Parteneriate in domenii prioritare , contract PAR 61/026

Titlul: Realizarea unui nou test tuberculinic cutanat pentru revelarea hipersensibilitatii de tip intirziat prin tehnologii avansate, cu utilizarea antigenelor recombinante specifice pentru diagnosticul tuberculozei latente si active

Coordonatorul proiectului: INCDMI Cantacuzino, Bucuresti, are experienta cea mai bogata in acest domeniu. Incepind din 1965, Institutul Cantacuzino produce PPD IC-65, reactiv biologic de uz uman, aprobat de Agentia Nationala a Medicamentului care este utilizat de intreaga retea nationala de penumoftiziologie.

Partenerul 1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, Bucuresti, coordoneaza reteaua de tuberculoza din Romania. Toti participantii la proiect au activitate in proiecte de colaborare internationale privind controlul si managementul tuberculozei.

Partenerul 2, Spitalul Clinic de Boli Infectioase si tropicale Victor Babes, Bucuresti, are cea mai mare competenta in domeniul clinic referitoare la infectiile HIV/SIDA asociate cu tuberculoza, la copii si la adulti.

Partenerul 3, Catedra de Microbiologie a Universitatii de Medicina si Farmacie Carol Davila, Bucuresti, are experienta practica si didactica in domeniul tuberculozei, a cercetarii si implementarii de proiecte la nivel national si international.

Proiectul se refera la realizarea unui nou test tuberculinic cutanat, un reactiv biologic, de uz uman, pentru evidentierea hipersensibilitatii de tip intirziat prin intradermoreactie ( IDR), pentru diagnosticul tuberculozei latente si active, aplicind tehologii avansate.

Obiectivul I : Prepararea PPD recombinant :

• cautarea secventelor de gene care codifica proteinele specifice doar pentru Mycobacterium tuberculosis;
• cultivarea M.tuberculosis H37Rv si M. bovis BCG;
• clonarea si supra-exprimarea proteinelor in E.coli ;
• purificarea proteinelor recombinante;
• formularea noului PPD

Etapa I: 15.09.2007- 15.12.2007

Activitatea I. Prepararea PPD recombinant (I)

• A fost efectuata documentarea referitoare la secventierea genelor codificatoare doar pentru proteinele specifice pentru M.tuberculosis ( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68)
• A fost initiata obtinerea unui PPD nedenaturat termic. La momentul raportarii, cultura de M.tuberculosis H37Rv pe mediul lichid Sauton, este incubata la 37 C.
• Cultivarea M.tuberculosis H37Rv (tulpina de referinta) si M.bovis BCG.                     Tulpinile, liofilizate, au fost cultivate pe mediul solid Lowenstein-Jensen, si incubate la 37ºC , 28 zile ( fiind lent crescatoare); au fost recoltate celulele bacteriene de M.tuberculosis H37Rv si M.bovis BCG crescute pe mediul Lowenstein-Jensen si au fost stocate la -80C; a fost initiata obtinerea  M.bovis BCG de pe suprafata mediului lichid Sauton. La momentul raportarii, cultura M.bovis BCG  era incubata la 37 ºC

.

Partnership in prioritary fields. contract PAR 61/026

Title : Development of a new reagent for TB skin testing, in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity by advanced technologies, using specific recombinant antigens for the diagnosis of latent and active tuberculosis

Project coordinator “Cantacuzino” Institute, Bucharest, possesses extensive experience in this field. Since 1965, PPD IC-65, biological reagent for human use, produced by “Cantacuzino” Institute, approved by National Agency of Drugs and it is used by all the medical and TB network.

Partner 1, “ Marius Nasta” Pneumophtisiology Institute, Bucharest, is dealing with TB network management in Romania. All the project participants are active in international collaborative research concerning TB control and management

Partner 2, „Dr. Victor Babes” Infectious and TropicalDiseasesClinicalHospital Bucharest, has the highest competence in the clinical field, of AIDS infections associated with tuberculosis, on children and adults.

Partner P3, Microbiology Chair of “Carol Davila “ University of Medicine and Pharmacy , Bucharest, has practical and teaching experience on TB, research and project implementation at national and international level.

The project deals with the development of a new reagent for tuberculosis (TB) skin test in order to emphasize the delayed-type hypersensitivity (DTH), applying advanced technologies.

Objective I. Preparation of recombinant PPD :

• Search for gene sequences coding for proteins specific only to Mycobacterium tuberculosis,
• culture of M.tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG,
• cloning and over-expression of proteins in E.coli,
• purification of recombinant proteins,
• new PPD formulation

Stage I. 15.09.2007- 15.12.2007

Activity I Preparation of recombinant PPD ( I)

• Documentation for gene sequences coding for proteins specific only to M. tuberculosis( ESAT-6, CFP-10, MPT64, PPE68) was performed.
• The preparation of PPD  from unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv was started. At the end of the first stage, the culture of M. tuberculosis H37Rv on Sauton medium, was incubated at 37 ºC.
• Culture of M. tuberculosis H37Rv (reference strain) and M. bovis BCG (Romanian “daughter” strain) was started. M. tuberculosis H37Rv and M. bovis BCG, freeze dried, were cultivated on solid Lowenstein-Jensen media, 28 days, at 37°C, being slow growers: the cells were stored at -80°C. M. bovis BCG culture on liquid Sauton medium was incubated at 37 ºC at the end of the first stage.

Etapa II : 15.12.07- 15.06.08

A fost continuat Obiectivul 1, prin:

Activitate I.2 continuare: Preparare PPD nedenaturat termic si obtinere corpi bacterieni din Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG si Activitate I.3  Clonarea si supra-exprimarea proteinelor existente doar in M. tuberculosis

Rezultate:

1. Testele de control (identificare, profilul biochimic si de contaminare bacteriana si fungica) au demonstrat puritatea si conformitatea culturilor de M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, subtulpina romaneasca.
2. Au fost preparate doua tipuri de PPD, PPD-ul obtinut din filtratul de cultura de M. tuberculosis H37Rv nedenaturat termic ( prin filtrare sterilizanta cu filtre cu diametrul porilor de 0.2 mµ) si PPD din filtratul culturii autoclavate de M. tuberculosis H37Rv.
3. Vectorii pET24a si pET28a au fost obtinuti ca stoc plasmidic folosind Qiagen Plasmid Maxi Kit.
4. Insertul (gena de interes) s-a obtinut prin amplificare enzimatica (PCR) folosind ca matrita ADN genomic preparat anterior si primerii (amorsele).
5. Testarea coloniilor care contin plasmidele corecte s-a facut prin miniprep si restrictie enzimatica sau prin PCR, folosind primeri complementari cu secvente din T7 Promotor si T7 Terminal. Pentru obtinerea plasmidelor prin miniprep s-a folosit kitul Qiagen (QIAprep).

Etapa III : 16.06.08-15.01.2009

A fost continuata prepararea PPD recombinant (2) si initiata realizarea obiectivului II al proiectului si anume:

Testarea in vivo a PPD recombinant (pe cobai si oameni, comparare cu PPD IC-65,de referinta si cu metoda cu IFN- γ).

In aceasta etapa, au fost prevazute urmatoarele activitati, care vor fi efectuate  pina la finalizarea proiectului:

Activitatea II.1. Testarea PPD recombinant pe cobai.

Activitatea II.2. Alegerea PPD recombinant cu un singur antigen sau cu un amestec multiantigenic.

Rezultate:

1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea proteinelor recombinante specifice M. tuberculosis, CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09). Continutul proteic al CFP10 purificat, determinat prin metoda Bradford, a fost de 0,41 mg/ml.

2.  Testarea pe cobai  a PPD r (CFP10) :

• Varianta 6, 500 UT/0,1 ml din PPD r (CFP 10 recombinant) ,a dat rezultatul cel mai bun. Dat fiind ca animalele imunizate raspund uneori aberant, cobaii sensibilizati cu 200 UT/ 0,1 ml, nu au prezentat nici o arie de eritem la PPDr, iar la cei sensibilizati cu 10 UT/0,1 ml, deci concentratia cea mai mica de proteina, aria de eritem a fost vizibila si potenta PPD r a reprezentat 31,26 % din aceea a PPD de referinta, IC 65 2 UT.
• Ca urmare a rezultatelor obtinute prin intradermoreactia la cele 6 variante de PPD recombinant , s-a initiat testarea hipersensibilitatii de tip intirziat pe 2 serii de cobai sensibilizati cu suspensii de M.tuberculosis si M.bovis BCG.
• Datele din literatura confirma faptul ca atunci cind se foloseste un singur antigen, chiar daca acesta este specific, intradermoreactia este mai slaba decit in cazul utilizarii unui amestec de mai multe antigene.

3.    In acest scop, in etapa III am inceput prepararea altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Etapa IV : 16.01.09- 15.12.09

Preparare PPD recombinant (2):

Activitate I.3 :Supraexprimare proteine specifice M. tuberculosis. Supraexprimare si extragere proteine recombinante

Activitate I.4 Purificarea proteinelor recombinante; Obtinere proteine recombinante purificate specifice

A fost continuata  activitatea, inceputa in etapa anterioara, de preparare a altor antigene recombinante, specifice pentru M.tuberculosis, utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Obiectivul prevazut a fi realizat de Partenerul 1, in colaborare cu Coordonatorul de proiect,  a fost Activitatea II.2 Alegere antigen sau amestec multi-antigenic (a). Participantii la realizarea proiectului, din partea Partenerului P1, Institutul de Pneumoftiziologie Marius Nasta, au colaborat la studiile premergatoare, care trebuie efectuate vederea testarii unui PPD recombinant.

Rezultate:

1.  A fost realizata supraexpresia si extragerea unei proteine recombinante specifice M. tuberculosis , MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), utilizind plasmidele recombinante  primite de la Universitatea din Colorado, in cadrul TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64.

Din 500 ml cultura E.coli, s-au obtinut 97 mg proteina totala solubila si 0,8 mg MPT 64 purificat.

2.  Testarea pe cobai  a PPD r.

• In 3/4 experiente, CFP 10 a fost specific.
• In 2/4 experiente ESAT 6 a fost specific.
• In 2/3 experiente MPT 64 nu a fost specific.
• In viitoarea serie de experiente, dupa ce se imunizeaza cobaii cu M. tuberculosis si Mycobacterium bovis BCG, dupa 6-7 saptamini, trebuie testat un nr minim de cobai/antigen recombinant, iar in saptamina urmatoare se va face testarea pe un numar semnificativ.

3. Au fost stabilite conditiile de testare comparativa a PPD IC-65 fata de etalonul international OMS, si anume PPD RT 23, 2 UT, produs de Staatens Serum Institut, Copenhaga, Danemarca, la copii cu tuberculoza.

In urma calculelor statistice,se poate trage concluzia ca dimensiunile reactiilor locale in cazul Seriei experimentale  09-02 TC, 2 UT/ 0,1 ml pot fi   considerate ca fiind echivalente cu cele produse de  tuberculina de referinta, PPD RT 23, 2 UT.

Stage II. 15.12.2007 – 15.06.2008

The Objective I was pursued, by

Activity I.2. Preparation of non-thermally denaturated PPD and obtention of bacterial cells from Mycobacterium tuberculosis H37Rv si Mycobacterium bovis BCG

Activity I.3. Cloning and overexpression of proteins uniques for M. tuberculosis

Results

1. Control assays (identification, biochemical profile, bacterian and fungical contamination) proved the purity and conformity of M. tuberculosis H37Rv, M. H37Ra si M.bovis BCG, Romanian sub-strain.

2. Two PPDs were prepared : PPD from the unheated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv (by sterilization through filters with 0.2 mµ pore size) and  PPD from heated culture filtrate of M. tuberculosis H37Rv.

3. The plasmids pET24a and pET28a were obtained using Qiagen Plasmid Maxi Kit.

4.The insert  was obtained by enzymatic amplification ( PCR) using as matrix the genomic DNA , previously prepared and the primers.

5. The screening of plasmid containing colonies was performed by miniprep and enzymatic restriction or PCR, using  complementary primers with T7 Promotor and T7 Terminal sequences. Qiagen (QIAprep) kit was utilized in order to obtain the plasmids by miniprep.

Stage III : 16.06.08-15.01.2009

Recombinant PPD preparation (2) was continued and initialized the  Objective II, namely:

In vivo testing of recombinant PPD (on guinea pigs, human, comparison with reference PPD IC-65 and IFN- _ assays)

The following activities, from this point till the completion of the project, were planned:

Activity II.1 Testing of recombinant PPD on guinea pigs

Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD

Results.

1. The overexpression and extraction of M. tuberculosis , CFP10 (10 kDa culture filtrate antigen esxB / ESAT-6-like protein; gena: esxB / cfp10 / lhp / mtsA10 / Rv3874 / MT3988 / MTV027.09) specific recombinant proteins was performed. The protein content of purified CFP10, determined by Bradford assay , was 0.41 mg/ml.

2. PPDr ( CFP 10) guinea pigs testing

• 500 UT / 0.1 ml PPDr concentration  proveded the best result. Because sometimes the animals gave an abherant response, the 200 UT/0.1 ml sensitized guinea pigs, didn`t present any eritem area when PPDr was injected, while on those sensitized with 10 UT/0.1 ml, the lowest protein concentration, the eritem area was visible and PPDr potency represented 31.26 % from that of the reference PPD, IC 65 , 2 UT/0.1ml.
• Due to skin test results obtained with 6 different PPDr ( single or cocktails of recombinant antigens), the delayed type  hypersensitivity  was initiated, on two guinea pigs groups, immunized with M.tuberculosis and M.bovis BCG.
• Published data confirm the fact the, when using a single antigen, even if it is specific, the skin test is weaker then when using a multi-antigenic cocktail.

3. Therefore, in stage III, we started preparing other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

Stage IV : 16.01.09- 15.12.09

Preparation of recombinant PPD (2)

Activity I.3. Overexpression and extraction of recombinant proteins, uniques for M. tuberculosis

Activity I.4. Purification of specific recombinant proteins

We continued the preparation of  other recombinant antigens, specific for M.tuberculosis, using recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, pMRLB46/Rv 3874/ CFP10 si pMRLB7/Rv3875/Esat6.

The Objective, planned to be performed by Partner 1, in collaboration with Project coordinator, was Activity II. 2. Choosing the recombinant single antigen or multi-antigen cocktail PPD (a). The participants, from Partner P1, Marius Nasta Pneumophtisiology Institute, collaborated to the mandatory studies, in order to test a recombinant PPD.

Results

1. The overexpression and extraction of a specific M. tuberculosis recombinant  protein, MPT 64 (Immunogenic / secreted protein MPB64 / MPT64; gena: mpt64 / Rv1980c / MT2032 / MTCY39.39), using the recombinant plasmids received from Colorado University, as part of TB Contract and research materials: pMRLB12/Rv1980c/Mpt64, was accomplished.

97 mg of soluble total protein and 0,8 mg purified MPT 64 were obtained from 500 ml E.coli culture.

