciu, Lavinia Zota si Dorina Tatu-Chitoiu. “Laboratory investigation of Salmonella strains isolated from foodborne outbreaks occured during the last six months in Romania”. Workshop “Intersectoral collaboration for detection, surveillance and response to foodborne diseases” , Polonia, Zegze, 25-28 Mai 2009.

Documente:

• Anexa I-Informatii financiare despre proiect-act aditional 4
• Plan de realizare-act aditional 4

Proiect IDEI cod CNCSIS 721/ Contract nr. 1232/2009

TITLUL PROIECTULUI
Portajul vaginal al unor microorganisme potential patogene: colonizare tranzitorie sau prim pas in declansarea unei infectii

ECHIPA DE CERCETATORI
Usein Codruţa-Romaniţa – director de proiect medic primar, doctor in Medicina/specialitatea Microbiologie, Laboratorul Microbiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Strãuţ Monica chimist, CS I, doctor in Chimie/specialitatea Biochimie Laboratorul de Microbiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Georgescu Raluca Margareta medic primar Laboratorul de Analize Medicale, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Grigore Laura Andrea medic primar Laboratorul de Analize Medicale, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Creţoiu Mariana-Silvia (prezenta in etapa intermediara a anului 2009) biolog, cercetator stiintific Laboratorul Microbiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Baltoiu Madalina (o inlocuieste pe Cretoiu Mariana-Silvia incepand cu etapa finala a anului 2009) biolog, masterand al Facultatii de biologie Bucuresti (Catedra Genetica si Microbiologie)
Laboratorul Microbiologie Moleculara, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”
Petrini Anca Maria medic rezident specialitatea Medicina de laborator, asistent de cercetare, Laboratorul de infectii respiratorii bacteriene, I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino”

OBIECTIVUL PROIECTULUI
Studiul de fata are ca obiectiv general imbogatirea cunostintelor legate de izolatele clinice romanesti apartinand unor specii (Escherichia coli si Streptococcus agalactiae) care expun la un inalt risc infectios atat gazda cat si descendentii ei. Aceasta se realizeaza prin doua directii de cercetare: 1/ caracterizarea determinantilor genetici asociati potentialului de patogenitate bacteriana si 2/ imbunatatirea calitatii diagnosticului microbiologic local, prin introducerea metodelor moleculare de evidentiere a genotipului de virulenta.

PLANUL DE REALIZARE A PROIECTULUI
2009/etapa intermediara
Termen de raportare: 15 septembrie;
Buget alocat: 38557,06 lei

Obiective specifice:
●Elaborarea unui model de studiu microbiologic pentru evaluarea portajului vaginal de E. coli si S. agalactiae si a riscurilor pe care le implica
●Realizarea colectiei de studiu reprezentata de izolate de E. coli si S. agalactiae
● Caracterizarea fenotipica a colectiei bacteriene
2009/ etapa finala
Termen de raportare: 11 decembrie
Buget alocat: 33659,45 lei

Obiective specifice:
● Evidentierea particularitatilor autohtone ale portajului vaginal de E. coli si S. agalactiae
2010/ etapa unica

Termen de raportare: 29 octombrie
Buget alocat: 602783,49 lei

Obiective specifice:
●Realizarea colectiei de studiu reprezentata de izolate de E. coli si S. agalactiae
● Caracterizarea fenotipica a colectiei bacteriene
● Elaborarea protocolului de serotipare moleculara a izolatelor de S. agalactiae
● Evaluarea originii filogenetice a izolatelor vaginale de E. coli
● Evaluarea relatiei dintre fondul filogenetic si genotipul de virulenta al izolatelor clinice de E. coli
● Determinarea prevalentei portajului vaginal de tulpini ExPEC in populatia adulta autohtona
2011/ etapa unica
Termen de raportare: 31 octombrie
Buget alocat: 325000 lei

Obiective specifice:
● Evaluarea gradului de inrudire genetica a izolatelor colectiei de E. coli
● Subtipizarea prin PFGE a izolatelor colectiei de S. agalactiae
● Determinarea bazei moleculare a rezistentei la antibiotice la tulpini din colectia de S. agalactiae
● Evaluarea relevantei clinico-epidemiologice a rezultatelor obtinute in cadrul acestui studiu microbiologic privitor la portajul vaginal de E. coli si S. agalactiae

REZULTATE
2009
- Demararea constituirii colectiei bacteriene, pornind de la prelevate de secretie vaginala, recoltate de la femei gravide si negravide, care s-au adresat pentru investigatii microbiologice Laboratorului de analize medicale din cadrul I.N.C.D.M.I. “Cantacuzino” (perioada mai – decembrie 2009);
- Izolarea si identificarea tulpinilor de S. agalactiae si E. coli din cultura prelevatelor vaginale, folosind metode conventionale de diagnostic microbiologic (caractere fenotipice de metabolism si antigenicitate);
- Serotipizarea tulpinilor de S. agalactiae pe baza polizaharidului capsular;
- Testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor de S. agalactiae si E. coli, conform recomandarilor din ghidul elaborat de Clinical and Laboratory Standards Institute.
- Comunicarea rezultatelor studiului in cadrul lucrarilor Conferintei Nationale de Microbiologie si Epidemiologie (8-10 octobrie 2009, Brasov):

*Codruta-Romanita Usein, Laura Grigore, Raluca Georgescu, Maria Condei, Madalina Baltoiu, Maria Damian. Potentialul de patogenitate al unor izolate vaginale de Escherichia coli (comunicare orala)

*Anca Petrini, Raluca Georgescu, Laura Grigore, Olivia Vizitiu, Mihaela Arama, Codruta-Romanita Usein, Vasilica Ungureanu. Caracteristicile fenotipice ale streptococilor beta-hemolitci de grup B (SGB) izolati din secretii vaginale (poster)

*Monica Straut, Silvia-Mariana Cretoiu, Vasilica Ungureanu, Anca Maria Petrini, Raluca Georgescu, Laura Grigore, Codruta-Romanita Usein. Identificarea si distributia unor determinanti genetici in izolate de streptococ de grup B (poster)

- Comunicarea rezultatelor studiului in cadrul Simpozionului tematic organizat pentru marcarea Zilei Europene a Informarii despre Antibiotice (18 noiembrie 2009, INCDMI Cantacuzino):

*Anca Petrini, Raluca georgescu, Laura Grigore, Olivia Vizitiu, Mihaela Arama, Codruta Usein, Vasilica Ungureanu. Streptococii beta-hemolitici de grup B (SGB): portaj vaginal si rezistenta la antibiotice (comunicare orala)

Publicarea rezultatelor
*Usein Codruta-Romanita, Cretoiu Mariana-Silvia, Ungureanu Vasilica, Ghita Maria, Petrini Anca, Straut Monica. Genetic heterogeneity of group B streptococci isolated from Romanian pregnant women. Romanian Archives of Microbiology and Immunology 68 (2): 11-16, 2009.

Proiect 61-021

Acronim: TORULARHODIN

 

Elaborarea biotehnologiilor avansate de preparare a produselor farmaceutice antioxidante cu torularhodină şi studiul potenţialelor aplicaţii terapeutice

 

Director Proiect: Dr. Aurora Salageanu

 

Parteneri :

1. Universitatea POLITEHNICA Bucuresti-Departamentul de Bioinginerie si Biotehnologie
2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica
3. Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicinã Veterinara-Bucuresti

Obiectivul proiectului este elaborarea unei biotehnologii inovative de laborator pentru obţinerea bioproduselor antioxidante cu torularhodină şi stabilirea soluţiilor de valorificare în terapie.

• INCDMI “Cantacuzino” va elabora metodologia de caracterizare fizico-chimică şi biologică a proprietăţilor antioxidante ale preparatelor cu torularhodină, sistemul de testare a activităţii biologice, va participa la realizarea sistemelor de bioprocesare discontinuă şi fed-batch, va studia soluţiile potentiale de valorificare în terapie şi va asigura coordonarea cercetărilor în calitate de conducător de proiect.
• UPB-Departamentul de Bioinginerie şi Biotehnologie va coordona în principal studiile tehnologice de bioprocesare, va participa la elaborarea metodologiei de control a calităţii pe ansamblul operaţiilor din fluxul productiv şi la selecţia şi optimizarea tehnicii de separare a bioproduşilor, va realiza sinteza modelului productiv, şi va elabora manualul de diseminare a rezultatelor, care va fi folosit în procesul educativ şi de formare profesională.
• INCD Chimico-Farmceutice va realiza selecţia tulpinilor microbiene producătoare de torularhodină şi ameliorarea potenţialului productiv prin tehnici genetice, va elabora metodele de identificare şi determinare cantitativă a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi, va studia metodologia de management de calitate, va colabora la cercetarea bioprocesării şi la elaborarea metodologiei de separare a bioproduşilor.
• USAMV Bucureşti-Facultatea de Biotehnologie va studia extracţia bioproduşilor cu fluide critice, va realiza sinteza modelului de separare a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi şi va participa la optimizarea formulei mediului de cultură.