2.  PPDr guinea pigs testing

• In 3 out of 4 experiments, CFP10, proved to be specific.
• In 2 out of 4 experiments, ESAT 6, proved to be specific.
• In 2 out of 3 experiments, MPT 64, proved not to be specific.
• For the next series of experiments, 6-7 weeks after the guinea pigs immunization with M. tuberculosis and M. bovis BCG, a low number of animals/ recombinant antigen must be tested, followed by a next week testing on a significant number of animals

3. The conditions for comparative testing of PPD IC 65 against the WHO international tuberculin standard, PPD RT23, 2 TU/0.1ml, produced by Staatens Serum Institut, Copenhaga, Denmark, on children with tuberculosis,   were established.

Following statistic calculations, the conclusion was that tuberculin skin test reactions for experimental series 09-02 TC, 2 TU/ 0.1 ml could be equivalated with those evidentiated  by reference tuberculin, PPD RT23, 2 TU/0.1ml.

Acronim: HMGB

Titlu:

NOI COMPUSI NATURALI IMPLICATI IN MODULAREA ACTIVITATII HMGB-1, CITOKINA PROINFLAMATOARE TINTA IN TRATAMENTUL SOCULUI SEPTIC SI IN TERAPIA BOLILOR NEOPLAZICE MALIGNE

Director Proiect: Dr. Lidia Cremer

Proiectul este coordonat de Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

Parteneri :

1. Donatur GmbH, Germania (partener extern)
2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica, Bucuresti
3. Universitatea de Medicina din Craiova
4. Universitatea “Titu Maiorescu”, Bucuresti
5. 
   

Partenerul extern (Donatur GmbH din München, Germania) este o firma cu o experienta profesionala foarte vasta in izolarea si caracterizarea unor noi substante medicamentoase din extracte naturale.

Rezumatul proiectului:

Socul septic este un proces inflamator sistemic indus de infectii bacteriene severe. Mortalitatea mare este determinata in parte de endotoxine si de alte componente bacteriene, care prin activarea monocitelor, macrofagelor produc citokine proinflamatoare precum factorul de necroza tumorala-a (TNF-a), interleukina-1b (IL-1b), interleukina-23 (IL-23), dar si radicali toxici de oxigen sau azot, High-Mobility-Group Box-1 (HMGB-1) sau alti mediatori ai inflamatiei. HMGB-1 este o proteina cromozomiala, abundenta, conservata, fiind atat un factor de transcriere cat si o citokina intracelulara cu activitate proinflamatoare. Ipoteza ca HMGB-1 are un rol decisiv atat in socul septic cat si in alte procese inflamatoare cronice (artrita reumatoida) a fost confirmata de concentratia puternic crescuta a acestei citokine. Observatiile experimentale au relevat ca inhibarea activitatii HMGB-1 sau blocarea secretiei ei extracelulare este benefica pentru tratarea socului septic sever si a artritei reumatoide.

In ultimii ani au fost cercetate mecanismele moleculare prin care HMGB-1 participa la inducerea si evolutia socului septic, inclusiv la instalarea starii de sepsis si moarte. Cercetari mai recente au evidentiat faptul ca in socul endotoxic produs la animale se remarca in primele ore o crestere brusca a exprimarii citokinelor proinflamatoare (TNF-α sau IL-2), pe cand concentratia de HMGB-1 creste abia dupa 24 de ore si este maxima la 36 de ore cand se instaleaza faza de sepsis. Rezultatele slabe in tratarea socului septic cu  anticorpi anti-TNFα, respectiv cu receptor pentru IL-2 (IL-2R) au confirmat ipoteza ca blocarea actiunii acestor citokine proinflamatoare nu este o tinta decisiva. Astfel, atentia celor care cauta remediu pentru socul septic s-a orientat asupra HMGB-1, un posibil factor decisiv in “inflammatory over-reaction” a sistemului imun cu consecinte patologice dramatice.

O alternativa promitatoare pentru terapia socului septic sau a inflamatiei cronice (ex. artrita reumatoidă) ar fi găsirea unor produşi naturali capabili să moduleze exprimarea, transportul membranar, respectiv actiunea HMGB-1. Avantajul substantelor naturale mici in comparatie cu anticorpii monoclonali este evidentă, deoarece eficienta proteinelor monoclonale este limitata in timp din cauza formarii de anti-anticorpi, precum si din cauza altor efecte secundare alarmante. Identificarea unor substante naturale noi obtinute din plante, organisme marine sau surse bacteriene si obtinerea lor pe scara mai mare este o problema dificila, cu solutii diferentiate in fiecare caz. Autoritatile de omologare a medicamentelor au pretentii foarte exigente pentru validarea procesului tehnologic de obtinere, pentru controlul analitic al continutului, pentru dozarea sensibila a impuritatilor si limitarea stricta a tuturor acestora. Rezolvarea acestor probleme complexe conform prescriptiilor Agentiei Europene de Medicamente (EMEA) este o tinta cheie a prezentului proiect, in vederea asigurarii reproductibilitatii rezultatelor ce urmeaza a fi obtinute.

Pe de alta parte, s-a demostrat că in cazul bolilor neoplazice maligne, eliberarea proteinei HMGB-1 de catre celulele transformate malign este obligatorie pentru activarea celulelor dendritice ale gazdei, in vederea procesarii si prezentarii antigenelor tumorale. S-a evidentiat faptul că HMGB-1 interactioneaza cu receptorii Toll-like-4 (TLR-4) de pe celulele dendritice, care sunt implicati selectiv in activarea limfocitelor T antitumorale in vivo. In privinta corelatiei dintre raspunsul la chimioterapie si expresia HMGB-1, s-a demonstrat recent că celulele maligne HMGB-1 negative („deficiente”) sunt de 3-10 ori mai rezistente la acţiunea chimioterapicelor, comparativ cu celulele maligne pozitive pentru HMGB-1. Celulele HMGB-1 deficiente se caracterizeaza prin compromiterea inhibarii ciclului celular si prin reducerea activarii caspazelor. Aceste date au impus HMGB-1 ca proteina tinta pentru modularea chimioterapiei.

Datele de literatura relatate mai sus au determinat elaborarea propunerii acestui proiect de cercetare care va urmari:

-          identificarea şi tehnologia de obţinere a unor compusi naturali obtinuti din plante care, prin modularea activitaţii sau prin inhibarea eliberării extracelulare a HMGB-1, ar deveni o opţiune terapeutică pentru socul septic sever sau pentru posologii in inflamatii acute sau cronice;

-          identificarea unor compusi obtinuti din extracte bacteriene, compusi cu  acţiune de agonist ai TLR, cu capacitate de a eficientiza chimio- si radioterapia bolilor tumorale.

Rezultatele stiintifice obtinute vor constitui baza dezvoltarii unor biotehnologii performante in domeniul produselor naturale bioactive, in scopul obtinerii de bioproduse de inalta selectivitate.

Obiectivele generale ale proiectului vizeaza dezvoltarea de terapii medicale şi eficientizarea sistemului de sănătate publică si urmaresc:

-       izolarea prin biotehnologie extractiva de noi compusi naturali capabili sa moduleze producerea sau inhibarea HMGB-1 de catre celulele mieloide sau tumorale;

-       identificarea si obtinerea prin tehnologiile elaborate a unor compusi naturali cu potential de utilizare ca medicamente cu actiune antiinfectioasa, antiiflamatoare sau antitumorala.

Obiective specifice ale proiectului:

1. I.      Adaptarea unor tehnologii pentru obtinerea din extracte de plante sau bacteriene a unor compusi naturali cu activitate de modulare a producerii HMGB-1;
2. II.      Caracterizarea analitica a fractiunilor si/sau a compusilor naturali obtinuti;
3. III.      Elaborarea de modele experimentale in vivo si in vitro si aplicarea acestora in vederea caracterizarii fractiunilor si/sau compuslor naturali obtinuti, ca agenti antiinfectiosi, antiinflamatori sau antitumorali;
4. IV.      Obtinerea de fractiuni sau compusi naturali adecvati unor teste farmacologice si efectuarea acestor teste; elaborarea tehnologiei de obtinere la nivel de laborator a unui compus natural promitator.

Etapa I (raportare 6 februarie 2009): Analizarea tehnologiilor  de  obtinere  si  a  metodelor

de testare a extractelor de plante sau bacteriene cu capacitate de modulare a producerii HMGB-1

Rezumatul Etapei 1:

In prima etapa de derulare a proiectului de cercetare s-au realizat studii documentare privind modelele experimentale in vitro si in vivo aplicabile pentru evidentierea activitatilor imunologice si farmacologice ale extractelor de plante, potential utilizabile in tratamentul antiinflamator, cel al socului septic sau in chimio si radioterapia bolilor neoplazice maligne.

Pentru identificarea extractelor naturale cu prezumtiva actiune de modulare a factorului HMG1, au fost alese cateva plante care au actiune antiinflamatoare confirmata de date farmacologice si imuno-farmacologice controlate.

S-a procedat la prepararea unor extracte primare, fractionarea lor prin extractii selective, apoi caracterizarea compozitiei extractelor.

In vederea studierii activitatii antiinflamatoare si/sau imunomodulatoare a compusilor izolati, au fost selectate si precizate urmatoarele modele experimentale in vitro si in vivo:

- stimularea monocitelor/macrofagelor umane cu LPS la nivel de TLR-4 si cuantificarea expresiei Dectin-1 prin tehnica citometriei in flux;

- modularea producerii de TNFa si NO in macrofage murine activate la nivel de TLR-4;

- testarea capacitatii antioxidante si modularea producerii speciilor reactive de oxigen din macrofage murine si celule polimorfonucleare umane;

- modularea producerii de citokine in vitro (TNFa, IL-10, IL-12p40 etc) de catre macrofage murine si celule PMN umane activate la nivelul receptorilor TLR si Dectin-1;

- modularea socului endotoxic in vivo (soareci Balb/c);

- modularea secretiei extracelulare a HMGB-1 din celule mieloide activate;

- inhibarea cresterii celulelor tumorale utilizand modele experimentale in vitro si in vivo;

Pentru studierea activitatii farmacologice, au fost elaborate si precizate urmatoarele modele experimentale in vivo:

- peritonita septica indusa prin ligaturarea si perforarea cecului;

- metode farmacologice de testare a activitatii antiinflamatorii: modelul edemului urechii de soarece sau sobolan; modelul edemului labei de sobolan (prin diferiti agenti iritanti).

Oiectivele primei etape de executie a proiectului au fost realizate in intregime, ceea ce va permite ca in final sa putem identifica compusi antiinflamatori eficienti.

Etapa 2 (raportare 15 decembrie 2009): Obtinerea de substante active, caracterizarea capacitatii lor antiinflamatoare si de ameliorare a socului septic

Rezumatul Etapei 2:

In a doua etapa de derulare a proiectului de cercetare au fost purificate o serie de extracte naturale si s-au realizat studii privind capacitatea antioxidanta a acestora si potentialul lor de a inhiba SRO si NO.

Utilizand metode cromatografice performante (HPFC, HPLC preparativa), partenerul Donatur GmbH a obtinut extracte naturale pe care le-a testat din punct de vedere al activitatii lor biologice. Unele dintre acestea au inhibat semnificativ maturarea celulelor dendritice in vitro, proliferarea limfocitelor T alogenice, dovedind astfel posibila eficacitate in boli autoimune. Dintre fractiunile cu efect de suprimare a maturarii celulalor dendritice, unele s-au dovedit toxice. Examinarea influentei extractelor purificate analizate asupra ATP-azei de sodiu/potasiu, respectiv de calciu, a dovedit ca actiunea lor asupra ATP-azelor de ioni alcalini are o semnificatie redusa.

Sase extracte izolate si purificate de catre partenerul Donatur GmbH au fost investigate in cadrul Laboratorului Imunomodulare in ceea ce priveste capacitatea antioxidanta si potentialul de a inhiba SRO si NO.

Utilizand modele experimentale atat in sistem acelular (ORAC, capacitatea antioxidanta totala, Griess acelular), cat si in sistem celular (chemiluminometrie cu luminol) s-a demonstrat ca:

- Extractul purificat MCS A213 (1, 5 si 10μg) este un potential epurator al radicalilor de oxigen;

- Extractele MCS Db213, MCS De213, OCS CD154 si OCS D155 manifesta proprietati imunomodulatorii;

- MCS Ab213 reprezinta un potential agent terapeutic antiinflamator, scazand (dependent de doza) productia de SRO in celule PMN umane nestimulate sau stimulate cu Pam3Cys;

- Compusii testati nu si-au dovedit calitati de epuratori ai speciilor reactive de azot.

Consideram ca prin aplicarea modelelor experimentale elaborate si precizate in aceasta faza de derulare a proiectului se vor putea selecta compusi bioactivi eficienti in tratamentul proceselor inflamatorii, in special cronice, stiut fiind ca acestea favorizeaza dezvoltarea bolilor neoplazice maligne.

Titlul proiectului: Markeri moleculari utili in diagnosticul si epidemiologia  toxiinfectiilor alimentare produse de bacilli gram negativi

Acronim: TIAGEN

Rezumat

In ciuda progreselor evidente inregistrate in ultimul timp atat in domeniul medical cat si in cel al tehnologiilor alimentare, toxiinfectiile alimentare (TIA), definite ca boli consecutive consumului de alimente sau apa contaminata, continua sa reprezinte o problema de sanatate publica majora. Se cunosc mai mult de 250 tipuri de toxiinfectii alimentare, multe dintre acestea fiind determinate de toxine sau diferite substante chimice periculoase care contamineaza alimentele. Microorganismele sau toxinele elaborate de acestea reprezinta o amenintare pentru sanatatea publica datorita ratei inalte de multiplicare a acestora si cailor multiple de raspandire.

Daca pentru toxiinfectiile produse de agenti bacterieni cu patogenitate recunoscuta (Salmonella, Shigella, etc) metodologiile de diagnostic sunt clare si dau rezultate specifice, selective si reproductibile, nu acelasi lucru se poate spune despre diagnosticul toxiinfectiilor alimentare determinate de agenti bacterieni pana nu demult nerepertoriati ca patogeni (patotipuri enterice de E. coli si in special patotipul emergent VTEC) sau bacterii greu/dificil cultivabile (Campylobacter, forme viabile dar noncultivabile a patogenilor recunoscuti-VBNC).

Proiectul isi propune o evaluare a metodelor clasice utilizate in laboratorul de microbiologie si fundamentarea necesitatii introducerii metodelor moleculare pentru diagnosticul de laborator si epidemiologia toxiinfectiilor alimentare produse de bacili gram negativi. Rezultatele obtinute vor fi analizate in consortiu alcatuit din cercetatori din domeniul academic, cercetare fundamentala si aplicativa, medici specialisti in boli infectioase si epidemiologi, in vederea elaborarii unui ghid national privind diagnosticul si epidemiologia acestor imbolnaviri.

Probele patologice/tulpinile izolate si caracterizate prin metode clasice in laboratorul clinic al partenerului 2 vor fi expediate coordonatorului pentru analiza moleculara. Se va utiliza tehnica PCR pentru detectarea unor structuri genetice specie specifice, precum si gene responsabile pentru sinteza factorilor de virulenta bacteriana. Metodele moleculare, optimizate pe tulpini izolate si caracterizate, vor fi utilizate pentru diagnostic direct in produsul patologic. Va creste in felul acesta operativitatea in focar ca urmare a rapiditatii raspunsului, dar mai ales va creste specificitatea in cazul infectiilor datorate agentilor bacterieni conditionat patogeni, greu cultivabili sau noncultivabili.

Activitatea multidisciplinara, integrata si colaborativa a colectivului de cercetatori si specialisti din domeniul bolilor infectioase, dezvoltarea unui sistem bazat pe activitate de laborator microbiologic si introducerea metodelor genetice de diagnostic si analiza epidemiologica vor conduce la dezvoltarea unui algoritm de prevenire si control al toxiinfectiilor alimentare cu bacili gram negativi. Activitatea se inscrie in strategia de lucru a Centrului European de Prevenire si Control al Bolilor Transmisibile (ECDC) privind sporirea rolului laboratorului in controlul bolilor infectioase si introducerea metodelor de microbiologie moleculara in diagnosticul si epidemiologia acestora. Implementarea rezultatelor stiintifice ale studiului de fata in practica medicala va contribui la cresterea competitivitatii in cadrul largit al ECDC in care Romania este parte integrata.

Obiectivele generale si rezultate estimate

Obiectivul general al proiectului consta in optimizarea metodelor de diagnostic microbiologic al toxiinfectiilor alimentare in vederea participarii eficiente a laboratorului la activitatea de supraveghere si control a acestui tip de imbolnaviri.

Obiectivele specifice ale proiectului constau in:

1. Realizarea masei critice de cercetatori implicati in studiul unor boli transmisibile prioritare pentru Romania si Europa in contextul globalizarii circulatiei si comertului cu produse alimentare
2. Optimizarea supravegherii cu laboratorul a toxiinfectiilor alimentare in vederea operativitatii raspunsului in focar
3. Cresterea calitatii actului medical prin reducerea numarului de raportari de „boala diareica cu agent etiologic necunoscut”
4. Armonizarea metodelor de lucru cu cele la nivel european in conformitate cu recomandarile ECDC
5. Cresterea competitivitatii in cadrul grupului de lucru „wood and water diseases (FWD)organizat la nivelul ECDC

Institutia coordonatoare

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino”

Director de proiect: Maria Damian, CS I, mdamian@cantacuzino.ro

Splaiul Independentei 103, Sector 5 Bucuresti

Tel: +4021.5287276

Fax: +4021. 5287305

www.cantacuzino.ro

e-mail: office@cantacuzino.ro

Componenta consortiului

Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” Bucuresti

Responsabil stiintific: Prof. Dr. Marian Negut, mnegut@cantacuzino.ro

www.univermed-cdgm.ro

Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale “Dr. Victor Babes”, Bucuresti

Responsabil stiintific: Dr. Maria Nica, nicamaria_lab@yahoo.com

www.spitalulbabes.ro

Autoritatea contractanta

Centrul National de Management Programe

www.cnmp.ro

Durata proiectului: 2007-2011

Responsabilitatile aferente fiecarui participant (vezi „Planul de realizare al proiectului”)

Bugetul proiectului: 1900000 lei (vezi „Informatii financiare despre proiect”)

Publicatii (vezi lista de publicatii)

Manifestari stiintifice (vezi lista manifestarilor stiintifice)

Reuniuni ale partenerilor

1. 10.12.2008: Reuniune pentru lansarea proiectului

Participanti: Responsabilii stiintifici impreuna cu echipa de lucru a fiecarui partener implicat in proiect

Subiecte dezbatute:

1. prezentarea participantilor
2. discutarea planului de realizare al proiectului
3. prezentarea, de catre responsabilii stiintifici ai partenerilor, a activitatilor care urmeaza a fi derulate in etapa 1
4. discutarea modalitatilor operationale pentru realizarea activitatilor propuse
5. termene de realizare
6. discutarea bugetului alocat pe parteneri si categorii de cheltuieli

Lista de publicatii / comunicari stiintifice

1. Buiuc D, Neguţ M – Tratat de microbiologie clinică, ed.a 3-a, Ed. Medicală, 2009.
2. Maria Damian, Dorina Tatu-Chiþoiu, Codruta-Romanita Usein, Gabriela Oprisan,

Andi-Marian Palade, Sorin Dinu, Camelia Szmal, Simona Adriana Ciontea, Stefania Ceciu, Maria Condei, Ana Persu, Anda Bãicus, Mariana Pop, Ionela Neagoe, Dan Steriu, Radu Codreanu, Marian Graur, Michaela Carmen Cretu, Suzana Cilievici, Maria Nica, Alexandru Ecovoiu and Lucian Gavrilã. Laboratory diagnosis of infectious diarrhoea syndrome; a three years study in two hospitals of infectious diseases. Rom Arch. Microbiol Immunol, 2:89-94, 2009.

3. Maria Damian. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a bolilor infectioase. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009;

152.

4.  Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian Negut. Metode moleculare utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a patogenilor enterici. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, ed III, 2009.

5. Maria Damian, Andi Palade, Madalina Baltoiu, Codruta-Romanita Usein, Simona Ciontea, Stefania Ceciu, Lavinia Zota si Dorina Tatu-Chitoiu. “Laboratory investigation of Salmonella strains isolated from foodborne outbreaks occured during the last six months in Romania”. Workshop “Intersectoral collaboration for detection, surveillance and response to foodborne diseases” , Polonia, Zegze, 25-28 Mai 2009.

Documente:

• Anexa I-Informatii financiare despre proiect-act aditional 4
• Plan de realizare-act aditional 4

Proiect 61-021

Acronim: TORULARHODIN

 

Elaborarea biotehnologiilor avansate de preparare a produselor farmaceutice antioxidante cu torularhodină şi studiul potenţialelor aplicaţii terapeutice

 

Director Proiect: Dr. Aurora Salageanu

 

Parteneri :

1. Universitatea POLITEHNICA Bucuresti-Departamentul de Bioinginerie si Biotehnologie
2. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica
3. Universitatea de Stiinte Agronomice si Medicinã Veterinara-Bucuresti

Obiectivul proiectului este elaborarea unei biotehnologii inovative de laborator pentru obţinerea bioproduselor antioxidante cu torularhodină şi stabilirea soluţiilor de valorificare în terapie.

• INCDMI “Cantacuzino” va elabora metodologia de caracterizare fizico-chimică şi biologică a proprietăţilor antioxidante ale preparatelor cu torularhodină, sistemul de testare a activităţii biologice, va participa la realizarea sistemelor de bioprocesare discontinuă şi fed-batch, va studia soluţiile potentiale de valorificare în terapie şi va asigura coordonarea cercetărilor în calitate de conducător de proiect.
• UPB-Departamentul de Bioinginerie şi Biotehnologie va coordona în principal studiile tehnologice de bioprocesare, va participa la elaborarea metodologiei de control a calităţii pe ansamblul operaţiilor din fluxul productiv şi la selecţia şi optimizarea tehnicii de separare a bioproduşilor, va realiza sinteza modelului productiv, şi va elabora manualul de diseminare a rezultatelor, care va fi folosit în procesul educativ şi de formare profesională.
• INCD Chimico-Farmceutice va realiza selecţia tulpinilor microbiene producătoare de torularhodină şi ameliorarea potenţialului productiv prin tehnici genetice, va elabora metodele de identificare şi determinare cantitativă a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi, va studia metodologia de management de calitate, va colabora la cercetarea bioprocesării şi la elaborarea metodologiei de separare a bioproduşilor.
• USAMV Bucureşti-Facultatea de Biotehnologie va studia extracţia bioproduşilor cu fluide critice, va realiza sinteza modelului de separare a torularhodinei şi pigmenţilor asociaţi şi va participa la optimizarea formulei mediului de cultură.

Etapa I (raportare 15 decembrie 2007): Studiul metodelor de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode analitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor

 

În cadrul lucrărilor aferente acestei etape a fost realizat un studiu şi o analiză a datelor de literatură în urma cărora s-a ajuns la următoarele concluzii :

 

• Cercetările au demonstrat că torularhodina şi pigmenţii carotenoizi asociaţi-torulena şi beta-carotenul sunt biosintetizaţi în special de drojdii din genurile Rhodotorula şi Sporobolomyces şi altele înrudite, drojdiile roz-roşii, care formează aceşti pigmenţi ca metaboliţi secundari cu rol de protecţie faţă de factori de mediu, în special lumina.
• Aplicaţiile actuale de interes ale acestor pigmenţi s-au extins mult dincolo de rolul de coloranţi şi provitamina A, în special în cazul torularhodinei demonstrându-se reale proprietăţi ca antioxidant, ceea ce îi conferă o activitate biologică cu rol în terapia bolilor ce au la bază mecanisme de declanşare şi evoluţie legate de efectul distructiv al radicalilor liberi şi al speciilor oxigen active.
• Analiza factorilor de mediu care influenţează biosinteza torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi a demonstrat că formarea acestor bioproduse depinde puternic de condiţiile de cultivare ale drojdiilor capabile de carotenogeneză: de temperatură, pH, prezenţa luminii, nivelul aeraţiei, prezenţa unor molecule cu rol în formarea speciilor oxigen active sau a radicalilor liberi, compoziţia mediului de cultură.
• Descifrarea căilor metabolice de formare a permis studiul aprofundat al acestor factori de influenţă în conexiune cu metabolismul şi stabilirea unor metode de modificare genetică a tulpinilor productive pentru creşterea potenţialului de biosinteză a torularhodinei.
• Pentru realizarea unei tehnologii de producţie de interes economic se recomandă folosirea unor surse ieftine de C, de obicei subproduse de la agricultură.
• Au fost efectuate studii experimentale privind metodele de obţinere a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi în drojdii şi stabilirea setului de metode anlitice necesare pentru caracterizarea fizico-chimică a bioproduşilor. Rezultatele acestor studii au condus la acumularea de date importante referitoare la comportamentul microorganismelor testate în condiţiile prestabilite, date care vor contribui la selecţia finală a microrganismului cu care se vor efectua, în fazele următoare, studiile de biosinteză şi extracţie a pigmenţilor carotenoidici.

 

Etapa II (raportare 15 decembrie 2008): Elaborarea biotehnologiei de formare torularhodină si pigmenti asociati în drojdiile din genurile Rhodotorula si Sporobolomyces

In urma efectuarii lucrarilor de cercetare aferente fazei a II-a au fost obtinute urmatoarele rezultate:

• In baza studiului de literatura, in lucrarile de mutageneza efectuate asupra tulpinii Rhodotorula rubra ICCF 209 (IC 120, IMF R7) a fost utilizat agentul mutagen alchilant N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG), in doza de 2 mg/ml si timp total de actiune 30 minute si o ora. Dispersiile dilutiilor zecimale seriate in placi Petri au dus la selectionarea de pe mediul Bacto-Wortagar (BW) a unor colonii pigmentate in mov-negru, a caror carotenogeneza, cu etapa finala biosinteza torularhodinului, este favorizata de prezenta in mediu a glicerolului. Coloniile sunt foarte mici, intens colorate in mov-negru. Lucrarile de testare a stabilitatii genetice a acestui caracter au dus la selectia a 5 colonii prelevate de pe mediul BW care au fost trecute in conserv vegetativ pe acest mediu si pe mediul YM sucroza si au constituit tulpina Rhodotorula rubra ICCF 220.
• A fost studiata influenta surselor de carbon: glucoza, sucroza, maltoza, glicerol, asupra formarii de biomasa continand pigmenti carotenoidici la tulpinile: Rhodotorula rubra ICCF 220,Rhodotorula sp. ICCF 396 si Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369. Cantitatea de biomasa variaza in functie de tulpina si sursa de carbon intre 5-12 g/l ca S.U,pe mediul cu sucroza obtinandu-se rezultate mai bune.
• Studiul influentei unei temperaturi de 30-32^oC asupra evolutiei bioprocesului la Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat lungirea duratei fazei logaritmice si valori mai mici pentru indicii de caracterizare a acestuia, respectiv DO si formarea de biomasa exprimata ca S.U.
• A fost izolata tulpina Rhodotorula sp. ICCF 396 dintr-o tulpina de Rhizobium sp., care ocazional, pe mediile de cultura (BW, Extract de malt 4%) formeaza colonii intens colorate in rosuviolaceu. Cultivarea acesteia pe aceleasi medii si in aceleasi conditii ca si Rhodotorula rubra ICCF 220, a evidentiat similitudinea morfo-fiziologica cu tulpinile de Rhodotorula din colectie.
• Rezultatele cele mai bune privind utilizarea sursei de carbon (Mediul nr. 3 cu sucroza) cu formare de biomasa, s-au obtinut cu tulpina Sporobolomyces salmonicolor ICCF 369 izolata din tulpina Xanthophillomyces dendrorhous ICCF 338 (DSM 5626).
• Continutul total în pigmenti carotenoidici este variabil, dependent de natura microorganismului, dar si de conditiile de cultivare, respectiv de natura sursei de carbon. Continutul în pigment cu absorbtia maximă la 490-500nm (posibil Torularhodin) în cazul cultivării Rhodotorula ICCF 220 pe mediul cu malt este cel mai ridicat.
• Mediile de cultură utilizate au prezentat o influentă considerabilă asupra dezvoltarii biomasei celulare si biosintezei pigmentilor carotenoidici, în particular a torularhodinei.
• Pentru tulpina parentala s-a determinat cea mai mare producŃie de torularhodină în mediul MS3 cu fructoză (626 μg/l mediu) urmată de zaharoză si glucoză, date comparabile cu cele din literatura de specialitate.
• Bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură Sabouraud si comparativ pe acelasi mediu a tulpinii mutante Rhodotorula rubra ICCF 220 (două experimente).
• S-a urmărit variatia în timp a densităŃii optice (măsură a dezvoltării celulare), a pH-ului si a variatiei concentratiei oxigenului dizolvat în timp. Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponential. Pentru tulpina mutantă s-au obtinut valori mai mari ale vitezei specifice de crestere fată de tulpina parentală, dar valorile nu diferă semnificativ.

Etapa III (raportare 15 iulie 2009): Stabilirea procedeului de laborator de formare a torularhodinei şi a pigmenţilor carotenoizi asociaţi

Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

-          Metoda de extracţie cea mai eficientă a pigmenţilor din celulele a două tulpini de drojdii aparţinând genului Rhodotorula este extracţia cu DMSO şi acetonă.

-           Dintre metodele studiate în vederea realizării separării şi izolării torularhodinei şi a pigmenţilor asociaţi din extractele carotenoidice totale, metoda cromatografiei pe coloană la presiune normală a condus la obţinerea rezultatelor scontate în sensul că au fost separate fracţii  ale căror spectre de absorbţie în domeniul vizibil şi cromatograme realizate prin LC-MS au demonstrat prezenţa torularhodinei.

-          Au fost stabilite condiţiile optime de operare care permit realizarea unei separări corespunzătoare a bioproduşilor prin  HPLC. 

-          A fost testată şi aplicată metoda spectrofotometrică. Pe baza unei curbe etalon de ß-caroten au fost efectuate determinările cantitative necesare stabilirii conţinutului în carotenoide şi precum şi eficienţa diferitelor operaţii tehnologice.