Etapa I (raportare 15 decembrie 2007): Studiul metodelor de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode analitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor

 

În cadrul lucrărilor aferente acestei etape a fost realizat un studiu şi o analiză a datelor de literatură în urma cărora s-a ajuns la următoarele concluzii :

 

• Cercetările au demonstrat că torularhodina şi pigmenţii carotenoizi asociaţi-torulena şi beta-carotenul sunt biosintetizaţi în special de drojdii din genurile Rhodotorula şi Sporobolomyces şi altele înrudite, drojdiile roz-roşii, care formează aceşti pigmenţi ca metaboliţi secundari cu rol de protecţie faţă de factori de mediu, în special lumina.
• Aplicaţiile actuale de interes ale acestor pigmenţi s-au extins mult dincolo de rolul de coloranţi şi provitamina A, în special în cazul torularhodinei demonstrându-se reale proprietăţi ca antioxidant, ceea ce îi conferă o activitate biologică cu rol în terapia bolilor ce au la bază mecanisme de declanşare şi evoluţie legate de efectul distructiv al radicalilor liberi şi al speciilor oxigen active.
• Analiza factorilor de mediu care influenţează biosinteza torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi a demonstrat că formarea acestor bioproduse depinde puternic de condiţiile de cultivare ale drojdiilor capabile de carotenogeneză: de temperatură, pH, prezenţa luminii, nivelul aeraţiei, prezenţa unor molecule cu rol în formarea speciilor oxigen active sau a radicalilor liberi, compoziţia mediului de cultură.
• Descifrarea căilor metabolice de formare a permis studiul aprofundat al acestor factori de influenţă în conexiune cu metabolismul şi stabilirea unor metode de modificare genetică a tulpinilor productive pentru creşterea potenţialului de biosinteză a torularhodinei.
• Pentru realizarea unei tehnologii de producţie de interes economic se recomandă folosirea unor surse ieftine de C, de obicei subproduse de la agricultură.
• Au fost efectuate studii experimentale privind metodele de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode anlitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor. Rezultatele acestor studii au condus la acumularea de date importante referitoare la comportamentul microorganismelor testate în condiţiile prestabilite, date care vor contribui la selecţia finală a microrganismului cu care se vor efectua, în fazele următoare, studiile de biosinteză şi extracţie a pigmenţilor carotenoidici.

 

Etapa II (raportare 15 decembrie 2008): Elaborarea biotehnologiei de formare torularhodină si pigmenti asociati în drojdiile din genurile Rhodotorula si Sporobolomyces

In urma efectuarii lucrarilor de cercetare aferente fazei a II-a au fost obtinute urmatoarele rezultate:

• In baza studiului de literatura, in lucrarile de mutageneza efectuate asupra tulpinii Rhodotorula rubra ICCF 209 (IC 120, IMF R7) a fost utilizat agentul mutagen alchilant N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), in doza de 2 mg/ml si timp total de actiune 30 minute si o ora. Dispersiile dilutiilor zecimale seriate in placi Petri au dus la selectionarea de pe mediul Bacto-Wortagar (BW) a unor colonii pigmentate in mov-negru, a caror carotenogeneza, cu etapa finala biosinteza torularhodinului, este favorizata de prezenta in mediu a glicerolului. Coloniile sunt foarte mici, intens colorate in mov-negru. Lucrarile de testare a stabilitatii genetice a acestui caracter au dus la selectia a 5 colonii prelevate de pe mediul BW care au fost trecute in conserv vegetativ pe acest mediu si pe mediul YM sucroza si au constituit tulpina Rhodotorula rubra ICCF 220.
• A fost studiata influenta surselor de carbon: glucoza, sucroza, maltoza, glicerol, asupra formarii de biomasa continand pigmenti carotenoidici la tulpinile: Rhodotorula rubra ICCF 220,Rhodotorula sp. ICCF 396 si Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369. Cantitatea de biomasa variaza in functie de tulpina si sursa de carbon intre 5-12 g/l ca S.U,pe mediul cu sucroza obtinandu-se rezultate mai bune.
• Studiul influentei unei temperaturi de 30-32^oC asupra evolutiei bioprocesului la Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat lungirea duratei fazei logaritmice si valori mai mici pentru indicii de caracterizare a acestuia, respectiv DO si formarea de biomasa exprimata ca S.U.
• A fost izolata tulpina Rhodotorula sp. ICCF 396 dintr-o tulpina de Rhizobium sp., care ocazional, pe mediile de cultura (BW, Extract de malt 4%) formeaza colonii intens colorate in rosuviolaceu. Cultivarea acesteia pe aceleasi medii si in aceleasi conditii ca si Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat similitudinea morfo-fiziologica cu tulpinile de Rhodotorula din colectie.
• Rezultatele cele mai bune privind utilizarea sursei de carbon (Mediul nr. 3 cu sucroza) cu formare de biomasa, s-au obtinut cu tulpina Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369 izolata din tulpina Xanthophillomyces dendrorhous ICCF 338 (DSM 5626).
• Continutul total în pigmenti carotenoidici este variabil, dependent de natura microorganismului, dar si de conditiile de cultivare, respectiv de natura sursei de carbon. Continutul în pigment cu absorbtia maximă la 490-500nm (posibil Torularhodin) în cazul cultivării Rhodotorula ICCF 220 pe mediul cu malt este cel mai ridicat.
• Mediile de cultură utilizate au prezentat o influentă considerabilă asupra dezvoltarii biomasei celulare si biosintezei pigmentilor carotenoidici, în particular a torularhodinei.
• Pentru tulpina parentala s-a determinat cea mai mare producŃie de torularhodină în mediul MS3 cu fructoză (626 μg/l mediu) urmată de zaharoză si glucoză, date comparabile cu cele din literatura de specialitate.
• Bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură Sabouraud si comparativ pe acelasi mediu a tulpinii mutante Rhodotorula rubra ICCF 220 (două experimente).
• S-a urmărit variatia în timp a densităŃii optice (măsură a dezvoltării celulare), a pH-ului si a variatiei concentratiei oxigenului dizolvat în timp. Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponential. Pentru tulpina mutantă s-au obtinut valori mai mari ale vitezei specifice de crestere fată de tulpina parentală, dar valorile nu diferă semnificativ.

Etapa III (raportare 15 iulie 2009): Stabilirea procedeului de laborator de formare a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi

Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

-          Metoda de extracţie cea mai eficientă a pigmenţilor din celulele a două tulpini de drojdii aparţinând genului Rhodotorula este extracţia cu DMSO şi acetonă.

-           Dintre metodele studiate în vederea realizării separării şi izolării torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi din extractele carotenoidice totale, metoda cromatografiei pe coloană la presiune normală a condus la obţinerea rezultatelor scontate în sensul că au fost separate fracţii  ale căror spectre de absorbţie în domeniul vizibil şi cromatograme realizate prin LC-MS au demonstrat prezenţa torularhodinei.

-          Au fost stabilite condiţiile optime de operare care permit realizarea unei separări corespunzătoare a bioproduşilor prin  HPLC. 

-          A fost testată şi aplicată metoda spectrofotometrică. Pe baza unei curbe etalon de ß-caroten au fost efectuate determinările cantitative necesare stabilirii conţinutului în carotenoide şi precum şi eficienţa diferitelor operaţii tehnologice.

-          S-a realizat bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură MS3, în care s-a folosit zaharoza ca sursă de carbon atât datorită inducerii biosintezei torularhodinei ca metabolit secundar cu proprietăţi tinctoriale şi antioxidante, cât şi datorită preţului de cost scăzut.

-          S-a realizat cultivarea într-un bioreactor de laborator tip Bioengeering cu capacitatea de 3, 7 L prevăzut cu aerare, agitare, termostatare şi înregistrare automată a unor parametrii de proces-turbiditate, pH, pO₂ .

-          Pe parcursul dezvoltării culturii au fost monitorizaţi următorii parametri: temperatură, pH, pO₂ şi turbiditate, care au fost reprezentaţi grafic în funcţie de timpul de biosinteză. Nivelul scăzut al pO₂ către sfârşitul fazei exponenţiale de creştere indică faptul că este necesară mărirea în continuare a parametrilor ce influenţează nivelul transferului interfazic al oxigenului, turaţia agitatorului mecanic şi debitul de aerare, pentru a realiza un exces de oxigen dizolvat şi neconsumat de cca 20% pe durata bioprocesului discontinuu.

-          Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponenţial. Valorile obţinute pentru fiecare caz în parte sunt comparabile pentru cele doua obţinând experimente efectuate independent.

-          După încheierea biosintezei, s-a realizat prelucrarea biomasei. Biomasa umedă a fost separată prin centrifugare şi s-a efectuat extracţia pigmenţilor carotenoidici totali în hexan precum şi a torularhodinei, singura componentă cu caracter acid în metanol bazic, trasându-se curbele de absorbţie în vizibil şi calculându-se totodată concentraţia acestor pigmenţi raportată atât la substanţa uscată cât şi la unitatea de volum de mediu.

-          S-a determinat o concentraţie finală de beta-caroten cuprinsă între 600-700 μg/L mediu precum şi o concentraţie de torularhodină de 377 μg/L. Pe parcursul biosintezei în probele recoltate s-a determinat după primele 24 de ore de dezvoltare o preponderenţă a beta-carotenului, iar după 48 de ore de dezvoltare mai mult de 50 % din acest pigment se poate presupune că s-a transformat pe calea metabolică descrisă în literatură în torularhodină.

Studiul diferitelor modele de extractie a cu fluide supercritice propuse pentru pigmenti din clasa carotenoizilor a condus la concluzia ca aceasta metoda poate poate fi folosita cu randamente acceptabile, in special in cazul utilizarii unor co-solventi organici.

 

Etapa IV (raportare 15 noiembrie 2009): Studiul condiţiilor de separare şi caracterizare bioproduşi

 

Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

-          Studiile efectuate în vederea realizării dezintegrării /disrupţiei membranelor celulare i au constat în aplicarea tehnicilor: tehnica imersării în azot lichid (congelare) urmată de imersia în apă fierbinte (decongelare); tratare la cald cu soluţie salină peste tăria ionică fiziologică ( sol. NaCl 20%); tratare in sisteme agitate ( tip Vortex sau Dezintegrator) cu perle de zirconiu de diferite diametre (0,5-1 mm).