-          S-a realizat bioprocesarea drojdiei parentale Rhodotorula rubra ICCF 209 IMF R 7 IC 120 pe mediul de cultură MS3, în care s-a folosit zaharoza ca sursă de carbon atât datorită inducerii biosintezei torularhodinei ca metabolit secundar cu proprietăţi tinctoriale şi antioxidante, cât şi datorită preţului de cost scăzut.

-          S-a realizat cultivarea într-un bioreactor de laborator tip Bioengeering cu capacitatea de 3, 7 L prevăzut cu aerare, agitare, termostatare şi înregistrare automată a unor parametrii de proces-turbiditate, pH, pO₂ .

-          Pe parcursul dezvoltării culturii au fost monitorizaţi următorii parametri: temperatură, pH, pO₂ şi turbiditate, care au fost reprezentaţi grafic în funcţie de timpul de biosinteză. Nivelul scăzut al pO₂ către sfârşitul fazei exponenţiale de creştere indică faptul că este necesară mărirea în continuare a parametrilor ce influenţează nivelul transferului interfazic al oxigenului, turaţia agitatorului mecanic şi debitul de aerare, pentru a realiza un exces de oxigen dizolvat şi neconsumat de cca 20% pe durata bioprocesului discontinuu.

-          Pentru determinarea vitezei specifice pentru fiecare experiment s-a aplicat modelul exponenţial. Valorile obţinute pentru fiecare caz în parte sunt comparabile pentru cele doua obţinând experimente efectuate independent.

-          După încheierea biosintezei, s-a realizat prelucrarea biomasei. Biomasa umedă a fost separată prin centrifugare şi s-a efectuat extracţia pigmenţilor carotenoidici totali în hexan precum şi a torularhodinei, singura componentă cu caracter acid în metanol bazic, trasându-se curbele de absorbţie în vizibil şi calculându-se totodată concentraţia acestor pigmenţi raportată atât la substanţa uscată cât şi la unitatea de volum de mediu.

-          S-a determinat o concentraţie finală de beta-caroten cuprinsă între 600-700 μg/L mediu precum şi o concentraţie de torularhodină de 377 μg/L. Pe parcursul biosintezei în probele recoltate s-a determinat după primele 24 de ore de dezvoltare o preponderenţă a beta-carotenului, iar după 48 de ore de dezvoltare mai mult de 50 % din acest pigment se poate presupune că s-a transformat pe calea metabolică descrisă în literatură în torularhodină.

Studiul diferitelor modele de extractie a cu fluide supercritice propuse pentru pigmenti din clasa carotenoizilor a condus la concluzia ca aceasta metoda poate poate fi folosita cu randamente acceptabile, in special in cazul utilizarii unor co-solventi organici.

 

Etapa IV (raportare 15 noiembrie 2009): Studiul condiţiilor de separare şi caracterizare bioproduşi

 

Desfaşurarea activităţilor prevăzute în Planul realizare la etapa raportată a condus la următoarele concluzii:

-          Studiile efectuate în vederea realizării dezintegrării /disrupţiei membranelor celulare i au constat în aplicarea tehnicilor: tehnica imersării în azot lichid (congelare) urmată de imersia în apă fierbinte (decongelare); tratare la cald cu soluţie salină peste tăria ionică fiziologică ( sol. NaCl 20%); tratare in sisteme agitate ( tip Vortex sau Dezintegrator) cu perle de zirconiu de diferite diametre (0,5-1 mm).

-          Efectul tratamentelor aplicate asupra celulelor de biomasă a fost urmărit prin intermediul imaginilor captate la microscopul optic şi prin cantitatea de pigmenţi carotenoidici extrasă  în volume egale de solvent de extracţie.

-          Tratamentul cu perle în aparate tip Vortex sau Dezintegrator apare ca un procedeu necesar, care favorizează extracţia pigmenţilor din celulele de drojdie. În absenţa oricărui procedeu de permeabilizare/dezintegrare a membranei celulare extracţia pigmenţilor nu se realizează, sau se realizează în condiţii dificile necesitând adaosuri de acizi sau baze care pot produce modificări ale structurii pigmenţilor extraşi.

-          Au fost extinse studiile privind posibilitatea realizării separării pigmenţilor carotenoidici din extractele celulare prin metoda repartiţiei lichid-lichid.

-          Urmărirea procesului de separare a pigmenţilor carotenoidici extraşi din culturile testate s-a realizat prin metodele analitice selectate şi anume : spectrofotometric, prin cromatografie în strat subţire şi HPLC.

-          Prin aplicarea reapartiţiei între Metanol şi Hexan în condiţii de variaţie a valorii pH-ului s-au separat pigmenţii nepolari (sau cu polaritate scăzută) prin trecere în faza hexanică la pH alcalin, iar pigmentul cel mai polar , (în cazul nostru Torularhodinul) a fost trecut în faza hexanică abia după acidulare. Maximul de absorbţie al acestor faze s-a situat în intervalul de 495 – 499 nm atribuit Torularhodinului conform datelor de literatură.

-          Prezenta pigmentului Torularhodinul a fost confirmata şi prin aplicarea metodei HPLC unde a fost evidenţiată prezenţa unui singur compus majoritar al cărui spectru pe pic este similar cu al Torularhodinului prezentat în literatura de specialitate cu un maxim la λ =495 nm .

-          In vederea stabilirii metodei optimizate de testare a caracterului antioxidant al pigmentilor carotenoidici, au fost analizate metodele fluorimetrice pentru determinarea capacitatii antioxidante impotriva radicalilor peroxyl (ORAC – Oxygen Radicals Absorbance Capacity), peroxinitrit (NORAC – Nitric Oxide Radicals Absorbance Capacity), hydroxyl (HORAC – Hydroxyl Radical Absorbance Capacity) si superoxide (SORAC – Superoxide Radicals Absorbance Capacity). Metoda fluorimetrica ORAC se adreseaza atat antioxidantilor hidrosolubili (H-ORAC), cat si celor liposolubili (L-ORAC), capacitatea antioxidanta totala impotriva radicalilor peroxyl fiind suma valorilor obtinute pentru cele doua variante (ORAC total = H-ORAC + L-ORAC).

-          Pentru realizarea obiectivului privind diseminarea rezultatelor preliminare au fost realizate :

×          un poster  prezentat la “16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering ” Sinaia, sept.9-12, 2009

×           o lucrare publicată în ” Proceedings of the 16 th Romanian International Conference on Chemistry and Chemical Engineering “

×          un poster ce urmeză a fi prezentat la “2nd International Symposium on New Research in Biotechnology,” 19 – 20th November 2009, Bucharest, Romania.

 

Proiect 42164

Acronim:  MIRVI

Investigatii moleculare ale infectiilor respiratorii acute determinate de virusuri non-gripale, cu evaluarea implicatiilor in patologia sugarului si copilului mic

 

Proiectul are ca scop investigarea infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial – VRS, Meta Pneumo virusului uman – hMPV, Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si Coronavirusurile OC 43 si 229E) folosind tehnici de evaluare moleculara atat a agentilor etiologici cat si a reactiei organismului la acestia utilizand atat datele clinice cat si testele de laborator moleculare, atat pentru diagnostic etiologic cat si de analiza a mediatori solubili ai inflamatiei (citokinelor/chemokinelor serice).

Se stie ca, daca pentru diagnosticul virozelor datorate VRS si adenovirusului exista si teste rapide comerciale de diagnostic iar pentru celelalte virusuri doar diagnosticul prin imunofluorescenta, aceste metode nu prezinta aceeasi sensibilitate si specificitate ca diagnosticul molecular prin RT-PCR (revers transcription polimerase chain reaction). In acelasi timp efectul acut al infectiilor respiratorii virale non-gripale asupra organismului, tradus prin secretia mediatorilor solubili ai inflamatiei a fost investigat pana acum intr-o masura relativ restransa. Drept urmare, obiectivele principale ale studiului sunt: evaluarea acestor infectii utilizand tehnici moderne atat de detectie a patogenului (RT-PCR/real time RT-PCR) cat si de analiza a raspunsului organismului prin profilul mediatorilor solubili ai inflamatiei (Tehnologia Multiplex – xMAP, aplicata pe platforma LUMINEX 100IS); stabilirea relevantei clinice a profilului molecular; estimarea implicatiilor asupra strategiei de diagnostic, management si control al infectiilor respiratorii la copii.

Rezultatele estimate ale proiectului sunt: punerea la punct si optimizarea unui pachet de tehnici moleculare de diagnostic, imbunatatind metodologia diagnosticarii infectiilor respiratorii non-gripale (datorate Virusului Respirator Sincitial_VRS, MetaPneumo virusului_hMPV,Virusurilor Paragripale 1,2,3, Adenovirusului si CoronaVirusurile OC 43 si 229E); obtinerea unui tablou al pattern-urilor de secretie de mediatori solubili ai inflamatiei (realizabil doar folosind tehnologia Multiplex), in corelatie cu incarcarea virala, profilul clinic etc.; incidenta acestor viroze in patologia respiratorie a sugarului si copilului mic care se adreseaza clinicilor pediatrice din proiect; identificarea de  parametri semnificativi in evaluarea impactului celorlalte rezultate.     

Prin tematica abordata, proiectul se incadreaza in directia de cercetare 4. Sanatate, tematica de cercetare 4.1.3 Metode de investigaţie şi intervenţionale bazate pe medicina moleculară şi celulară, genomică şi proteomică din Planul National de Cercetare Dezvoltare si Inovare II, Programul Parteneriate, deoarece:

• 1. Virozele respiratorii altele decat gripa reprezinta o problema majora de sanatate publica la sugar si copilul mic cu un important impact socio-economic.
• 2. Studiul propus implica folosirea unor metode si tehnici specifice medicinei moleculare
• 3. Rezultatele estimate ale cercetarii vor putea fi folosite in conturarea unei noi abordari in investigarea si evaluarea eficientei strategiilor de management si control ale virozelor respiratorii non-gripale la sugar si copilul mic.
• 4. Gradul inalt de complexitate si interdisciplinaritate al activitatilor propuse impun constituirea unui parteneriat format din specialisti de cea mai inalta competenta din domenii complementare ale cercetarii si practicii medicale (pediatrii, medici de laborator – virusologi, imunologi, specialisti in medicina moleculara)

      Impactul proiectului este major in aria de cercetare medicala atit nationala cit si internationala domeniul abordat reprezentand o prioritate tematica la nivel national, deoarece pana acum nu s-au realizat studii sistematice in tara noastra in acest domeniu. Proiectul va fi realizat prin colaborarea a trei institutii de cercetare medicala din Romania:

1. Promotorul Proiectului: Institutul National de Cercetare Dezvoltare in Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino” (IC), cu experienta in cercetare fundamentala si aplicata in domeniul microbiologiei, imunologiei, virusologiei si medicinii moleculare
2. Spitalul de Pediatrie Grigore Alexandrescu-Bucuresti

Universitatea de Medicina si Farmacie Carol Davila (Clinica Pediatrie IOMC Alfred Russescu, Bucuresti

 

Obiectiv specific faza I Punerea la punct şi optimizarea unor metode de diagnostic molecular în afecţiunile virale respiratorii non-gripale precum şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei, utilizând tehnologia multiplex xMAP^â -Luminex. Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale: analiza datelor din literatură privind tehnicile de diagnostic molecular (RT-PCR şi real time RT-PCR) al infecţiilor respiratorii non-gripale, elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie, de formare a loturilor de pacienţi diagnosticaţi cu infecţii respiratorii virale, elaborarea metodologiei de recoltare a probelor biologice, evaluarea virusologică a tulpinilor de virusuri non-gripale detectate prin secvenţierea lor şi evaluarea patternurilor de secreţie a mediatorilor solubili ai inflamaţiei.

 

Rezumat faza I Infecţiile respiratorii în general constituie o grupă patologică cu mare impact în motbiditate şi mai ales cu potenţial serios de producere de epidemii cu viteză mare de extindere şi gravitate semnificativă. In cadrul patologiei sugarilor şi copiilor mici, infecţiile respiratorii constituie o problemă majoră at]at prin numărul cazurilor cât şi prin dificultatea aplicării metodelor de prevenţie. Aproximativ 70% din infecţiile respiratorii acute ale copilului sunt determinate de virusuri, majoritatea dintre ele fiind non-gripale. Din punct de vedere etiologic, există teste rapide comerciale numai pentru infecţiile virale respiratorii datorate VRS şi ADV, iar în general pentru virusurile respiratorii non-gripale se utilizează teste de imunofluorescenţă dar care nu au o sensibilitate (aproximativ 90%) şi specificitate (aproximativ 84%) foarte bune. Astfel, se impune în diagnosticarea infecţiilor virale respiratorii, altele decât gripa. Un diagnostic performant şi rapid în baterie, pentru majoritatea acestor virusuri care sunt importante în patologie, fiind un domeniu în care se descoperă atât noi patogeni (cum este de exemplu Metapneumovirusul uman (hMPV)) cât şi noi aspecte ale infecţiilor virale respiratorii, cum a fost epidemia SARS (severe acute respiratory syndrome) dată de un coronavirus.

In Romania, diagnosticarea etiologică a acestor infecţii a fost iniţiată de INCDMI Cantacuzino, iar acest demers trebuie continua şi dezvoltat. Un alt aspect mai putin investigat până acum sau în curs de investigare este reacţia acută a organismului faţă de aceste infecţii, exprimată în tabloul mediatorilor solubili ai inflamaţiei. Astfel se vor analiza aceste infecţii respiratorii non-gripale (datorate VRS, Metapneumovirusul uman (hMPV), virusurilor Paragripale 1,2,3 şi Coronavirusurile OC43 şi 229E) folosind tehnici de evaluare moleculară moderne atât a agenţilor etiologoci cât şi a reacţiei organismului la aceştia utilizând atât datele clinice cât şi testele de laborator moleculare, atât pentru diagnostic etiologic, cât şi de analiza mediatorilor solubili ai inflamaţiei (citokinelor/chemokinelor serice).

Rezultatele studiului vor fi utilizate pentru estimarea implicaţiilor asupra strategiei de diagnostic, management şi control al infecţiilor respiratorii la copii.

Virusurile sunt implicate în majoritatea infecţiilor respiratorii la sugari şi copii mici. Datorită incidenţei mari ale bronşiolitelor la copiii mici cauzate de VRS (40-45%) şi a hMPV (7-12%), apare necesitatea punerii unui diagnostic cât mai specific şi mai sensibil ale unor astfel de afecţiuni cât şi evaluarea mecanismelor patologice implicate la nivel molecular. Pentru un diagnostic cât mai bun şi eficient în aceste afecţiuni, se impune implementarea metodelor de diagnostic molecular (RT-PCR) standard şi/sau multiplex şi/sau real-time. Menţionăm drept exemplu faptul că la această oră pentru diagnosticul afecţiunilor cauzate de hMPV există numai această tehnică moleculară pe care INCDMI Cantacuzino a introdus-o în cadrul laboratorului său de Infecţii Respiratorii Virale, pentru prelucrarea probelor de la sugari şi copii mici. Pentru reducerea costului reacţiilor se poate testa şi introduce reacţia de amplificare moleculară pentru mai multe virusuri deodată (PCR Multiplex) de exemplu pentru virusurile paragripale se poate realiza RT-PCR Multiplex pentru cele 3 tulpini (1,2,3) într-o singură reacţie.