-          Efectul tratamentelor aplicate asupra celulelor de biomasă a fost urmărit prin intermediul imaginilor captate la microscopul optic şi prin cantitatea de pigmenţi carotenoidici extrasă  în volume egale de solvent de extracţie.

-          Tratamentul cu perle în aparate tip Vortex sau Dezintegrator apare ca un procedeu necesar, care favorizează extracţia pigmenţilor din celulele de drojdie. În absenţa oricărui procedeu de permeabilizare/dezintegrare a membranei celulare extracţia pigmenţilor nu se realizează, sau se realizează în condiţii dificile necesitând adaosuri de acizi sau baze care pot produce modificări ale structurii pigmenţilor extraşi.

-          Au fost extinse studiile privind posibilitatea realizării separării pigmenţilor carotenoidici din extractele celulare prin metoda repartiţiei lichid-lichid.

-          Urmărirea procesului de separare a pigmenţilor carotenoidici extraşi din culturile testate s-a realizat prin metodele analitice selectate şi anume : spectrofotometric, prin cromatografie în strat subţire şi HPLC.

-          Prin aplicarea reapartiţiei între Metanol şi Hexan în condiţii de variaţie a valorii pH-ului s-au separat pigmenţii nepolari (sau cu polaritate scăzută) prin trecere în faza hexanică la pH alcalin, iar pigmentul cel mai polar , (în cazul nostru Torularhodinul) a fost trecut în faza hexanică abia după acidulare. Maximul de absorbţie al acestor faze s-a situat în intervalul de 495 – 499 nm atribuit Torularhodinului conform datelor de literatură.

-          Prezenta pigmentului Torularhodinul a fost confirmata şi prin aplicarea metodei HPLC unde a fost evidenţiată prezenţa unui singur compus majoritar al cărui spectru pe pic este similar cu al Torularhodinului prezentat în literatura de specialitate cu un maxim la λ =495 nm .

-          In vederea stabilirii metodei optimizate de testare a caracterului antioxidant al pigmentilor carotenoidici, au fost analizate metodele fluorimetrice pentru determinarea capacitatii antioxidante impotriva radicalilor peroxyl (ORAC – Oxygen Radicals Absorbance Capacity), peroxinitrit (NORAC – Nitric Oxide Radicals Absorbance Capacity), hydroxyl (HORAC – Hydroxyl Radical Absorbance Capacity) si superoxide (SORAC – Superoxide Radicals Absorbance Capacity). Metoda fluorimetrica ORAC se adreseaza atat antioxidantilor hidrosolubili (H-ORAC), cat si celor liposolubili (L-ORAC), capacitatea antioxidanta totala impotriva radicalilor peroxyl fiind suma valorilor obtinute pentru cele doua variante (ORAC total = H-ORAC + L-ORAC).

-          Pentru realizarea obiectivului privind diseminarea rezultatelor preliminare au fost realizate :

×          un poster  prezentat la “16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering ” Sinaia, sept.9-12, 2009

×           o lucrare publicată în ” Proceedings of the 16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering “

×          un poster ce urmeză a fi prezentat la “2nd International Symposium on New Research in Biotechnology,” 19 – 20th November 2009, Bucharest, Romania.

 

STRATEGIA ACTIVITATII DE CERCETARE-DEZVOLTARE A

INSTITUTULUI NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE

PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE “CANTACUZINO”

Misiune

Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino”, care functioneaza in conformitate cu Hotarirea de Guvern 1563/2008 din noiembrie 2008, dateaza din anul 1921 cand, prin decret regal, a fost creat „Institutul de Seruri si Vaccinuri Dr. I. Cantacuzino”.

De-a lungul celor peste 87 de ani de existenta, specialistii institutului au fost implicati in activitati de supraveghere a bolilor transmisibile, asigurand supravegherea microbiologica si pregatirea specialistilor in domeniile microbiologiei si imunologiei.

In prezent, INCDMI “Cantacuzino” are ca domeniu de activitate sanatatea publica, pe care o promoveaza atat prin activitati de cercetare-dezvoltare, cat si prin oferta de produse si servicii.

Activitatea de cercetare stiintifica, dezvoltare tehnologica si inovare se desfasoara in domeniile: infectii bacteriene, virale si parazitare, biologiei celulare si moleculare, imunologiei, biotehnologiei si geneticii microbiene.

Oportunitati

Schimbarile majore intervenite in societatea romaneasca o data cu integrarea in Uniunea Europeana creaza oportunitati reale in perioada urmatoare pentru indeplinirea misiunii INCDMI “Cantacuzino”. Acestea se concretizeaza in:

Ø  cresterea fondurilor alocate cercetarii (cheltuieli publice pentru cercetare de 1% din PIB in 2010, in acord cu Strategia Lisabona)

Ø  lansarea Planului National de Cercetare Dezvoltare Inovare PNII pentru perioada 2007-2013

Ø  accesul la fondurile structurale destinate cresterii competitivitatii economice, inovarii si dezvoltarii resurselor umane

Ø  lansarea competitiei FP7 si posibilitatea de a accesa fondurile de cercetare europene

Ø  posibilitati de atragere a fondurilor din domeniul privat

Punctele forte ale INCDMI “Cantacuzino” sunt:

Ø  dimensiunea institutiei si complexitatea/complementaritatea activitatilor desfasurate (cercetare-dezvoltare, servicii de sanatate publica, productie, invatamint)

Ø  importanta strategica a domeniului de activitate

Ø  o buna vizibilitate pe plan national

Ø  gradul inalt de specializare al personalului

Ø  structura personalului (numar mare de tineri:  peste 50 angajati in ultimii 3 ani)

Ø  infrastructura (imbunatatita prin echipamente de cercetare performante achizitionate in ultimii 3 ani)

Ø  posibilitati de informare si documentare (retea de calculatoare, internet, acces on-line la Biblioteca I.Pasteur Paris)

Ø  capacitate de instruire si formare (exista expertiza si experienta pentru organizarea de cursuri, simpozioane etc, in cadrul Centrului de învăţământ si documentare „Jacques Monod”)

Ø  apartenenta la retele europene si internationale de cercetare si supraveghere microbiologica, intre care RIIP

Punctele slabe ale INCDMI “Cantacuzino” sunt:

Ø  nefructificarea tuturor oportunitatilor

Ø  insuficienta valorificare a rezultatelor derivate din proiectele de cercetare

Ø  relativa dispersare a domeniilor de interes stiintific

Ø  vizibilitatea internationala relativ scazuta (numar relativ mic de publicatii in ultimii ani)

Constringeri:

Ø  concurenta mare pe plan intern si international in domeniile de cercetare de virf

Ø  insuficienta finantare a cercetarii din fonduri private

Ø  insuficienta personalului cu grade stiintifice medii si inalte compatibile cu cerintele coordonarii proiectelor de cercetare

Obiective strategice

In acest context, se definesc urmatoarele obiective strategice ale activitatii de cercetare dezvoltare, in concordanta cu rolul INCDMI “Cantacuzino” ca una dintre cele mai importante unitati de cercetare medicala din tara:

Ø  Cresterea performantei stiintifice prin obtinerea unor rezultate stiintifice de virf, competitive pe plan global

Ø  Transferul cit mai rapid al rezultatelor cercetarii in domeniul sanatatii publice

Ø  Cresterea impactului social al cercetarii, prin contributii la optimizarea metodelor de detectare si caracterizare a bolilor, precum si la dezvoltarea mijloacelor de profilaxie si tratament

Ø   Cresterea potentialului de cercetare dezvoltare prin:

×          formarea profesionala continua si asigurarea unei cariere in cercetare;

×          dezvoltarea institutionala

Ø  Cresterea vizibilitatii nationale si internationale prin oganizarea si participarea la manifestari stiintifice, cresterea numarului de publicatii in reviste de specialitate (in special in cele cotate ISI) si a numarului de brevete

Ø  Cresterea participarii echipelor de cercetare la proiecte europene si internationale

Ø  Cresterea participarii membrilor comunitatii stiintifice ca experti evaluatori la competitii nationale si internationale

Directii de cercetare strategice

Preambul

Pentru a raspunde cerintelor legate de evolutia stiintei, pe de o parte si de misiunea institutului in domeniul sanatatii publice, pe de alta parte, este necesara mentinerea unui echilibru intre cercetarile fundamentale, cercetarile orientate direct spre problemele de sanatate (in particular in domeniul bolilor infectioase), activitatile de sanatate publica si cele de dezvoltare tehnologica in scopul modernizarii fabricarii produselor biologice de uz uman.