Patogeneza infecţiilor respiratorii cu etiologie virală nu este pe deplin clarificată până în prezent, dar există un consens în ceea ce priveşte implicarea răspunsului imun al organismului gazdă în mecanismele producerii bolii. În privinţa evaluării mediatorilor solubili ai inflamaţiei, este cunoscut faptul că profilul secreţiei lor influenţează atât profilul clinic, cât şi evoluţia ulterioară a pacienţilor, fiind factori posibili de inducere şi/sau prognosticare a evoluţiei spre hipersensibilitate şi inflamaţie cronică de tipul celei prezente în astmul bronşic.

Studierea în detaliu a mecanismelor patogenice implicate în SARS (Severe Acute Respiratory Syndrome, cauzat de un coronavirus înrudit cu Coronavirusurile OC43 şi 229E, numit SARS-CoV) a dus la conturarea unei paradigme conform căreia infecţia virală induce un răspuns imun exagerat, manifestat în principal prin niveluri sistemice extrem de crescute ale mediatorilor solubili ai inflamaţiei (“furtună de citokine”), responsabile de distrugerea alveolară difuză caracteristică acestui sindrom. Ulterior, paradigma a fost extinsă şi pentru cazurile de infecţii respiratorii gripale cu tulpina H5N1, fiind aplicată generic tuturor infecţiilor respiratorii cu etiologie virală care au evoluţie gravă. Totuşi, aceasta pare a fi o abordare prea simplistă a problemei, care nu reflectă realitatea. Studii ulterioare au arătat că în cazul SARS evoluţia nefavorabilă este asociată cu valori sistemice crescute ale unor chemokine (CXCL9: MIG, monokine induced by γ -interferon; CXCL10: IP-10, interferon inducible protein-10; CCL2: MCP-1, monocyte chemoattractant protein-1) dar fără creşterea valorilor citokinelor pro-inflamatorii (IL-1, IL-6, TNF-α); IFN-α, IFN-γ şi IL-12 au valori scăzute; există un anumit grad de limfopenie şi în cazul unora dintre pacienţi apar autoanticorpi (IgM şi împotriva unor antigene citoplasmatice pneumocitare) (1). În cazul infecţiei cu H5N1 (1997) cazurile care au evoluat spre exitus au fost asociate cu valori serice excesive ale IL-6, IL-2R şi IFN-γ precum şi cu depleţie limfocitară. Se impune astfel nuanţarea paradigmei enunţate mai sus, putându-se descrie pattern-uri de mediatori solubili caracteristice fiecărei etiologii.

Astfel, în cazul VRS (virusul respirator sinciţial) se constată atât niveluri sistemice crescute ale citokinelor pro-inflamatorii (IL-6, TNF-α şi IL-8) dar şi anti-inflamatorii (IL-10) care participă la efectele patogenice ale infecţiei (însoţite de secreţie scăzută de IFN tip I). Se asociază şi un pattern particular de chemokine, incluzând IL-8/CXCL8, MIP-1α/CCL3, MIP-1β/CCL4, MIP-2, IP-10, eotaxin-1/CCL11, MCP-1 şi RANTES/CCL5. VRS este capabil să infecteze celulele dendritice (DC, atât mieloide cât şi plasmacitoide); DC infectate sunt capabile de maturare (exprimă la nivel membranar CD80, CD86 şi MHC-II) dar nu mai pot realiza eficient “priming”-ul limfocitelor T antigen-specifice (DC infectate sunt incapabile de a secreta citokine de tip Th-1, cum ar fi IFN-α şi IL-12p70 necesare pentru promovarea funcţiei efectorii a limfocitelor T CD8+; în schimb induc polarizare Th-2, cu secreţie de IL-4 şi IL-5 de către limfocitele T CD4+). Aceste fenomene au cel puţin două consecinţe patogenice: lipsa unei memorii imunologice eficiente post-infecţie (asociată cu reinfecţii frecvente) şi favorizarea hiperactivităţii inflamatorii a mucoasei tractului respirator (astm bronşic). Răspunsul de tip Th-2 a fost obţinut şi în urma încercărilor de a se obţine un vaccin (VRS inactivat prin tratare cu formalină a indus în modele experimentale la o memorie imunologică polarizată Th-2, responsabilă de reacţie inflamatorie cu eozinofile şi distrugere pulmonară extensivă prin complexe imune şi complement la a doua expunere la VRS) (2).

Deşi înrudit cu VRS, metapneumovirusul uman (hMPV) prezintă un mecanism diferit de evitare a răspunsului imun antiviral. Acest virus poate infecta DC (atât mieloide cât şi plasmacitoide) dar fără a induce maturare; celulele infectate produc doar IL-6 şi TNF-α (în concentraţii mult mai mici decât VRS) în schimb induc secreţie semnificativă de IFN-α (deşi în modele experimentale in vitro hMPV, similar cu VRS, a putut bloca în mod eficient secreţia de IFN-α indusă prin agonişti sintetici: poly-IC sau CpG) (3). În plus,m modele experimentale pe animale de laborator indică un pattern de chemokine diferit în cazul hMPV faţă de VRS: valori crescute ale GM-CSF şi KC (chemoatractant al neutrofilelor) (4).

Astfel de pattern-uri de mediatori solubili au fost definite pentru toţi agenţii etiologici ai infecţiilor respiratorii luaţi în discuţie în proiectul de faţă, dar rezultatele sunt neconcludente (şi chiar uneori contradictorii, în special în cazul modelelor experimentale, rezultatele variind mult în funcţie de specia de animal de laborator pentru experimentele in vivo sau tipul liniei celulare pentru cele in vitro). Se impune astfel continuarea acestor tipuri de studii prin analiza mediatorilor solubili ai răspunsului imun la pacienţii cu infecţii respiratorii, atât în faza acută a bolii cât şi în perioada de convalescenţă.

 

Concluzii faza I

A fost atins obiectivul acestei faze a proiectului: elaborarea modelului teoretic de studiu pentru evaluarea virozelor respiratorii non-gripale.

Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor parţiale:

• - Analiza datelor din literatură privind tehnicile moleculare de diagnostic ale infecţiilor respiratorii virale non-gripale;
• - Elaborarea documentaţiei referitoare la criteriile de selecţie a loturilor de pacienţi;
• o Elaborarea metodologiei de: – evaluare clinică a pacienţilor, recoltare probe biologice;

evaluarea diagnosticului de infecţii respiratorii cauzate de virusuri non-gripale prin tehnici moderne moleculare

Proiect 42-116

Acronim : CarMen

Managementul meningitelor bacteriene acute: Strategii moderne de investigatie si interventionale

Dirctor proiect: Dr. Vasilica Ungureanu

Parteneri:

Institutul National de Boli Infectioase “Prof. Dr. M. Bals”

Spitalul Clinic de Boli Infectioase “Dr. V. Babes”

Meningita bacteriana acuta (MBA) – o infectie invaziva a SNC, caracterizata prin inflamatia meningelui, este o cauza majora de morbiditate si mortalitate, putand produce sechele permanente (epilepsie, retardare mentala sau surzenie etc.). Acesta patologie reprezinta o serioasa problema de sanatate publica la nivel mondial. In ciuda disponibilitatii celor mai noi si potente antibiotice cat si atentiei acordate diagnosticului si profilaxiei prin antibioterapie si/sau vaccinare, rata mortalitatii ramane in continuare foarte inalta, in special in tarile in curs de dezvoltare (15 – 40%). Meningita este o urgenta medicala ce justifica necesitatea diagnosticului rapid si instituirea unei terapii agresive. Medici infectionisti si cercetatori din intreaga lume reclama nevoia supravegherii permanente a meningitei bacteriane acute, stiind ca agentii patogeni responsabili pentru infectii ale SNC variaza cu timpul si aria geografica, precum si cu varsta si functionalitatea mecanismelor de aparare a organismului.

Scopul proiectului este reprezentat de elaborarea unui algoritm modern de diagnostic si tratament al meningitelor bacteriene acute in concordanta cu noile descoperiri si directii de cercetare in domeniu. Acesta va permite identificarea rapida a agentilor etiologici specifici, orientarea diagnosticului si tratamentului, prin completarea metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare, capabile sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice alternative.

Principalele obiective ale proiectului sunt:

• - Studiul aspectelor de etiologie bacteriana a meningitei prin metode conventionale si moleculare
• - Punerea la punct a unui algoritm de diagnostic bacteriologic si molecular “cost-eficient” al meningitelor cauzate de cei mai frecventi agenti patogeni
• - Studiul aspectelor de sensibilitate/rezistenta la antibiotice si realizarea antibiotipurilor de rezistenta
• - Caracterizarea prin metode moleculare a principalilor agenti etiologici de natura bacteriana, dar si virala pentru realizarea diagnosticului diferential
• - Studiul implicarii mediatorilor solubili ai inflamatiei (citokine, chemokine etc.) in patogenie pentru diagnosticul diferential cu alte meningite (virale, aseptice) din stadiile incipiente ale bolii
• - Studierea interactiei complexe agenti patogeni-sistem imun in relatie cu particularitatile localizarii meningeale, in vederea elucidarii mecanismelor ce stau la baza patogeniei bolii/complicatiilor neurologice consecutive

Rezultatele estimate ale proiectului:

• - Definirea unui cadru epidemiologic adaptat la situatia actuala din Romania
• - Optimizarea algoritmului de diagnostic microbiologic si diferential al meningitelor
• - Actualizarea si reconsiderarea schemelor terapeutice
• - Evidentierea implicarii unor componente ale imunitatii in mecanismele patogenice ce contribuie la severitatea bolii si la aparitia complicatiilor ulterioare
• - Conturarea unor noi strategii de prevenire si control a bolii

Etapa I (raportare 15 februarie 2009): Model conceptual de studiu al etapelor critice ale diagnosticului MBA

In aceasta etapa a fost realizat un studiu al datelor din literatura de specialitate pentru a identifica stadiul actual al cunoasterii diagnosticului MBA pe plan international, precum si aspectele critice ale supravegherii si diagnosticului MBA in Romania. Aceasta va permite elaborarea unui algoritm de diagnostic si tratament al meningitelor bacteriene acute, putand realiza astfel identificarea rapida a agentilor etiologici si orientarea diagnosticului si tratamentului, prin completarea metodelor conventionale cu metode si tehnici moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare, capabile sa evidentieze punctele critice din patogenia bolii, ce pot deveni astfel tinte terapeutice alternative.

De asemenea, a fost elaborata documentatia referitoare la particularitatile clinice si epidemiologice ale MBA determinate de cei mai frecventi agenti bacterieni si s-au definit criteriile de selectie a pacientilor in studiu, precum si fisa de urmarire clinica a pacientilor.

Criteriile de selectie a pacientilor in studiu:

1.  Criterii clinice

Meningita bacteriana poate fi dificil de diagnosticat dupa semne si simptome, acestea fiind adesesa nespecifice (11).

Simptomele pot include : febra, cefalee, inapetenta, greturi, varsaturi, letargie, iritabilitate, fotofobie, alterarea starii de constienta.

Semnele clinice cele mai frecvente la copii sunt : febra, varsaturi, bombarea fontanelelei,  somnolenta, refuzul suptului, apnee, convulsii si rash purpuric. La copiii mai mari semnele clasice -  redoarea cefei, cefalea si fotofobia – sunt cele mai comune, iar semnele Kernig, Brudzinski, sunt adesea absente.

2. Criterii epidemiologice:

-    Contact cu alte cazuri cunoscute

-    Provenienta din colectivitate (casa copii, camin,, cresa, armata, etc)

-    Calatorie recenta in zone endemice (Africa, Asia, etc)

-    Contact cu animale (profesional, animale de casa)

3.  Criterii de laborator

3.1. Criterii orientative:

Modificarile macroscopice, citologice si biochimice ale LCR sugestive pentru o meningita bacteriana sunt:

• - LCR tulbure (zeama de varza) sau opalescent
• - LCR hipertensiv
• - Reactia Pandy pozitiva
• - Pleiocitoza (peste 100 celule nucleate / mmc LCR) cu predominenta PMN
• - Hiperalbuminorahie (peste 100 mg /dl LCR)
• - Hipoglicorahie (sub 40 mg / dl LCR)

3.2. Criterii de confirmare:

Etiologia bacteriana a unei meningite acute bacteriane poate fi confirmata prin 3 metode:

-    Identificarea pe frotiul colorat Gram a unei bacterii gram-pozitive sau negative.

-   Identificarea unor antigene bacteriene solubile  din LCR sau sange prin: latex-aglutinare,                            imunoelectroforeza

-    Izolarea in culturi a unei bacterii din LCR sau sange (hemocultura)

4. Criterii de excludere :

– Pacienti ce nu consimt sa participe la studiu

– Epidemie de meningita virala

-    Semne sugestive de meningita tuberculoasa:    -    Debut insiduos

-    Sindrom de impregnare bacilara

-   Infectie TBC cunoscuta (pulmonar

sau alta localizare

-    Infectie HIV (?)

Pentru a facilita comunicarea intre parteneri si a asigura un bun acces la rezultatele obtinute in cadrul proiectului a fost elaborata o baza de date cu acces extern restrictionat (username si parola). Fiecare partener este automat directionat catre partea ce ii revine din baza de date, pe baza username-ului propriu. Coordonatorul proiectului va avea acces la toata baza de date.

Intrucat metodele si tehnicile moderne din domeniul imunologiei si biologiei moleculare vor fi puse la punct si aplicate pentru prima data in tara noastra, s-a impus elaborarea metodologiei de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in LCR si ser si a metodologiei moderne de diagnostic – adaptate pentru probele biologice utilizate.

Etapa II (raportare 01.12.2009): Studiul si analiza comparativa a metodelor moderne si conventionale de diagnostic MBA.

Activitatile specifice si rezultatele estimate ale acestei etape sunt:

1. Metodologie de diagnostic microbiologic  prin metode conventionale si de  testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice (optimizare metode)
2. Metodologie de diagnostic diferential prin metode conventionale (optimizare metode)
3. Metodologie de diagnostic si caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de derminare a markerilor genetici ai rezistentei bacteriene (optimizare metode)
4. Metodologie de realizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in LCR/ ser

Rezumatul etapei II

1. In aceasta etapa sunt descrise etapele importante ale diagnosticului bacteriologic prin metodele conventionale optimizate, experimentate la nivelul laboratoarelor partenerilor: recoltarea prelevatelor biologice (LCR, hemocultura, exsudate faringiene si nazale etc), procesarea acestora, urmata de identificarea prin metode rapide de diagnostic (ex. Latex – aglutinare, microscopie) si identificarea prezumtiva a agentului cauzal. Inocularea prelevatelor biologice pe medii de cultura este urmata de identificarea definitiva a agentului etiologic al MBA. Ultima etapa a diagnosticului bacteriologic il constituie testarea susceptibilitatii la antibiotice (TSA), ceea ce ajuta la determinarea antibiotipurilor de rezistenta, necesara pentru instituirea tratamentului “empiric” pana la obtinerea rezultatelor de laborator, prezentand astfel importanta pentru adoptarea atitudinii terapeutice si/sau a politicii de utilizare a antibioticelor la nivel local, regional si/sau national pe baza datelor obtinute.