Pentru a mentine acest echilibru de o maniera creativa si a permite obtinerea unor rezultate stiintifice importante, este nevoie de:

Ø  abordarea unei game largi de tematici stiintifice, de la cele fundamentale la cele medicale

Ø  largirea numarului de modele experimentale si dezvoltarea unui numar mare de metode de studiu in cadrul unei tematici

Ø  integrarea noutatilor tehnologice de virf si a celor mai noi strategii din domeniul cercetarii

Principalele directii strategice ale activitatii de cercetare-dezvoltare pe termen mediu sunt:

Ø  Studii fundamentale privind mecanismele de patogenitate, interactia organism-agent patogen, mecanisme de adaptare ale agentilor patogeni (inclusiv rezistenta la antibiotice)

Ø  Microbiologie medicala: studiul etiologiei si patogeniei bolilor infectioase

Ø  Microbiologie aplicata: metode de caracterizare a microrganismelor, studiul interactiilor dintre microorganisme si interactia lor cu gazda si mediul, potentialul aplicativ

Ø  Dezvoltarea unor noi metode de diagnostic si control al bolilor infectioase; elaborarea de noi teste moleculare in vederea cresterii capacitatii de raspuns rapid in cazuri de alerta microbiologica

Ø  Cercetari privind identificarea unor noi biomarkeri, in scopul cresterii capacitatii de detectare precoce, de trasare a infectiilor si prevenire a bolilor infectioase

Ø  Studiul bolilor infectioase emergente si re-emergente

Ø  Entomologie medicala si ecologia insectelor ca vectori

Ø  Dezvoltarea de noi vaccinuri, adjuvanti pentru vaccinare, metode de aplicare a vaccinurilor, asigurarea supravegherii in cazul bolilor prevenibile prin vaccinare si monitorizare post-vaccinala

Ø  Studii fundamentale si aplicate privind mecanismele raspunsului imun si reglarii acestuia in apararea antiinfectioasa si antitumorala, rolul fiziologic si patologic al inflamatiei, mecanismele raspunsului imun deviat

Ø  Studii fundamentale si aplicate in domeniul patologiilor umane mediate imun (autoimunitate) in scopul elucidarii mecanismelor implicate in etiopatogenia acestora, identificarii de noi markeri de diagnostic precoce, monitorizare si prognostic, identificarii de noi tinte terapeutice

Ø  Dezvoltarea unor noi biotehnologii si modernizarea si optimizarea biotehnologiilor actuale prin folosirea unor alternative tehnologice eficiente

Ø  Dezvoltarea infrastructurii de cercetare

Ø  Extinderea procedurilor de validare a metodelor si de acreditare a laboratoarelor

Resurse

Surse de finantare

Asigurarea resurselor finaciare pentru activitatea de cercetare-dezvoltare se va face din:

Ø  Surse interne:

×          fonduri publice (participare la competitiile din cadrul PNII)

×          fonduri private (identificare, atragere)

Ø  Surse externe:

×          Uniunea Europeana (participare la competiile FP7)

×          RIIP (proiecte ACIP, PTR)

Resurse umane

Potentialul uman si gradul de specializare al personalului existent asigura suportul necesar abordarii acestei strategii. Totusi, problema asigurarii personalului de cercetare trebuie avuta permanent in vedere, prin:

Ø  continuarea atragerii studentilor, rezidentilor si tinerilor absolventi (efectuarea lucrarilor de licenta, masterat si doctorat, angajari temporare)

Ø  cresterea numarului de doctori in stiinte, a numarului cercetatori cu gradele stiintifice I si II

Ø  asigurarea unei motivari convingatoare, intelectuale (promovare, dezvoltarea carierei) si materiale (salarizare corespunzatoare)

Ø  mentinerea unui nivel inalt de exigenta stiintifica

Ø  asigurarea unui climat social local stimulativ si motivant

Concluzii

Strategia de cercetare a institutului este subordonata cerintelor de sanatate publica si are un caracter dinamic, adaptindu-se permanent la necesitatile reale pe plan national si international. Astfel, aceasta strategie are un caracter prospectiv, care permite, prin integrarea unor cercetari de virf folosind concepte si metode novatoare din domeniile microbiologiei, imunologiei, biologiei moleculare si celulare, biotehnologiei, vaccinologiei etc, anticiparea provocarilor din domeniul sanatatii publice si pregatirea unor solutii eficiente si viabile din punct de vedere economico-finaciar („cost-effective”) pentru rezolvarea acestora.

In concluzie, prin strategia propusa, se urmareste ca activitatea de cercetare dezvoltare desfasurata in INCDMI “Cantacuzino” sa fie caracterizata prin:

Ø  Performanta stiintifica inalta

Ø  Raspunde cerintelor de sanatate publica

Ø  Implicare activa in  social

Ø  Competitivitate pe plan international

Ø  Vizibilitate interna si internationala

Proiect 42164

Acronim:  MIRVI

Investigatii moleculare ale infectiilor respiratorii acute determinate de virusuri non-gripale, cu evaluarea implicatiilor in patologia sugarului si copilului mic

 

Proiectul are ca scop investigarea infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial – VRS, Meta Pneumo virusului uman – hMPV, Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si Coronavirusurile OC 43 si 229E) folosind tehnici de evaluare moleculara atat a agentilor etiologici cat si a reactiei organismului la acestia utilizand atat datele clinice cat si testele de laborator moleculare, atat pentru diagnostic etiologic cat si de analiza a mediatori solubili ai inflamatiei (citokinelor/chemokinelor serice).

Se stie ca, daca pentru diagnosticul virozelor datorate VRS si adenovirusului exista si teste rapide comerciale de diagnostic iar pentru celelalte virusuri doar diagnosticul prin imunofluorescenta, aceste metode nu prezinta aceeasi sensibilitate si specificitate ca diagnosticul molecular prin RT-PCR (revers transcription polimerase chain reaction). In acelasi timp efectul acut al infectiilor respiratorii virale non-gripale asupra organismului, tradus prin secretia mediatorilor solubili ai inflamatiei a fost investigat pana acum intr-o masura relativ restransa. Drept urmare, obiectivele principale ale studiului sunt: evaluarea acestor infectii utilizand tehnici moderne atat de detectie a patogenului (RT-PCR/real time RT-PCR) cat si de analiza a raspunsului organismului prin profilul mediatorilor solubili ai inflamatiei (Tehnologia Multiplex – xMAP, aplicata pe platforma LUMINEX 100IS); stabilirea relevantei clinice a profilului molecular; estimarea implicatiilor asupra strategiei de diagnostic, management si control al infectiilor respiratorii la copii.

Rezultatele estimate ale proiectului sunt: punerea la punct si optimizarea unui pachet de tehnici moleculare de diagnostic, imbunatatind metodologia diagnosticarii infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial_VRS, MetaPneumo virusului_hMPV,Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si CoronaVirusurile OC 43 si 229E); obtinerea unui tablou al pattern-urilor de secretie de mediatori solubili ai inflamatiei (realizabil doar folosind tehnologia Multiplex), in corelatie cu incarcarea virala, profilul clinic etc.; incidenta acestor viroze in patologia respiratorie a sugarului si copilului mic care se adreseaza clinicilor pediatrice din proiect; identificarea de  parametri semnificativi in evaluarea impactului celorlalte rezultate.     

Prin tematica abordata, proiectul se incadreaza in directia de cercetare 4. Sanatate, tematica de cercetare 4.1.3 Metode de investigaţie şi intervenţionale bazate pe medicina moleculară şi celulară, genomică şi proteomică din Planul National de Cercetare Dezvoltare si Inovare II, Programul Parteneriate, deoarece:

• 1. Virozele respiratorii altele decat gripa reprezinta o problema majora de sanatate publica la sugar si copilul mic cu un important impact socio-economic.
• 2. Studiul propus implica folosirea unor metode si tehnici specifice medicinei moleculare
• 3. Rezultatele estimate ale cercetarii vor putea fi folosite in conturarea unei noi abordari in investigarea si evaluarea eficientei strategiilor de management si control ale virozelor respiratorii non-gripale la sugar si copilul mic.
• 4. Gradul inalt de complexitate si interdisciplinaritate al activitatilor propuse impun constituirea unui parteneriat format din specialisti de cea mai inalta competenta din domenii complementare ale cercetarii si practicii medicale (pediatrii, medici de laborator – virusologi, imunologi, specialisti in medicina moleculara)

      Impactul proiectului este major in aria de cercetare medicala atit nationala cit si internationala domeniul abordat reprezentand o prioritate tematica la nivel national, deoarece pana acum nu s-au realizat studii sistematice in tara noastra in acest domeniu. Proiectul va fi realizat prin colaborarea a trei institutii de cercetare medicala din Romania:

1. Promotorul Proiectului: Institutul National de Cercetare Dezvoltare in Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino” (IC), cu experienta in cercetare fundamentala si aplicata in domeniul microbiologiei, imunologiei, virusologiei si medicinii moleculare
2. Spitalul de Pediatrie Grigore Alexandrescu-Bucuresti

Universitatea de Medicina si Farmacie Carol Davila (Clinica Pediatrie IOMC Alfred Russescu, Bucuresti

 

Obiectiv specific faza I Punerea la punct şi optimizarea unor metode de diagnostic molecular în afecţiunile virale respiratorii non-gripale precum şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei, utilizând tehnologia multiplex xMAP^â -Luminex. Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale: analiza datelor din literatură privind tehnicile de diagnostic molecular (RT-PCR şi real time RT-PCR) al infecţiilor respiratorii non-gripale, elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie, de formare a loturilor de pacienţi diagnosticaţi cu infecţii respiratorii virale, elaborarea metodologiei de recoltare a probelor biologice, evaluarea virusologică a tulpinilor de virusuri non-gripale detectate prin secvenţierea lor şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei.

 

Rezumat faza I Infecţiile respiratorii în general constituie o grupă patologică cu mare impact în motbiditate şi mai ales cu potenţial serios de producere de epidemii cu viteză mare de extindere şi gravitate semnificativă. In cadrul patologiei sugarilor şi copiilor mici, infecţiile respiratorii constituie o problemă majoră at]at prin numărul cazurilor cât şi prin dificultatea aplicării metodelor de prevenţie. Aproximativ 70% din infecţiile respiratorii acute ale copilului sunt determinate de virusuri, majoritatea dintre ele fiind non-gripale. Din punct de vedere etiologic, există teste rapide comerciale numai pentru infecţiile virale respiratorii datorate VRS şi ADV, iar în general pentru virusurile respiratorii non-gripale se utilizează teste de imunofluorescenţă dar care nu au o sensibilitate (aproximativ 90%) şi specificitate (aproximativ 84%) foarte bune. Astfel, se impune în diagnosticarea infecţiilor virale respiratorii, altele decât gripa. Un diagnostic performant şi rapid în baterie, pentru majoritatea acestor virusuri care sunt importante în patologie, fiind un domeniu în care se descoperă atât noi patogeni (cum este de exemplu Metapneumovirusul uman (hMPV)) cât şi noi aspecte ale infecţiilor virale respiratorii, cum a fost epidemia SARS (severe acute respiratory syndrome) dată de un coronavirus.