2. In continuare sunt etalate metodele conventionale de diagnostic diferential. Diagnosticul diferential intre meningita bacteriana si meningitele de alte etiologii este inca foarte dificil de facut, semnele si simptomele fiind adesea nespecifice. Analiza LCR, coloratia Gram si cultura raman inca cele mai utilizate metode de diagnostic al meningitei, dar la pacientii ale caror rezultate, privind coloratia Gram si cultura, sunt negative, se folosesc alte teste pentru a diferentia meningita bacteriana de celelalte meningite (nivelul proteinelor, lactatului si glucozei, ca si numarul leucocitelor in LCR ; CRP, procalcitoninele si glucoza in ser). Parametrii cei mai importanti pentru diagnosticul diferential al meningitelor sunt sintetizati in Tabelul 2.

3. Unul dintre obiectivele specifice ale fazei de executie a fost elaborarea metodologiei de diagnostic si caracterizare a tulpinilor bacteriene prin metode moleculare; metodologie de derminare a markerilor genetici ai rezistentei bacteriene.Metodele de laborator convenţionale, bazate pe cultivarea şi identificarea agentului etiologic prezent în produsul patologic, pot necesita cîteva zile pentru obţinerea unui rezultat cert. In plus, instituirea precoce a tratatmentului cu antibiotice, înaintea recoltării probelor biologice, a diminuat mult numărul cazurilor clinice de meningită confirmate prin metode de laborator tradiţionale. Acest impas poate fi depăşit prin identificarea microorganismului direct în produsul patologic, utilizând în principal tehnica PCR. In această etapă, ne-am propus adaptarea la condiţiile noastre de lucru a unei reacţii PCR multiplex care permite detectarea simultană a celor trei microorganisme care cauzează majoritatea meningitelor bacteriene: Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae si Haemophilus influenzae. Această metodă ţinteşte trei gene specifice speciilor menţionate :ctrA – codifică o proteină de membrană implicată în transportul capsulei la N. Meningitidis ; ply – codifică pneumolizina la S. pneumoniae ; bexA – codifică o proteină implicată în exportul capsulei polizaharidice la H. Influenzae.

Studiile efectuate pe probe biologice în diferite laboratoare, au evidenţiat sporirea numărului de rezultate pozitive înregistrate în diagnosticul etiologic al meningitelor acute bacteriene obţinute prin utilizarea unei reacţii PCR multiplex şi sunt unanim de acord asupra utilităţii includerii unor reacţii de acest tip în diagnosticul molecular de rutină.

Identificarea serogrupului / serotipului reprezintă primul pas în caracterizarea tulpinilor de meningococ şi cel mai important pentru managementul prompt al contacţilor. Pentru acest motiv au fost dezvoltate metode PCR de amplificare a acizilor nucleici, pentru identificarea serogrupului la nivel molecular (genogrup), care sunt sau trebuie să devină o parte importantă a funcţiei laboratorului de referinţă.

In ceeea ce priveste determinarea moleculară a sensibilităţii la agenţi antimicrobieni în absenţa unor culturi bacteriene, s-a experimentat detectarea mutaţiilor în secventa genelor implicate în rezistenţa principalilor agenti cauzali ai MBA la substanţe antimicrobiene  prin amplificare PCR urmată de secvenţiere.

4. Un alt obiectiv specific al fazei de executie II a fost elaborarea metodologiei de realizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice (LCR si ser) recoltate de la pacienti cu meningita acuta. Etapele importante in cadrul acestui model experimental au fost definite, dupa cum urmeaza: selectarea pacientilor si recoltarea probelor biologice; selectarea parametrilor imunologici de determinat; alegerea metodei de determinare si optimizarea protocolului de lucru. Determinarea unor astfel de pattern-uri specifice de mediatori solubili ai inflamatiei atat la nivel sistemic (ser) cat si local (LCR) in relatie cu etiologia si evolutia meningitelor infectioase ar putea constitui o modalitate moderna de diagnostic. In ceea ce priveste metoda de testare, variantele cele mai potrivite au fost considerate metodele ELISA si xMAP (asa cum reiese si din evaluarea metodologiei de lucru din etapa anterioara de raportare), ambele avand la baza reactia specifica antigen-anticorp. Desi ELISA este o metoda robusta, cu sensibilitate si specificitate crescuta,  are ca dezavantaj major posibilitatea determinarii unui singur parametru in mediul de reactie, necesitand efectuarea de determinari separate pentru fiecare parametru in parte. Acest fapt a dus la optiunea utilizarii tehnologiei xMAP (care permite determinari multiple de parametri simultan in aceeasi proba) deoarece in etapa de optimizare a modelului experimental de determinare a mediatorilor solubili ai inflamatiei in fluide biologice a fost necesara determinarea unui panel larg de parametri (citokine, chemokine, factori de crestere) pe un numar redus de probe biologice.

Tehnologia xMAP folosita de platforma Luminex permite o determinare multiparametrica bazandu-se pe un ansamblu (array) de microsfere in suspensie capabil sa detecteze simultan pana la 100 de parametri intr-o singura proba (necesarul fiind de maximum 100 µL de proba biologica, in mod obisnuit 25 – 50 µL). Aceasta tehnologie ofera o solutie eficienta de investigare a sistemelor complexe de mediatori (cum ar fi citokinele secretate la nivel sistemic in cursul inflamatiei, reteaua de hormoni etc.), avand o serie de avantaje cum ar fi rapiditatea achizitiei datelor, specificitate si sensibilitate excelenta, protocol mai putin laborios (decat metode de referinta cum ar fi ELISA), cost redus per parametru, cinetica de reactie mai rapida, flexibilitate in alegerea parametrilor. De asemenea datorita analizei statistice a evenimentelor individuale (prin soft-ul dedicat, Star Station 2.3), rezultatele obtinute sunt net superioare.

Lista de publicatii / comunicari stiintifice

1. 1. Identificarea cocilor gram-pozitivi aerobi si  facultativ anaerobi – Irina Codita, D. Buiuc, Carme Panzaru, Vasilica Ungureanu – Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009;
2. 2. Identificarea cocilor gram-negativi aerobi – M. Negut, Ileana Levenet, Al. Rafila – Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009;
3. 3. Identificarea bacililor gram-negativi aerobi sau facultativ anaerobi pretentiosi nutritiv – N. Mihancea, G. Mihai, Veronica Alecu, D. Buiuc, M. Negut, Olivia Vizitiu – Tratat de Microbiologie Clinica, ed II.  Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, Ed III, 2009
4. 4. L. Lerescu, C. Tucureanu, Iuliana Caras, Ramona Pitica, Vasilica Ungureanu, Aurora Salageanu – Implicarea mediatorilor solubili ai inflamatiei în interactia agent patogen – sistem imun din cadrul meningitelor infectioase – Bacteriol. Virusol.Parazitol. Epidemiol.- 2008, vol 53, nr 2, pp 89-97.
5. 5. Marina Pana, Maria Ghita, Ileana Levenet, Maria Nica, Smaranda Botea, T. Osz – The in vitro susceptibility to 7 antibiotics of  Neisseria meningitidis strains isolated last years in Romania – Romanian Archives of  Microbiology & Immunology , vol. 68 (1), January- March, 2009
6. 6. Marina Pana, V Alexandrescu, I Apostol, P Calistru, Emilia Lupulescu, N Bucurenci, E Ionita, Vasilica Ungureanu, Maria Ghita, Alina E Baetel – Quantitation of human antibodies to 23F pneumococcal antibodies polysaccharide by Enzyme-Linked Immunosorbent Assay In Romania – Annual Scientific Conference 2009 INCDMI « Cantacuzino», 14 – 15 ian. 2009
7. 7. Silvia Cretoiu, Vasilica Ungureanu, Camelia Szmal, Maria Surdeanu, Mihaela Oprea, Anca Petrini, Monica Straut – Molecular characterization of Streptococcus pyogenes clinical isolates from invasive and non-invasive disease cases reported in Romania – Annual Scientific Conference 2009 INCDMI « Cantacuzino», 14 – 15 ian. 2009
8. 8. M Negut, A Rafila, G Ionescu, Alexandra Maria Nascutiu – Diagnosticul  microbiologic – noi provocari – Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, 8-10 0ct. 2009
9. 9. Vasilica Ungureanu, A. Rafila, Maria Nica,  Monica Straut - Algoritm de diagnostic al meningitelor bacteriene acute (MBA)”  – Conferinta Nationala de Microbiologie si Epidemiologie, Brasov, 8-10 0ct. 2009

Proiect 61-019

 

Acronim: TERASER

 

Titlu: Implementarea şi optimizarea procesului tehnologic de obţinere a serurilor terapeutice cu componentă activă F(ab’)₂ faţă de agenţi înalt patogeni bacterieni şi virali. TERASER

 

Director Proiect: Dr. Nadia Bucurenci

 

Proiectul este coordonat de

 

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

 

Avand ca parteneri

1.  Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila”

2.  Institutul National De Cercetare-Dezvoltare In Domeniul Patologiei Si Stiintelor Biomedicale ” Victor Babes”

 

 

 

 

 

 

 

 

Rezumatul primei faze de studiu

 

Profilaxia tetanosului in Romania, realizata in special prin imunizarea in masa a intregii populatii a dus la o scadere spectaculoasa a morbiditatii si mortalitatii.

Metoda consta in combinatia profilaxie specifica active cu VTA(vaccin titanic adsorbit) , profilaxie specifica pasiva- serul antitetanic. In scop profilactic se aplica in cazul plagilor tetanigene, la cei nevaccinati antitetanic, la cei vaccinati incomplete, precum si la cei cu antecedente vaccinale nesigure ser antitetanic purificat si concentrat pe cale subcutanata, in dozele recomandate , vaccinare de urgenta cu vaccin titanic adsorbit (VTA) si tratament cu antibiotice. In scop terapeutic se foloseste aceeasi combinatie ser antitetanic purificat si concentrate si vaccine titanic adsorbit. Antigenul folosit pentru obtinerea vaccinului antitetanic si a serului antitetanic este anatoxina tetanica nativa. Anatoxina – preparat obtinut dintr-o toxina bacteriana prin actiunea formolului si a caldurii si care si-a pierdut puterea toxica , pastrand proprietatile anigenice si imunizante.

In 1896 van Ermengem,in cursul unei intoxicatii alimentre cu carnati izoleaza germenul incriminat pe care l-a numit C.botulinum. In mod paradoxal, aceste toxine sunt utilizate pentru tratamentul maladiilor caracterizate printr-o hiperactivitate musculara sau pentru a suprima ridurile. Toxina botulinica la om are ca si toxina tetanica , neurotropism exclusive. Mecanismul sau de actiune consta in blocarea transmiterii nervoase , prin inhibarea secretiei de acetilcholina. La animalul de laborator injectarea intraperitonela a toxinei produce o paralizie flasca a trenului posterior, care evolueaza ulterior spre moarte in lipsa administrarii antitoxinei. Toxina botulinica este cea mai puternica otrava cuscuta la acesta ora. 1mg de toxina pura poate provoca moartea a 40 miliarde de soareci

Substanţa activă pentru prepararea Serului nativ anticărbunos o constituie globulinele antitoxice obţinute prin hiperimunizarea animalelor cu tulpinia B. anthracis 34 F₂ (Sterne). Administrarea globulinelor specifice, anti B. anthracis, induc protecţie imună pasivă prin neutralizarea exotoxinelor în infecţia cărbunoasă.

Totusi, având în vedere cã productia vaccinului gripal este laborioasã, consumatoare de timp, dependentã aproape în totalitate de ouã embrionate, si cã rezistenta la antivirale, chiar si la inhibitorii de neuraminidazã se instaleazã destul de rapid (2), alte directii sunt luate în studiu, cum este imunoterapia. Scopul studiului din aceastã etapã a fost de a obtine si a caracteriza o suspensie de virus gripal A/H5N1, întreg, purificat si inactivat pentru imunizarea animalelor în vederea producerii de seruri specifice terapeutice cu componentã activã F(ab’)₂.

Virusul gripal este agentul cauzal al uneia dintre cele mai frecvente boli respiratorii severe la om, cu rãspândire globalã. În cadrul tipului A al virusului gripal, numai subtipurile H1N1, H2N2, H3N2 au determinat pandemii în secolul precedent dar toate cele 16 subtipuri de hemaglutininã (HA) si 9 de neuraminidazã (NA) sunt mentinute în populatii de pãsãri acvatice care reprezintã rezervorul lor natural. Aceste virusuri aviare nepatogene se pot transforma, adesea, în virusuri înalt patogene, virulenta fiind poligenicã dar se pare cã rolul major îl are HA.

Analiza fiecarei aplicatii este expusa pe larg in proiect.

Titlul Proiectului: CERCETARI DE GENOMICA SI PROTEOMICA IN PATOGENIA SCLEROZEI SISTEMICE IN VEDEREA DESCHIDERII DE NOI PERSPECTIVE TERAPEUTICE

 

Acronimul proiectului: SScHELP

Contract nr: 41-021/2007

Programul: PN-II – Parteneriate in domeniile prioritare

Tipul Proiectului: PC

Durata proiectului: 3 ani

Data inceperii proiectului: 2007

Data finalizarii proiectului: 2010

Valoarea totala a proiectului: 2.000.000 lei

Finantare de la buget: 2.000.000 lei

 

Autoritatea contractanta (finantatoare a proiectului): Centrul National de Management Programe

Institutia coordonatoare: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino

Director de proiect: Dr. Cristiana Matache (cristianamatache@cantacuzino.ro)

 

Componenta consortiului:

P1: Spitalul Clinic Sfanta Maria

Responsabil stiintific: Conf. Dr. Denisa Predeteanu (dpredet@rdslink.ro)

 

P2: Universitatea de Medicina si Farmacie “Carol Davila” „Centrul de cercetare in patologia si tratamentul bolilor sistemice reumatismale” – RCRD

Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Ruxandra Ionescu (ruxandraionescu1@gmail.com)

 

P3: Universitatea Politehnica Bucuresti, Facultatea de Chimie Aplicata si Stiinta Materialelor

Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Ioana Jitaru (ioanajitaru2002@yahoo.com)

 

Rezumat:

Proiectul are ca scop elucidarea unor mecanisme moleculare implicate in disfunctiile celulare observate la pacientii cu Scleroza Sistemica. Scleroza sistemica (scleroderma, SSc) este o boala autoimuna caracterizata prin deteriorari microvasculare si fibroza la nivelul dermei si organelor interne. In pofida multiplelor eforturi pentru studierea mecanismelor etiopatologice SSc ramane o boala incomplet elucidata care inca asteapta raspunsuri privind diagnosticul precoce, dezvoltarea si propagarea bolii dar mai ales terapia.

In ultimii ani, cercetatori din intreaga lume si-au dedicat eforturile sperand sa identifice: cuza/cauzele bolii, mecanismele celulare si moleculare care guverneaza aceasta patologie, noi biomarkeri si tinte terapeutice, terapii cat mai adecvate si mai tintite. Printre multiplele defecte identificate in SSc rolul celulelor T si al monocitelor infiltrate in leziunile tisulare din SSc este unanim acceptat. La acest nivel, prin secretia de factori profibrotici si activarea fibroblastelor are loc producerea anormala de colagen sau alte proteine de matrice extracelulara. In timp ce rolul celulelor T in dezvoltarea fibrozei asociate SSc a fost intens studiat, rolul celulelor B a fost subevaluat chiar daca s-a observat ca aceste celule sunt in stare de activare cronica si sunt capabile sa produca autoanticorpi specifici acestei boli autoimune. Terapiile aplicate pana in prezent, in general, incearca sa amelioreze consecintele bolii. Totusi, descoperirea multiplelor defecte celulare si moleculare la pacientii cu SSc a deschis orizontul spre terapii promitatoare care au ca tinta celulele T si B, receptorii lor, moleculele implicate in semnalizare sau mediatorii celulari solubili.

Recent, descoperirea unei noi clase de proteine apartinand familiei de semaforine si demonstrarea rolului acestei clase in activarea celulelor T si B ne-a condus la dezvoltarea acestui proiect prin care se urmareste: (1) elucidarea implicarii semaforinelor si a receptorilor lor in cooperarile dintre diferite populatii celulare ale sistemului imun ca si dintre celulele imune si non-imune, in scopul identificarii de noi tinte terapeutice pentru pacientii cu SSc (Etapele I si II); (2) elaborarea unor metode de proteomica si genomica in scopul identificarii de biomarkeri cu potential de diagnostic si/sau prognostic pentru pacientii cu SSc (Etapele III si IV); (3) analiza in vitro si in vivo (pe un model murin de SSc umana) a eficacitatii unor inhibitori asupra expresiei si secretiei de semaforine (Etapa V).

 

Stadiul proiectului: finalizarea etapei IV

 

Rezultatele studiilor derulate pana in prezent (Etapele I, II, III, IV)

            Analiza comparativa prin citometrie de flux (FACS) a celulelor mononucleare periferice (PBMCs) izolate de la pacienti cu SSc, cu Lupus Eritematos Sistemic (LES) si donatori sanatosi a aratat:

-          pacientii cu SSc prezinta cel mai crescut procent de celule T CD4⁺ care exprima nivele crescute de semaforina 4D (sema4D/CD100);

-          procentul de celule T CD4⁺CD100^high este mai mare decat cel de celule T CD8⁺CD100^high independent de procentele de celule T CD4⁺ sau CD8⁺ si de grupul investigat ;

-          raportul CD4⁺CD100^high/CD8⁺CD100^high este semnificativ mai mare in cazul pacientilor cu SSc (2.04±1.80) comparativ cu donatorii sanatosi (1.14±0.61);

-          procentele de celule T CD100^high nu sunt crescute/scazute si pentru pacientii cu LES, cu toate ca LES este considerat prototip de boala autoimuna sistemica;

-          PBMCs pacientilor cu SSc, aproape similar cu cele ale donatorii sanatosi, contin aproximativ 1% celule B CD19⁺CD100^high in timp ce PBMCs pacientilor cu LES au un procent semnificativ redus (~ 0.37%);

-          ponderea celulelor B CD72⁺ in populatia de celule B CD19⁺ periferice este semnificativ redusa in cazul pacientilor cu LES, ceea ce-i diferentiza semnificativ de donatorii sanatosi;

-          serurile pacientilor cu SSc contin nivele crescute de CD100 solubil (sCD100);

-          41,94% din serurile pacientilor cu SSc, 0% din serurile pacientilor cu LES si 9.09% din cele ale donatorilor sanatosi pot fi considerate pozitive pentru sCD100 in raport cu valoara de cut-off definita ca fiind egala cu valoarea medie + 2 x deviatia standard obtinuta pentru donatorii sanatosi;

-          in cazul pacientilor cu SSc, nivelele serice de sCD100 nu se coreleaza cu procentele de celule T si B CD100^high;

-          procentele crescute de celule T CD3⁺CD100^high sunt o caracteristica a pacientilor cu SSc cu boala mai veche de 2 ani, cu anticorpi anti-Scl70 pozitivi sau cu proces inflamator activ (VSH > 30 mm/h, CRP > 1 mg/dl). De asemenea, pacientii cu forma difuza a bolii sau cu boala interstitiala pulmonara (BIP) au cele mai mari rapoarte CD4⁺CD100^high/CD8⁺CD100^high (~ 2.5±2);

-          nivele serice crescute de sCD100 caracterizeaza pacientii cu SSc care prezinta BIP sau proces inflamator activ (VSH, CRP crescute);

-          procente crescute de celule B care supraexprima CD19 (mediator al semnalelor pozitive de activare celulara) sunt o caracteristica a pacientilor cu SSc cu scor Rodnan modificat > 14 (afectare cutanata severa);

-          un procent redus de celule B CD19⁺CD72⁺ caracterizeaza pacientii cu SSc care au prezenti anticorpii anti-centromer.

            Prin cultivarea ex vivo a PBMCs, in conditii de stimulare specifica celulelor T, s-a remarcat numai in cazul pacientilor cu SSc o crestere semnificativa a procentelor de celule T CD8⁺CD100^high si B CD19⁺CD100^high. Cresterea frecventei celulelor T CD8⁺CD100^high este insotita de cresterea nivelelor de sCD100 si IgG in supernatantele de cultura dar si de reducerea procentelor de celule B CD19⁺CD72⁺. Cu toate acestea, numai intre procentele de celule T CD8⁺CD100^high si nivelul de sCD100 exista o corelatie directa semnificativa.

Aceasta observatie a sugerat ca prin activare si expresia crescuta a receptorului CD100 celulele T CD8⁺ isi pierd capacitatea de supresie asupra celulelor B, probabil prin interactia contrareceptorilor CD100, exprimati de celulele T, si CD72, exprimati de celulele B; in acest mod blocandu-se semnalele negative din caile de activare a celulelor B.

            Rezultatele obtinute pana in prezent stau la baza unui nou concept privind rolul jucat de CD100 si/sau sCD100 in dezvoltarea unor procese patologice la nivel tisular local, a unor procese inflamatorii sau in dezvoltarea unui raspuns imun nepotrivit (autoimunitate) din SSc.

 

Valorificarea rezultatelor obtinute pana in prezent:

 

Publicatii:

1. Role of cellular immunity in Systemic Sclerosis pathogenesis: update on CD4+T cells population studies. Alina Nicoleta Besliu, Leontina Mirela Banica, Ruxandra Ionescu, Denisa Predeteanu, Crina Stavaru, Carmen Maria Marica, Cristina Chitonu, Gina Pistol, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2009, 68 (1): 5-13

Comunicari:

Congrese/conferinte internationale:

1. Semaphorin 4D involvement in Systemic Sclerosis; Alina Besliu, Leontina Banica, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Carmen Marica, Cristina Chitonu, Gina Pistol, Violeta Vlad, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 3rd conference Adaptive Immunity and the Pathogenesis of Rheumatic Diseases; September 24-27, 2009, Genova, Italy
2. The role of CD100 and CD72 in the cooperation between peripheral T and B cells from Systemic Sclerosis patients; A. Besliu, C. Marica, L. Banica, D. Predeteanu, R. Ionescu, C. Stavaru, V. Vlad, M. Stefanescu & C. Matache; 2nd European Congress of Immunology; september 13-16, 2009, Berlin, Germany, European Journal of Immunology, 2009, Vol. 39(S1), Pg. S235
3. CD100 expression level on peripheral blood T and B cells from patients with Systemic Sclerosis, C. Matache, A. Besliu, L. Banica, D. Predeteanu, R. Ionescu, C. Marica, L. Varzaru & M. Stefanescu, 6th International Congress on Autoimmunity, September 10-14, 2008, Porto/Portugal, Abstract 289
4. Effects of some cellular and molecular defects on anti-DNA topoisomerase I antibodies production in Systemic Sclerosis patients . M. Stefanescu, L. Banica, A. Besliu, G. Pistol, C. Stavaru, R. Ionescu, A.M. Forsea, C. Tanaseanu, S. Dumitrache, D. Otelea, M. Balteanu & C. Matache, 6th International Congress on Autoimmunity, September 10-14, 2008, Porto/Portugal, Abstract 290

Congrese/conferinte nationale:

1. Soluble Semaphorin 4D role in Systemic Sclerosis. Alina Besliu, Leontina Banica, Cristina Chitonu, Carmen Marica, Gina Pistol, Denisa Predeteanu, Violeta Vlad, Ruxandra Ionescu, F. Berghea, Crina Stavaru, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 39th National Conference of Immunology – Calimanesti-Caciulata, 24-26 September 2009, Abstract 17
2. Are matrix metalloproteinases responsable for the high level of serum sCD100 in patients with Systemic Sclerosis? Alina Besliu, Leontina Banica, Denisa Predeteanu, Violeta Vlad, Ruxandra Ionescu, Maria Stefanescu & Cristiana Matache; 38th National Conference of Immunology – Calimanesti-Caciulata, 24-26 September 2009, Abstract 18
3. CD100 a potential marker for Systemic Sclerosis. Alina Besliu, Leontina Banica, Carmen Marica, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Crina Stavaru, Cristiana Matache & Maria Stefanescu, NIRDMI „Cantacuzino” Annual scientific conference, 14-15 january 2009, Bucharest
4. CD72 expression and molecular analysis in Systemic Sclerosis. Carmen Marica, Leontina Banica, Alina Besliu, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu, Crina Stavaru, Maria Stefanescu & Cristiana Matache, NIRDMI „Cantacuzino” Annual scientific conference, 14-15 ianuary 2009, Bucharest
5. CD100 and CD72 expression level on peripheral blood T and B cells from patients with Systemic Sclerosis. A. Beşliu, L. Bănică, D. Predeţeanu, R. Ionescu, C. Marica, C. Stăvaru, L. Vărzaru, M. Ştefănescu & C. Matache, 38th National Conference of Immunology- Busteni, 24-26 September 2008
6. Cellular and molecular defects observed in Systemic Sclerosis patients could explain anti-DNA topoisomerase I antibodies production, A. Beşliu, L. Bănică, G. Pistol, C. Stăvaru, R. Ionescu, A.M. Forsea, C. Tănăseanu, S. Dumitrache, D. Oţelea, M. Bălteanu, C. Matache & M. Ştefănescu, 38th National Conference of Immunology- Busteni, 24-26 September 2008

Proiect 41-004

Acronim: iMod@CANCER

Strategii interventionale de modulare a inflamatiei si imunosupresiei implicate in progresia tumorala: studii experimentale si corelatii clinice

Director Proiect: Dr. Aurora Salageanu

Parteneri :
UMF “Carol Davila” din Bucuresti, Clinica ORL-CCF, Spitalul Clinic “Sf. Maria”
Institutul Oncologic “Prof. Dr. Al. Trestioreanu” Bucuresti
Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti, Clinica Chirurgie II

Progresele recente in domeniul imunologiei tumorale au impus schimbarea viziunii asupra interactiei gazda-tumora, care se dovedeste a fi un proces dinamic complex, in care initial sistemul imun actioneaza in sensul eliminarii tumorii (“elimination”), apoi se instaleaza un echilibru intre eliminare si cresterea tumorala (“equilibrium”), pentru ca in final cresterea tumorala sa prevaleze (“tumor escape”). Pe parcursul acestui proces are loc “imunoeditarea” celulelor tumorale: cele imunogene sunt rapid eliminate, selectandu-se celulele tumorale slab imunogene, rezistente la apoptoza, capabile de a supravietui in conditii nefavorabile (ex: hipoxie) – mecanism oarecum similar selectarii bacteriilor rezistente sub actiunea antibioterapiei. Aceasta “editare” este insa reciproca, celulele tumorale intervenind activ asupra sistemului imun pentru a induce o toleranta specifica, care evolueaza spre imunosupresia globala in stadiile finale. Numeroase date epidemiologice si experimentale au dus de asemenea la revalorizarea ipotezei avansate de Virchow in urma cu 2 secole, potrivit careia inflamatia cronica poate contribui la cresterea si progresia tumorala. Pe de alta parte, initierea oricarui raspuns imun eficient implica interventia mediatorilor inflamatori. Acest rol “duplicitar” situeaza inflamatia in centrul interactiei celula tumorala-micromediu-sistem imun.

Scopul proiectului este reprezentat de studierea relatiei complexe intre tumora si sistemul imun, in mod particular a rolului dual al inflamatiei ca mecanism prin care tumora fie este eliminata, fie scapa de supravegherea imuna si/sau induce imunosupresie. Principalele obiective ale proiectului sunt:

- studiul implicarii inflamatiei in progresia tumorala si metastazare

- caracterizarea imunosupresiei induse de tumora si evidentierea mediatorilor acesteia

- integrarea informatiilor obtinute in vederea identificarii unor potentiale tinte terapeutice

- evaluarea oportunitatii imunoterapiei si identificarea “ferestrei” terapeutice optime pentru aplicarea acesteia

- aplicarea rezultatelor obtinute in protocoale de evaluare a pacientilor cu diferite tipuri de cancer pentru identificarea unor noi markeri prognostici si/sau de monitorizare terapeutica

Rezultatele estimate ale proiectului sunt:

- identificarea de mediatori ai inflamatiei si imunosupresiei asociate cancerului

- caracterizarea mecanismelor inflamatorii implicate in interactia tumora-micromediu-sistem imun care pot conduce fie la un raspuns imun antitumoral eficient, fie la cresterea si progresia tumorala

- identificarea unor potentiale tinte terapeutice la nivelul acestor mecanisme

- identificare de parametri cu valoare prognostica pentru depistare precoce, evolutie sau metastazare

- caracterizarea mecanismelor implicate in rezistenta la terapia actuala

Etapa I (raportare 14 decembrie 2007): Model de studiu al impactului sistemic al mediatorilor inflamatiei in cancer

In aceasta etapa, a fost realizat un studiu al datelor din literatura de specialitate pentru a identifica stadiul actual al cunoasterii rolului diferitilor mediatori in relatia complexa intre sistemul imun si tumora. Aceasta va permite integrarea rezultatelor activitatilor de cercetare ce se vor desfasura in etapele ulterioare ale proiectului in directiile de cercetare existente pe plan international.

De asemenea, ca o etapa preliminara, a fost elaborata documentatia referitoare la particularitatile clinice si epidemiologice ale tipurilor de cancer luate in studiu si s-au definit criteriile de includere in studiu precum si fisa de urmarire clinica a pacientilor.