In Romania, diagnosticarea etiologică a acestor infecţii a fost iniţiată de INCDMI Cantacuzino, iar acest demers trebuie continua şi dezvoltat. Un alt aspect mai putin investigat până acum sau în curs de investigare este reacţia acută a organismului faţă de aceste infecţii, exprimată în tabloul mediatorilor solubili ai inflamaţiei. Astfel se vor analiza aceste infecţii respiratorii non-gripale (datorate VRS, Metapneumovirusul uman (hMPV), virusurilor Paragripale 1,2,3 şi Coronavirusurile OC43 şi 229E) folosind tehnici de evaluare moleculară moderne atât a agenţilor etiologoci cât şi a reacţiei organismului la aceştia utilizând atât datele clinice cât şi testele de laborator moleculare, atât pentru diagnostic etiologic, cât şi de analiza mediatorilor solubili ai inflamaţiei (citokinelor/chemokinelor serice).

Rezultatele studiului vor fi utilizate pentru estimarea implicaţiilor asupra strategiei de diagnostic, management şi control al infecţiilor respiratorii la copii.

Virusurile sunt implicate în majoritatea infecţiilor respiratorii la sugari şi copii mici. Datorită incidenţei mari ale bronşiolitelor la copiii mici cauzate de VRS (40-45%) şi a hMPV (7-12%), apare necesitatea punerii unui diagnostic cât mai specific şi mai sensibil ale unor astfel de afecţiuni cât şi evaluarea mecanismelor patologice implicate la nivel molecular. Pentru un diagnostic cât mai bun şi eficient în aceste afecţiuni, se impune implementarea metodelor de diagnostic molecular (RT-PCR) standard şi/sau multiplex şi/sau real-time. Menţionăm drept exemplu faptul că la această oră pentru diagnosticul afecţiunilor cauzate de hMPV există numai această tehnică moleculară pe care INCDMI Cantacuzino a introdus-o în cadrul laboratorului său de Infecţii Respiratorii Virale, pentru prelucrarea probelor de la sugari şi copii mici. Pentru reducerea costului reacţiilor se poate testa şi introduce reacţia de amplificare moleculară pentru mai multe virusuri deodată (PCR Multiplex) de exemplu pentru virusurile paragripale se poate realiza RT-PCR Multiplex pentru cele 3 tulpini (1,2,3) într-o singură reacţie.

Patogeneza infecţiilor respiratorii cu etiologie virală nu este pe deplin clarificată până în prezent, dar există un consens în ceea ce priveşte implicarea răspunsului imun al organismului gazdă în mecanismele producerii bolii. În privinţa evaluării mediatorilor solubili ai inflamaţiei, este cunoscut faptul că profilul secreţiei lor influenţează atât profilul clinic, cât şi evoluţia ulterioară a pacienţilor, fiind factori posibili de inducere şi/sau prognosticare a evoluţiei spre hipersensibilitate şi inflamaţie cronică de tipul celei prezente în astmul bronşic.

Studierea în detaliu a mecanismelor patogenice implicate în SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome, cauzat de un coronavirus înrudit cu Coronavirusurile OC43 şi 229E, numit SARS-CoV) a dus la conturarea unei paradigme conform căreia infecţia virală induce un răspuns imun exagerat, manifestat în principal prin niveluri sistemice extrem de crescute ale mediatorilor solubili ai inflamaţiei (“furtună de citokine”), responsabile de distrugerea alveolară difuză caracteristică acestui sindrom. Ulterior, paradigma a fost extinsă şi pentru cazurile de infecţii respiratorii gripale cu tulpina H5N1, fiind aplicată generic tuturor infecţiilor respiratorii cu etiologie virală care au evoluţie gravă. Totuşi, aceasta pare a fi o abordare prea simplistă a problemei, care nu reflectă realitatea. Studii ulterioare au arătat că în cazul SARS evoluţia nefavorabilă este asociată cu valori sistemice crescute ale unor chemokine (CXCL9: MIG, monokine induced by γ -interferon; CXCL10: IP-10, interferon inducible protein-10; CCL2: MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1) dar fără creşterea valorilor citokinelor pro-inflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-α); IFN-α, IFN-γ şi IL-12 au valori scăzute; există un anumit grad de limfopenie şi în cazul unora dintre pacienţi apar autoanticorpi (IgM şi împotriva unor antigene citoplasmatice pneumocitare) (1). În cazul infecţiei cu H5N1 (1997) cazurile care au evoluat spre exitus au fost asociate cu valori serice excesive ale IL-6, IL-2R şi IFN-γ precum şi cu depleţie limfocitară. Se impune astfel nuanţarea paradigmei enunţate mai sus, putându-se descrie pattern-uri de mediatori solubili caracteristice fiecărei etiologii.

Astfel, în cazul VRS (virusul respirator sinciţial) se constată atât niveluri sistemice crescute ale citokinelor pro-inflamatorii (IL-6, TNF-α şi IL-8) dar şi anti-inflamatorii (IL-10) care participă la efectele patogenice ale infecţiei (însoţite de secreţie scăzută de IFN tip I). Se asociază şi un pattern particular de chemokine, incluzând IL-8/CXCL8, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MIP-2, IP-10, eotaxin-1/CCL11, MCP-1 şi RANTES/CCL5. VRS este capabil să infecteze celulele dendritice (DC, atât mieloide cât şi plasmacitoide); DC infectate sunt capabile de maturare (exprimă la nivel membranar CD80, CD86 şi MHC-II) dar nu mai pot realiza eficient “priming”-ul limfocitelor T antigen-specifice (DC infectate sunt incapabile de a secreta citokine de tip Th-1, cum ar fi IFN-α şi IL-12p70 necesare pentru promovarea funcţiei efectorii a limfocitelor T CD8+; în schimb induc polarizare Th-2, cu secreţie de IL-4 şi IL-5 de către limfocitele T CD4+). Aceste fenomene au cel puţin două consecinţe patogenice: lipsa unei memorii imunologice eficiente post-infecţie (asociată cu reinfecţii frecvente) şi favorizarea hiperactivităţii inflamatorii a mucoasei tractului respirator (astm bronşic). Răspunsul de tip Th-2 a fost obţinut şi în urma încercărilor de a se obţine un vaccin (VRS inactivat prin tratare cu formalină a indus în modele experimentale la o memorie imunologică polarizată Th-2, responsabilă de reacţie inflamatorie cu eozinofile şi distrugere pulmonară extensivă prin complexe imune şi complement la a doua expunere la VRS) (2).

Deşi înrudit cu VRS, metapneumovirusul uman (hMPV) prezintă un mecanism diferit de evitare a răspunsului imun antiviral. Acest virus poate infecta DC (atât mieloide cât şi plasmacitoide) dar fără a induce maturare; celulele infectate produc doar IL-6 şi TNF-α (în concentraţii mult mai mici decât VRS) în schimb induc secreţie semnificativă de IFN-α (deşi în modele experimentale in vitro hMPV, similar cu VRS, a putut bloca în mod eficient secreţia de IFN-α indusă prin agonişti sintetici: poly-IC sau CpG) (3). În plus,m modele experimentale pe animale de laborator indică un pattern de chemokine diferit în cazul hMPV faţă de VRS: valori crescute ale GM-CSF şi KC (chemoatractant al neutrofilelor) (4).

Astfel de pattern-uri de mediatori solubili au fost definite pentru toţi agenţii etiologici ai infecţiilor respiratorii luaţi în discuţie în proiectul de faţă, dar rezultatele sunt neconcludente (şi chiar uneori contradictorii, în special în cazul modelelor experimentale, rezultatele variind mult în funcţie de specia de animal de laborator pentru experimentele in vivo sau tipul liniei celulare pentru cele in vitro). Se impune astfel continuarea acestor tipuri de studii prin analiza mediatorilor solubili ai răspunsului imun la pacienţii cu infecţii respiratorii, atât în faza acută a bolii cât şi în perioada de convalescenţă.

 

Concluzii faza I

A fost atins obiectivul acestei faze a proiectului: elaborarea modelului teoretic de studiu pentru evaluarea virozelor respiratorii non-gripale.

Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale:

• - Analiza datelor din literatură privind tehnicile moleculare de diagnostic ale infecţiilor respiratorii virale non-gripale;
• - Elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie a loturilor de pacienţi;
• o Elaborarea metodologiei de: – evaluare clinică a pacienţilor, recoltare probe biologice;

evaluarea diagnosticului de infecţii respiratorii cauzate de virusuri non-gripale prin tehnici moderne moleculare

Proiect CEEX nr. 158/2006

Descarca Ghid Proiect

Denumirea proiectului : „Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicaţii în dezvoltarea unor sisteme de diagnostic şi terapeutice”

Responsabil de proiect: Dr. Gabriela Oprişan, biolog principal, CS II, goprisan@cantacuzino.ro

CO – INCDMICantacuzino: CSII Dr. Gabriela Oprişan; Camelia Szmal; Sorin Dinu; Ana-Maria Oprişoreanu; Mircea Panait
Parteneri:
P1 – Institutul de Virusologie „Şt. S. Nicolau” – Conf. Dr. Simona Ruţă, CS I; Camelia Sultana; Irina Alexiu; Loredana Manolescu; Gabriela Anton; Camelia Grancea; Ana Neagu; Carmen Sencovici
P2 – Spitalul Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor Babeş”: Dr. Graţiela Ţârdei; Petre Iacob Calistru; Adriana Moţoc; Ştefan Lazăr; Camelia Ionescu; Augustina Culinescu
P3 – Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila”: Prof. Dr. Emanoil Ceauşu; Cristiana Cristea; Ghe. Voiculescu
P4 – Institutul de Sănătate Publică „Prof. Dr. Leonida Georgescu” Timişoara: Dana Brehar-Cioflec; Emilian Damian Popovici; Graţiana Chicin; Camelia Claici

 

 Variabilitatea virusului hepatitei virale C pare sã influenţeze performanţele testelor actuale de diagnostic, bazate numai pe antigene provenite din HCV de tip 1. Romania este ţara cu cea mai mare prevalenţã a infecţiei cu HCV din regiunea balcanicã. Sistemele de serodiagnostic curente sunt considerate neadecvate pentru screening-ul unor populaţii infectate cu alte genotipuri decat 1. Prin acest studiu ne-am propus sǎ evaluǎm impactul diversitǎţii genetice asupra capacitǎţii de detecţie a sistemelor de diagnostic actuale. Prin mutaţie şi recombinare noile variante virale pot fi avantajate selectiv şi pot căpăta proprietǎţi noi. Evidentierea acestor fenomene poate contribui atât la înţelegerea biologiei acestui virus şi a patogenităţii sale cît şi pentru ameliorarea diagnosticului şi a tratamentului. Printr-un studiu molecular extins se vor obţine si informaţii epidemiologice legate identificarea căilor de transmitere şi a focarelor de infecţie.

 Obiectivele acestui proiect au fost:

1. Evaluarea genotipurilor/variantelor de virusuri circulante la noi în ţarǎ şi caracterizarea lor molecularǎ (mutaţii, recombinare, ORF decalat)

2. Identificarea cǎilor de transmitere a virusului şi a focarelor de infecţie

3. Evaluarea impactului variabilitǎţi tulpinilor HCV circulante în România asupra diagnosticului (prin teste serologice, kituri de genotipare versus secvenţiere) 

4. Dezvoltarea unor metode care permit identificarea şi caracterizarea unor noi subtipuri/variante HCV şi a tulpinilor recombinante cu risc patogen crescut

5. Aplicarea rezultatelor cercetǎrii în unitǎţile medicale în vederea reducerii numǎrului de infecţii cu virusul hepatitei C

 PLAN DE REALIZARE

 Etapa I. Evaluarea genotipurilor circulante in Romania (Co, P1, P2, P3, P4)

 Termen de realizare a etapei: 01.12.06        

Rezultate :

1. Constituirea unui lot de seruri bine caracterizate

2. Elucidarea cazurilor ce produc rezultate indeterminate in diagnosticul serologic al infectiilor cu HCV

Documente de monitorizare : Chestionar cu date demografice si clinico-epidemiologice;

Raportul reuniunii cu toti partenerii; Raport de experimentare; Raport general de etapa.

Activităţi :

1. Colectare seruri (P2, P4, Co)

-  definirea criteriilor de selectie a serurilor si realizarea unui chestionar cu date demografice si clinico-epidemiologice (P2, P4, Co)

-  realizarea bancii de seruri – 600 seruri  (P2, P4 )

-  realizarea unei banci centralizate de seruri care vor fi analizate si prin biologie moleculara (Co)

2. Testarea serologica a probelor (P1, P2, P3, P4, Co )

- stabilirea algoritmului de diagnostic virusologic pentru prezenta markerilor serologici ai infectiei cu virusuri hepatitice cu transmitere parenterala- teste de triaj si confirmare (P1, P2, P4)

-  testarea anticorpilor anti HBc, anti HBs (P1, P2, P4)

- detectia anticorpilor anti HCV prin tehnici imunoenzimatice ELISA (P1, P2, P3, P4, Co)

3.Testarea moleculara a probelor  (P1, P2,P3)

- evaluarea cantitativa a ARN HCV plasmatic si determinarea valorii predictive a profilului testelor de confirmare de tip Western Blot pt. Prezenta replicarii virale active (P1, P2, P3)

Etapa II. Investigarea variabilitatii genetice a genotipurilor circulante in Romania (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 30.06.07

Rezultate:

1. Ameliorarea sensibilitatii reactiei PCR in vederea diagnosticului in faza de preconversie serologica

2. Evaluarea markerilor moleculari home-made pt. evaluarea variabilităţii tulpinilor din Romania

 Activităţi:

1. Testarea serologica a probelor – conform etapei I.1  (Co, P1, P2, P3, P4)

2. Analiza moleculara a tulpinilor de HCV (Co, P1, P2, P3)

- evaluarea cantitativa a ARN HCV plasmatic (P1, P2, P3)

- optimizarea reactiei PCR in regiunile Core si NS5B si evaluarea sensibilitatii reactiilor PCR pt. detectarea infectiilor in faza de preconversie imunologica (Co)

- genotipare prin RFLP in 5’UTR si secventiere: core si NS5B (sisteme home-made)  (Co)

- genotipare cu kituri comerciale (P1) şi comparare cu genotiparea prin secvenţiere (P1, Co)

- analiza informatica a probelor secventiate: mutatii, recombinare, ORF decalat (Co)

- analiza moleculara a regiunilor genomice responsabile pentru rezultate indeterminate in diagnosticul serologic (design primeri, dezvoltarea si optimizarea reactiei PCR) (Co)

3. Epidemiologie moleculara (Co, P3)

- analiza filogenetica a secventelor obtinute pentru determinarea filiatiei cu tulpini din alte zone geografice si compararea datelor genetice cu datele clinice (Co)

- identificarea unor focare de infectie  si a cailor de transmitere (Co, P3, P4)

 Etapa III:  Analiza moleculara extinsa a regiunilor genomice core/core+1 in vederea dezvoltarii unui nou sistem de diagnostic serologic si a ameliorarii diagnosticului prin PCR  (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 1.12.07

Rezultate :

1. evaluarea prezentei proteinei core+1 la tulpinile din Romania, precum si la alte genotipuri/subtipuri decat 1a prin analiză informatică a secvenţelor

2. clonarea intregii regiuni genomice core si secventierea unui nr. mare de clone pt. evaluarea variabilitatii genomice a regiunii si a potentialului diagnostic al proteinei codificate in cadru de citire decalat (core+1) 

3. selectarea  unor regiuni din core+1 care sa constituie peptidele pe baza carora se va dezvolta sistemul ELISA

4. coroborarea datelor genomice cu datele clinice

 Activităţi:

1. completarea bancii de seruri – 600 de seruri (P2, P4, Co)

2. analiza moleculara a tulpinilor HCV (Co, P1, P2, P3)

- clonarea regiunii core/core+1 (Co)

- secventierea clonelor si a celorlalte regiuni amplificate prin PCR si analiza informatica a secventelor; evaluarea prezenţei core+1 la tulpinile HCV din România; analiza mutaţiilor şi  recombinării (Co)

- realizarea secventei consens pentru regiunea core/core+1, in vederea stabilirii peptidelor pentru detectia anticorpilor anti core+1 in sistem ELISA (Co)

3. epidemiologie moleculara (P1, Co)

- analiza filogenetica a secventelor obtinute in vederea stabilirii circulatiei in Romania a diferitelor genotipuri si variante virale si a surselor de infectie (P1, Co)

 Etapa IV: Analiza sistemului de diagnostic dezvoltat in regiunea core+1 (ELISA) si a sistemului de detectie in faza de preconversie prin PCR; estimarea unor sisteme terapeutice bazate pe core+1 (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 28.06.08

 Rezultate :

1. dezvoltarea unui sistem multicentric de testare a probelor in cadrul consortiului pentru evaluarea, standardizarea si testarea unui sistem de diagnostic home-made a anticorpilor anti core+1;

2. compararea rezultatelor cu sisteme comerciale de dgs. serologic si cu rezultate prin secventierea acelorasi tulpini;

Activităţi:

 1. dezvoltarea şi testare ELISA pentru core+1 cu seruri pozitive şi negative; determinarea sensibilităţii şi specificităţii  ELISA (Co, P1, P2, P3, P4)

- standardizarea si evaluarea reproductibilitatii noului sistem ELISA: comandarea peptidelor selectate din genotipul HCV1, fixarea pe plăci ELISA, identificarea concentraţiei optime a reactivilor  (P1, P2, P3, P4, Co)

2. compararea rezultatelor privind prezenta anticorpilor anti core+1 cu rezultatele serologice si moleculare obtinute pt. aceleasi probe (P1, P2, P3, P4, Co)

 Etapa V: Analiza sistemului de diagnostic dezvoltat si validarea rezultatelor prin comparatie cu testele standard de diagnostic; studii clinice (Co,P1, P2,P3, P4)

 Termen de realizare a etapei: 28.11.08

  Rezultate :

1. evaluarea sistemului de diagnostic precoce prin PCR şi a prezentei unor mutatii specifice pt. rezistenta la tratament sau pt. o anumita patologie, precum si a tulpinilor potential recombinante

2. compararea datelor de epidemiologie moleculara privind circulatia genotipurilor si a variantelor virale in Romania; stabilirea frecventelor de infectie si a cailor de transmitere.

Activităţi:

 1. evaluarea sistemelor moleculare dezvoltate pentru identificarea si caracterizarea unor noi subtipuri/variante HCV circulante (Co, P1, P3)

2. estimarea unor sisteme terapeutice bazate pe core+1; ex. ARN antisens, ARNi (Co, P1, P2, P3, P4)

3. definitivarea algoritmului de diagnostic (Co, P1, P2, P3, P4)

4. transfer tehnologic si de informatie  (Co, P1, P2, P3, P4)

    – stagiu de pregatire in institutia Co pentru insusirea metodologiei secventierii si analizei informatice a secventelor (P3)

    – realizarea unui workshop de tehnici moleculare in diagnosticul si monitorizarea infectiilor cu HCV (P3)

    – realizarea de materiale de popularizare despre riscurile si căile de transmitere a HCV (Co, P1, P2, P3, P4)

 REZULTATE

 In prima faza a proiectului s-au elaborat, cu concursul intregului consortiu, chestionarul asupra factorilor de risc asociati infectiei VHC si algoritmul de testare virusologica a probelor pentru selectia pacientilor. Detectia unei valori a raportului DO/CO mai mare de 3, obţinut la testul imunoenzimatic oferă informaţii valoroase in identificarea pacienţilor infecţioşi. Institutul de Virusologie (P1)  constată că o mai bună corelare a RT PCR şi WB a fost observată la pacienţii cu reactivitate mare în EIA (DO/CO > 3), cele două teste dând rezultate similare între ele la 90.2% dintre pacienti. Prin aplicarea chestionarului unor loturi reprezentative de pacienti de către P3 (UMF) s-au stabilit principalii factori de risc implicati in infectia VHC, contribuind astfel la constituirea unui lot bine standardizat de pacienti, la care partenerii au evaluat implicatia rezultatelor indeterminate in diagnosticul serologic al infectiilor cu HCV şi valoarea predictiva a testelor de confirmare pentru prezenta replicarii virale active. Spitalul V. Babeş (P2) a luat în studiu pacienţi cu urmatoarele date personale, clinice, epidemiologice: nr. stoc ser (pacienţi anonimi), data recoltării serului, regiune geografică, sex, vîrstă, mediu urban sau rural, antecedente personale fiziologice (naşteri, avorturi), antecedente personale patologice, puncţie hepatică, încărcare virala (IU-ml) înainte şi după tratament, stadiul bolii, coinfecţii cu alte virusuri, date epidemiologice (factori de risc), tratament. ISP Timişoara (P4) a trimis 100 seruri pozitive, pozitive cu dubla infectie sau cu rezultate indeterminate precum şi seruri negative (negative pentru orice fel de agent infecţios) pentru constituirea lotului martor. La unii pacienţi riscul de infecţie cu VHC se leagă de transfuzii sau tratamente chirurgicale dar şi de utilizare de droguri. In urma studiului molecular realizat în Institutul Cantacuzino a rezultat că subtipul HCV predominant este 1b. Pe lîngă acesta au mai fost identificate şi alte subtipuri cum este 1a, întîlnit mai ales la utilizatorii de droguri, 2a (în Republica Moldova) dar şi un subtip cunoscut ca fiind endemic în Egipt – 4a.           

 In etapa II, INCDMI Cantacuzino (Co) a proiectat doua sisteme de RT-PCR in regiunile core si NS5B si le-a optimizat. A realizat un screening pe serurile din colectia consortiului prin analiza moleculara in regiunea 5’UTR. Probele cu un profil RFLP care indica un alt genotip sau cu profiluri atipice au fost incluse in analiza moleculara prin cele doua sisteme de RT-PCR home-made (regiunea core si regiunea genomica a polimerazei virale – NS5B). Secventele obtinute au fost analizate cu diferite programe informatice pentru identificarea genotipului, a subtipului sau a variantelor virale. Prin aceleasi metode au fost comparate tulpinile de HCV izolate in Romania cu cele din alte regiuni geografice (secvente din bancile de date Los Alamos, EMBL). Secventele obtinute in regiunea core au fost introduse in banca de date EMBL/GenBank  cu numereIe de acces (AM114084 – AM114101 si AM422808 – AM422831). Institutul de Virusologie  „St S Nicolau” (P1) a evaluat retrospectiv seruri provenite de la pacienti HIV pozitivi, de la care existau date clinice, biochimice (transaminazele, bilirubina, albumina); imunologice (numarul de celule CD4 pozitive) si virusologice (markeri ai replicarii HIV).  Serurile au fost testate  pentru prezenţa markerilor moleculari de detectie a infectiei (COBAS Amplicor, Roche Diagnostics). Probele cu incarcare virala detectabila au fost supuse apoi genotiparii cu un kit comercial – Versant HCV Genotyping, Innogenetics. In Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale Dr. Victor Babes (P2) au fost investigate clinic, histologic si biologic 75 de cazuri cu istoric de infectie cu HCV (serologie de screening pozitiva confirmata prin RIBA). Serurile acestor cazuri au fost testate pentru prezenta ARN-HCV si au fost stocate in vederea constituirii colectiei pentru efectuarea studiilor serologice si de secventiere. A fost constituita o baza de date cu informatii epidemiologice si clinice de la cazurile selectate. UMF (P3) constata ca in lotul studiat pacienţii VHC pozitivi au în antecedente mai frecvent tratamente injectabile multiple, (61,54%), tratamente stomatologice invazive (74,35%) şi transfuzii de sânge (30,76%). Am observat si faptul că majoritatea pacienţilor infectaţi (85,6%) prezintă factori de risc intricaţi, cei mai mulţi asociind chiar trei sau patru factori, ceea ce indică faptul că în România numărul manevrelor parenterale înainte de anul 1989 era extrem de crescut. ISP Timişoara (P4)  a evaluat din punct de vedere serologic markerii pt infectia cu HBV (AgHBs, IgM-HBc, AcHBs), markeri pentru infectia cu HCV (AcHCV) si markeri pt infectia cu HIV (AcHIV).

In etapa III, INCDMI Cantacuzino (Co) a testat secventele din regiunea core (sistem in-house) pentru prezenta proteinei in ORF decalat core+1. A realizat clonarea integrala a genei codificatoare pentru capsida HCV – core din gentipul 4a, izolat in Romania, utilizand primeri situati in zonele adiacente core (5’UTR si E1) si sistemul de clonare TOPO TA Cloning. Au fost secventiate 12 clone (colonii albe) care contineau plasmidul vector pCR®II-TOPO®, cu insertul core, Atit secventele core scurte (de 300 pb) cit si secventele core integral au fost aliniate cu programul clustal W si analizate pentru evaluarea variabilitatii si a prezentei core+1 cu programul BioEdit. Atit secventele obtinute in zona RT-PCR in-house cit si core integral contin si proteina core in ORF decalat. Aceasta prezinta o variabilitate mult mai mare decit proteina codificata in cadru de citire normal. Clonele core sunt foarte asemanatoare intre ele dar nu identice, reflectind prezenta cvasispeciilor la acelasi pacient. Intre subtipurile genotipului 4, izolate in diferite zone geografice, exista diferente importante. De asemenea, secventele clonelor 4° sunt mai scurte (121 aa) decit ale altor subtipuri (4b, 4z si 4r). Din studiul filogenetic realizat de noi in doua zone genomice (regiunea capsidei si a polimerazei virale – NS5B) rezulta ca variantele virale din cadrul genotipurilor circulante la noi (1b, 1a, 3a si 4a) nu formeaza grupuri separate ci se grupeaza cu tulpini de referinta omologe sau se intercaleaza cu tulpini circulante din alte zona geografice.

Au fost selectate zece peptide care reprezinta epitopi imunodominanti pentru interactia virusului cu limfocitele T pentru a fi utilizate in sistem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core+1. Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale Dr. Victor Babes (P2) a investigat in un număr de 325 pacienţi infectaţi cu HCV sau expusi la HCV. Dintre aceştia, un total de 67 au fost recrutaţi in prezentul studiu, fiind completate chestionare si stocate eşantioane de ser in vederea investigării moleculare. In SVB s-a creat o baza de date si o colecţie de seruri, dintre care doar unele investigate complet din punct de vedere molecular (încărcătură virală HCV si subtip HCV).

In etapa IV in INCDMI Cantacuzino (Co) au fost selectate zece peptide care reprezinta epitopi imunodominanti pentru interactia virusului cu limfocitele T, pentru a fi utilizate in sistem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core (peptid 10) si anti-core+1 specifice pentru genotipurile circulante in Romania (peptidele 1-9). Sistemul ELISA a fost optimizat prin modificarea unor parametrii (cantitatea de peptid utilizata pentru peliculizarea pe placi, marca de placa, dilutiile optime de conjugat si serul de testat, tipul de blocant pentru situsurile nespecifice, timpul de stopare a reactiei, numarul de spalari, etc.). Serurile a doi pacienti (4843 – genotip 1b si 3162 – genotip 1a) au prezentat reactivitate incrucisata fata de 3 nonapeptide core+1 (peptid 4 – 1a; peptid 5 -1a; peptid 7 – 1b/4a). Probele pozitive pentru anticorpii core+1 au prezentat incarcaturi virale de 153.000 (Amplicor) (4843, genotip 1b,), respectiv 293 000 (3162, genotip 1a). Studiile cu noul sistem ELISA confirma prezenta anticorpilor core+1 in serul unor pacienti HCV pozitivi din Romania. Si Institutul de Virusologie „St S Nicolau” (P1) a participat la dezvoltarea şi testarea sistemului ELISA pentru core+1 cu seruri pozitive şi negative. Cele doua echipe au folosit aceleasi peptide dar reactivii ELISA au fost din surse diferite. Sistemul ELISA a fost optimizat prin modificarea unor parametrii (cantitatea de peptid utilizata pentru peliculizarea pe placi, marca de placa, dilutiile optime de conjugat si serul de testat, tipul de blocant pentru situsurile nespecifice, timpul de stopare a reactiei, numarul de spalari, etc.). Rezultatele indica prezenta anticorpilor core+1 in seruri HCV+. De asemenea, serurile net pozitive anti-core+1 prezinta reactivitate fata de toate peptidele testate.  Rezultatele obtinute indica prezenta anticorpilor anti-core+1 la pacientii HCV din Romania si permit validarea acestui sistem de diagnostic nou dezvoltat.

Etapa V. Sistemele de analizã şi genotipare dezvoltate în cadrul acestui proiect de INCDMI Cantacuzino (Co)  s-au dovedit a fi suficient de sensibile pentru identificarea corectã a genotipurilor, a subtipurilor şi a variantelor virale. Rezultatele discordante intre sistemul de genotipare prin RFLP in 5’NCR si secventierea in core, NS5B si HVR1 au condus la concluzia ca exista virusuri cu genom recombinat al caror potential virulent necesita investigatii suplimentare. Este una dintre putinele inregistrari privind recombinarea la HCV, cu posibil impact in evolutia bolii. Genotipul 1b este majoritar dar se constata o diversificare prin aparitia in circulatie a unor noi genotipuri (1a, 3a – legate de utilizarea drogurilor intravenoase si 4a, recunoscut ca fiind endemic in Egipt). Distanta genetică foarte mica între tulpinile româneşti 1a este un indicator al introducerii recente a acestui subtip în România şi circulaţia în populaţia de tineri care utilizează droguri injectabile. Sistemul de genotipare in 5’NCR, prin RFLP sau secventiere este mai putin rezolutiv pentru subtipare. Pentru acest lucru ca si pentru trasarea infectiilor este necesara secventirea unei regiuni cu variabilitate crescuta (ex. HVR1 sau NS5B). Analiza secventelor obtinute in core si NS5B a permis evidentierea unor markeri de rezistenta la tratament. Secventierea unor probe in regiunea hipervariabila 1 (HVR1) a identificat modificari de structura prin deletii sau insertii. Se poate specula ideea unei corelatii intre structura HVR si raspunsul la tratament deoarece tulpini fara modificari in HVR erau prezente numai la pacientii care au eliminat virusul (evaluare la 6 luni de la terminarea tratamentului). In Institutul de Virusologie „St S Nicolau” (P1) s-au realizat in paralel standardizarea si evaluarea reproductibilitatii unui protocol dotblot pentru peptidele VHC, cu peliculizarea peptidelor selectate din genotipul HCV1, fixarea pe membrana de nitroceluloza, identificarea reactivilor necesari si a concentratiei optime de utilizat in reactie. Se poate concluziona in aceasta etapa ca peptidul 10 / core reactioneaza bine cu anticorpii anticore totali din serul pacientilor infectati VHC, indiferent de genotipul implicat, peptidul 5/1a –  reactioneaza cu anticorpii anticore+1  din serul pacientilor infectati cu genotipul 1a VHC, iar peptidul 7 1b/4a reactioneaza cu anticorpii anticore+1 din serul pacientilor infectati cu genotipul 1b sau 4a. Tot in aceasta etapa in Institutul de Virusologie “St S Nicolau” s-au realizat standardizarea si evaluarea reproductibilitatii unui protocol ELISA de blocare pentru peptidele VHC, cu peliculizarea peptidelor selectate din genotipul HCV1 urmata de detectia spectrofotometrica a rezultatului blocarii. Distributia factorilor de risc pe genotipuri indica o prevalenta mare a manevrelor parenterale de tipul interventii chirurgicale, injectii,  manevre stomatologice şi transfuzii de sange la pacientii cu genotip 1b, spre deosebire de cei infectati cu genotipul 1a care in studiul nostru prezinta antecedente de administrare de droguri injectabile, tatuaj si piercing.

Comunicari stiintifice:

1. Echipa IVN. TESTS AND DIAGNOSIS DISCUSSION FOR CHRONIC HEPATITIS C – 2nd Conference of the Romanian Association of Medical Laboratories with International Participation Timisoara, 2006

2. A. Oprisoreanu, C. Szmal, V. Thiers, G. Oprisan. Comparative analysis of three different regions of hepatitis C virus for genotyping Romanian strains. 17th ECCMID / 25th ICC, Munchen, 31 martie-3 aprilie 2007. Poster

3. Simona Ruta. Actualitati in diagnosticul si monitorizarea infectiei cu VHC. UMF Carol Davila; Institutul de Virusologie “St. S. Nicolau” A XI-a Reuniune Anuală de Microbiologie, Mamaia, 24-26 mai 2007, pg.15

4. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Incarcarea virala, marker de prognostic in evolutia postterapeutica a infectiei VHC. Al III-lea Simpozion “Acad. Nicolae Cajal”, Bucuresti, 28-29 martie 2007, pg.56-57.

5. Oprisan Gabriela, Szmal Camelia, Oprisoreanu Ana-Maria, Dinu Sorin.  „Genotiparea virusului hepatitei C prin PCR-RFLP in 5’NCR si importanta pentru terapie” - Al 6-lea Congres National de Medicina de Laborator, Sibiu, 11 – 13 oct. 2007 – prezentare orala

6. Oprisan G, Oprisoreanu AM., Szmal C. “EVALUATION OF MOLECULAR TOOLS IN HEPATITIS C VIRUS EPIDEMIOLOGY ”, al V-lea Congres al Societatii Balkanice de Microbiologie, Budva, Muntenegru, 24-27.10.2007 – prezentare orala

7. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Paul Marinescu, Simona Ruta. Monitorizarea virusologica in cursul tratamentului hepatitei cronice C.  Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, D9, pg 100.

8. Loredana Manolescu, Camelia Sultana, Paul Marinescu, Simona Ruta. Evaluarea utilitatii clinice a metodelor de diagnostic in infectia VHC. Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, D8, pg 99.

9. Simona Ruta, Camelia Sultana, Loredana Manolescu,  Costin Cernescu. Impactul reconstructiei imune asupra evolutiei pacientilor coinfectati HIV-virusuri hepatitice. Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, B10, pg 90.

10. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, S. Ruta. Studii preliminare asupra genotipurilor VHC circulante in Romania. Simpozion “In memoriam Acad. Stefan S Nicolau”, Bucuresti, 5 noiembrie 2007, pg.2.

11. ISP Timisoara. Conferinţa Naţională de Sănătate Publică „Oportunităţi şi provocări în sănătatea publică, în contextul integrării României în UE”- Volum, 16-18 Noiembrie 2007, Timisoara

12. Gabriela Oprisan, Camelia Szmal, Sorin Dinu. “Sisteme de PCR in-house utilizabile pentru tipizarea tulpinilor de HCV”. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicolae Cajal”, 26-28 martie 2008, Bucuresti. Comunicare orala.

13. Sorin Dinu, Camelia Szmal, Claudiu Sbarcea, Emilia Lupulescu, Gabriela Oprisan. Evaluarea comparativa a trei tehnici  moleculare pentru analiza virusului hepatitei C. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicolae Cajal”, 26-28 martie 2008, Bucuresti. Poster.

14. G. Oprisan, C. Szmal, S. Dinu, A. Oprisoreanu, V. Thiers.  Molecular epidemiology of hepatitis C virus in Romania. Congresul European de Microbiologie Clinica ECCMID, 19-23 aprilie 2008, Barcelona, Spania. Poster.

15. Gabriela Oprişan, Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicatii în dezvoltarea unor sisteme de diagnostic.  Simpozionul National Viasan-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008. Comunicare orala.

16. Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu, Gabriela Oprişan si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Sisteme home-made pentru identificarea si caracterizarea moleculara a virusului hepatitei C. Simpozionul National Viasan-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008. Poster

17. S. Ruta, C. Sultana, L. Manolescu , G. Tardei, A. Motoc, D. Brehar- Cioflec, C. Szmal, S. Dinu, A.M. Oprisoreanu, G. Oprisan. The Changing Profile of Circulating HCV Genotypes in Romania. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008, 3189.

18. C. Sultana, L. Manolescu, S. Ruta, Evaluation of Early Predictors of Successful Therapy in HCV Infected Patients from Romania. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008,  4712

19. MLC Panait, Oprisoreanu AM, Szmal C, Negrea R, Codita I, Oprisan GR. Phylogenetic Analysis of a Hepatitis C Virus Nosocomial Outbreak. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008, .

20. C. Sultana; L.Manolescu; S. Ruta. Genetic diversity of hepatitis C virus: diagnostic implications. Al 7 lea Congres de Medicina de Laborator cu participare internationala, Bucharest; Romania 20-22 octombrie 2008.

21. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Strategii de optimizarea a raspunsului virusologic la tratament in hepatita  cronica C. A XII-a Conferinta de Nationala de Microbiologie cu participare internationala, 30 oct-2 nov 2008, Sibiu, Romania

Publicatii:

1. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruţă – S-AU MODIFICAT FACTORII DE RISC AI INFECŢIEI CU VIRUS HEPATITIC C ÎN ROMÂNIA? – Studii si cercetari de virusologie,  36/ 2006

2. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Corelatie intre aspectele histo-patologice si markeri biochimici utilizati pentru monitorizarea infectiei VHC sub tratament. – Studii si cercetari de virusologie, 37 (1), 2007

3. Brosura cu titlul: “Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicatii in dezvoltarea unor sisteme de diagnostic si terapeutice”

Gabriela Oprişan, Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu, Mircea Liviu Cătălin Panait (INCDMI Cantacuzino) si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Editura Universitara „Carol Davila”, ISBN nr. 978-973-708-350-0