Criteriile de includere in studiu:

· Diagnostic clinic confirmat prin examen histopatologic (adenocarcinom colorectal, carcinom scuamos celular laringian, carcinom bronhopulmonar)

· Stadiul TNM: T1-T4, N0-N2, M0-1

· Tumora rezecabila chirurgical (nu si in cazul cancerelor bronhopulmonare)

· Varsta peste 18 ani indiferent de sex

· Nr. leucocite: > 3×109/l

· Nr. trombocite: > 100×109/l

· Hb: > 10 g/l

· Creatinina serică < 1,4mg/ l

· Enzimele hepatice < de trei ori valoarea normală

· Pacienti fara tulburari psihice

· Consimtamant informat din partea pacientului

· Posibilitatea pacientului de a mentine legătura cu medicul pe tot parcursul studiului

· Status de performanta care sa permita participarea in studiu (ex: ECOG £ 2)

Criteriile de excludere:

· Pacienti ce nu consimt sa participe la studiu

· Tratament radioterapic, chimioterapic in antecedente

· Pacienti cu boli autoimune

· Boli cronice care necesită un tratament permanent (la aprecierea investigatorului)

· Pacienti cu Ag HBs, Ac anti HVc, HIV pozitiv

· Prezenta unei alte tumori (antecedente sau concomitent)

· Tratament cu imunosupresoare / imunostimulatoare

· Recidiva

· Status de performanta care nu permite participarea in studiu

· Boli psihice care împiedica cooperarea cu pacientul

· Graviditatea sau alaptarea

Pentru a facilita comunicarea intre parteneri si a asigura un bun acces la rezultatele

obtinute in cadrul proiectului a fost elaborata o baza de date cu acces extern restrictionat (username si parola). Baza de date este construita pe un server dedicat Apache 2.2.4 cu extensii MySQL 5.0.45 si php 5, instalat pe un sistem Linux/Suse 2.6.22.13-0.3. Accesul si introducerea datelor se pot realiza din orice browser de Internet (Internet Explorer, Firefox etc). Fiecare partener este automat directionat catre partea ce ii revine din baza de date, pe baza username-ului propriu. Coordonatorul proiectului va avea acces la toata baza de date.

A fost de asemenea elaborata metodologia de determinare a mediatorilor sistemici ai inflamatiei prin analiza comparativa a metodelor si tehnicilor aplicabile diferitilor parametri ce urmeaza a fi masurati, pentru optimizarea activitatilor de cercetare.

Etapa II (raportare 30.11.2008):

Activitati desfasurate:

-       II.1 Elaborarea metodologiei de izolare si cultivare a celulelor tumorale de la pacienti si de evidentiere a macrofagelor asociate tumorii (TAM)

-       II.2 Realizarea modelului experimental de determinare a mediatorilor secretati de celulele tumorale si celulele imune (cultura sau co-cultura)

-       II.3 Elaborarea modelului experimental de izolare si disociere a microveziculelor din singele periferic al pacientilor

-       II.4 Realizarea modelului  experimental de izolare si caracterizare a microveziculelor din singele periferic al pacientilor

-       II.5 Demonstrarea functionalitatii modelului de studiu al  microveziculelor pe culturi celulare

Rezultatele obtinute s-au concretizat in:

1. Metoda optimizata de izolare si cultivare a celulelor tumorale
2. Model experimental de evidentiere a pattern-ului de citokine secretate de celulele imune izolate de la pacienti cu cancer
3. Model experimental de obtinere a macrofagelor tip M1 si M2 prin diferentierea monocitelor
4. Metoda de studiu a influentei factorilor secretati de tumora (citokine, microvezicule) asupra functiilor celulelor imune

Aceste rezultate au condus la realizarea obiectivului specific al fazei de executie si vor fi folosite in etapele ulterioare ale proiectului pentru studierea relatiei complexe intre tumora si sistemul imun.

 

Rezultatele au fost valorificate prin urmatoarele lucrari stiintifice:

 

Publicatii

 “Primary cell culture of human adenocarcinomas – practical considerations”, Lucian Lerescu, Catalin Tucureanu, Iuliana Caras, Stefan Neagu, Laura Melinceanu, Aurora Salageanu, Roum  Arch Microbiol Immunol, 2008, 67(3-4), 5-16, ISSN 1222-3891, PMID: 19496473 [PubMed - indexed for MEDLINE]

 

Comunicari

1. „Cytokine secretion pattern of peripheral blood mononuclear cells isolated from colon cancer patients undergoing surgery”, autori: Lerescu L., Tucureanu C., Neagu S., Costea R., Gangura G, Boghean Raluca,  Iana G., Caras Iuliana and Salageanu Aurora, 5^th Balkan Congress of Immunology, June 01-03, 2008, Ohrid, Macedonia
2. „Systemic cytokine and chemokine profile in colon cancer patients undergoing surgery”, autori: Tucureanu C., Lerescu L.,Neagu S., Costea R., Gangura G, Boghean Raluca,  Iana G., Caras Iuliana and Salageanu Aurora, 5^th Balkan Congress of Immunology, June 01-03, 2008, Ohrid, Macedonia
3. “Modificari imunologice perioperatorii la pacientii cu cancer colorectal:  Mediatori solubili si efectori celulari la nivel sistemic”, C. Ţucureanu, R. Boghean, L. Lerescu, S. Neagu, G. Gangura, R. Costea, M. Panescu, G. Iana, A. Salageanu, Al IV-lea Simpozion “Acad. Nicolae Cajal”, 26-28.03.2008
4. “Le profil immunologique des patients avec cancer laryngien pre et post laryngectomie total”, Laura Melinceanu, D.Sarafoleanu, L. Lerescu, C. Tucureanu, Iuliana Caras, Aurora Salageanu, IXeme Congres de la Societe Internationale Francophone d’ORL et de Chirurgie Cervicofaciale, 07-09.11.2008, Marrakech, Maroc

Etapa III (raportare 31.08.2009):

Activitati desfasurate:

-       III.1. Elaborarea modelului experimental de studiu al celulelor supresoare de origine mieloida – date experimentale

-       III.2. Participare la manifestari tehnico-stiintifice nationale/internationale din domeniul imunologiei si oncologiei

Rezultatele obtinute s-au concretizat in :

1. Studiul profilului imunologic al pacientilor cu cancer laringian supusi interventiei chirurgicale
2. Studiul rolului fumatului asupra mediatorilor imuni la pacientii cu cancer de laringe
3. Studiul mediatorilor solubili ai imunosupresiei tumorale (citokine, factori de crestere) la pacientii cu cancer operati
4. Studiul celulelor de origine mieloida ca efectori ai imunosupresiei exercitate de tumora
5. Model de studiu al influentei factorilor secretati de celulele tumorale asupra fenotipului functional al macrofagelor asociate tumorii

In aceasta etapa, au fost elaborate urmatoarele metode, aplicabile in studiul interactiei dintre tumora si sistemul imun:

1. Metoda de determinare a citokinelor din ser (folosind tehnologia XMap, aplicata pe platforma Luminex) – folosita la identificarea citokinelor imunosupresoare din serul pacientilor cu cancer colorectal/laringian
2. Metoda de imunofenotipare al celulelor imature de origine mieloida (folosind metoda citometriei in flux) – folosita la identificarea celulelor MDSC la pacienti cu cancer bronhopulmonar/ laringian
3. Metoda de diferentiere a liniei celulare THP-1 in macrofage cu fenotipuri functionale diferite – folosita pentru studiul influentei factorilor secretati de celulele tumorale asupra fenotipului functional al macrofagelor asociate tumorii

            Aceste rezultate au condus la realizarea obiectivului specific al fazei de executie si vor fi folosite in etapele ulterioare ale proiectului pentru studierea relatiei complexe intre tumora si sistemul imun.

Rezultatele au fost valorificate prin urmatoarele lucrari stiintifice:

 

Publicatii:

 

1. “Impact of smoking on immunological profile of patients with laryngeal carcinoma” autori: Laura Melinceanu, L. Lerescu, C. Ţucureanu, Iuliana Caraş, Aurora Sălăgeanu, C. Sarafoleanu, Journal of Medicine and Life, , II(2) April-June 2009
2. “Serum perioperative profile of cytokines in patients with larynx squamous cell carcinoma”, autori: Laura Melinceanu, Lucian Lerescu, Catalin Tucureanu, Iuliana Caras, Ramona Pitica, Codrut Sarafoleanu, Aurora Salageanu, Head and Neck (trimisa spre publicare, cod manuscris HED-09-0413)

 

Comunicari:

 

1. “Primary tumor cells for in vitro  modeling of the tumor environment” autori: Lucian Lerescu, Catalin Tucureanu, Iuliana Caras, Laura Melinceanu, Stefan Neagu, Ramona Pitica, Aurora Salageanu (comunicare orala la Sesiunea Stiintifica a INDMI “Cantacuzino”, 14-15 ianuarie 2009)
2. “Macrophage activation switching in the presence of tumor cells supernatants” autori: Iuliana Caras, Lucian Lerescu, Catalin Tucureanu, Ramona Pitica, Aurora Salageanu (comunicare orala la Sesiunea Stiintifica a INDMI “Cantacuzino”, 14-15 ianuarie 2009)

Evaluarea profilului molecular al virusului gripal privind rezistenta la antivirale si relevanta clinica a acestuia

Acronim proiect: AVRI

Contract nr: 41-003/14.09.2007

Director proiect: Dr. Viorel Alexandrescu

Coordonator proiect: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie Cantacuzino Bucuresti,

Parteneri:

1) Institutul National de Boli Infectioase Prof.Dr.Matei Bals, Bucuresti

2) Spitalul de Boli Infectioase si Tropicale Dr. Victor Babes, Bucuresti

Proiectul are scopul de a evalua profilul molecular al virusului gripal privind rezistenta la antivirale si relevanta clinica a acestuia in trei sezoane gripale consecutive in Romania, utilizand atat datele clinice, cat si testele de laborator, fenotipice si moleculare, genotipice. Obiectivele principale sunt: evaluarea clinica si de laborator a tulpinilor virale gripale circulante in Romania din punctul de vedere al rezistentei la antivirale deoarece studiile anterioare din literatura arata diferente uneori semnificative intre procentele si caracteristicile tulpinilor gripale rezistente la antivirale in functie de zona geografica si gradul de utilizare al antiviralelor; caracterizarea acestor tulpini din punct de vedere fenotipic (evolutie clinica, caracterizare antigenica, multiplicare virala, incarcatura virala, concentratie inhibitorie a activitatii neuraminidazei s.a.) si genotipic (caracterizare moleculara virala, secventiere gene virale relevante, detectie mutatii relevante); stabilirea relevantei clinice a profilului molecular; estimarea implicatiilor epidemiologice ale rezultatelor fundamentale si statistice; aplicarea rezultatelor obtinute in scopul determinarii gradului de necesitate al monitorizarii in Romania a rezistentei la antiviralele existente in prezent, a nevoii de noi agenti terapeutici/profilactici si impactului asupra strategiilor de management si control al infectiei gripale sezoniere si pandemice.

Rezultatele estimate ale proiectului sunt: detectarea tulpinilor virale gripale rezistente la medicatia antivirala existenta in prezent; evaluarea clinica si paraclinica a bolii determinate de virusurile gripale circulante; izolarea, identificarea si caracterizarea antigenica si enzimatica a acestor tulpini; detectarea prin metode moleculare si cuantificarea virusurilor gripale in probele de la pacientii infectati inainte si dupa tratament, caracterizarea moleculara si secventierea virusurilor gripale izolate de la pacienti, analiza legaturii intre profilul clinic-paraclinic si profilul molecular al virusurilor gripale in functie de susceptibilitatea la antivirale, caracterizarea mecanismelor implicate in rezistenta la terapia actuala, identificarea de parametri semnificativi in evaluarea impactului celorlalte rezultate

Prin tematica abordata, proiectul se incadreaza in directia de cercetare 4. Sanatate, prioritatea tematica 4.1.3 Metode de investigaţie şi intervenţionale bazate pe medicina moleculară şi celulară, genomică şi proteomică din Planul National de Cercetare Dezvoltare si Inovare II, Programul Parteneriate, deoarece:

1. gripa reprezinta o problema majora de sanatate publica cu un important impact socio-economic

2. studiul propus implica folosirea unor metode si tehnici specifice medicinei moleculare si celulare

3. rezultatele estimate ale cercetarii vor putea fi folosite in conturarea unei noi abordari in investigarea si evaluarea eficientei strategiilor de management si control al infectiei gripale.

4. gradul inalt de complexitate si interdisciplinaritate al activitatilor propuse impun constituirea unui parteneriat format din specialisti de cea mai inalta competenta din domenii complementare ale cercetarii si practicii medicale (specialisti in boli infectioase, medici de laborator – virusologi, specialisti in medicina moleculara)

Impactul proiectului este major in aria de cercetare medicala atit nationala cit si internationala domeniul abordat reprezentand o prioritate tematica la nivel mondial, (de ex in Programul Cadru 7 FP7-HEALTH-2007). Proiectul va fi realizat prin colaborarea a trei institutii de cercetare medicala din Romania:
Promotorul Proiectului: Institutul National de Cercetare Dezvoltare in Microbiologie si Imunologie Cantacuzino (IC), cu experienta in cercetare fundamentala si aplicata in domeniul microbiologiei, virusologiei si medicinii moleculare
Institutul de Boli Infectioase Prof.Dr.Matei Bals, Bucuresti
Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale Dr.Victor Babes Bucuresti

Obiectivele fazei de executie I:

 

Obiectivul specific: Elaborarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de antivirale Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor partiale: analiza datelor din literatura privind susceptibilitatea si rezistenta virusului gripal la antivirale,  elaborarea documentatiei referitoare la criteriile de selectie, de formare a loturilor de pacienti tratati cu antivirale (fiecare lot – un antiviral – amantadina, oseltamivir, zanamivir, compusi noi– si un lot martor) si a fisei de urmarire a pacientilor si elaborarea metodologiei de evaluare clinica a pacientilor, recoltare probe biologice si evaluare virusologica a tulpinilor de virus gripal detectate si izolate din punct de vedere al relatiei cu antiviralele.

 

Rezumatul fazei I

Faza I a proiectului a reprezentat elaborarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de antivirale, ceea ce a semnificat in primul rand activitate de documentare, de analiza a informatiilor existente la ora actuala in privinta temei si obiectivelor proiectului si de selectare a elementelor relevante pentru succesul studiului, urmate de sinteza metodologiei care va fi utilizata pentru atingerea tuturor obiectivelor proiectului.

Pe scurt, ideile principale desprinse din analiza literaturii sunt:

-          Antiviralele sunt un element important in strategia luptei impotriva infectiilor gripale deoarece:

o   nu toata populatia se vaccineaza impotriva gripei;

o   vaccinurile gripale nu confera protectie de 100% impotriva infectiei gripale

o   cazurile moderate si severe sau cele cu potential de a dezvolta complicatii au foarte mult de beneficiat de la terapia antivirala

o   in primele faze ale unei pandemii antiviralele reprezinta una din cele mai importante componente ale actiunilor de limitare a morbiditatii, mortalitatii si efectelor socio-economice ale gripei.

-          Virusurile gripale pot si o parte din ele au si dezvoltat rezistenta fata de antivirale.

-          In prezent exista 2 grupe de substante folosite impotriva virusului gripal: inhibitorii de canal ionic M2 (amantadina, rimantadina), eficienti impotriva gripei A, si inhibitorii neuraminidazei (zanamivir, oseltamivir si, aflat in studii, peramivir), eficienti atat impotriva gripei A cat si B

-          Rezistenta virusului gripal la amantadina si rimantadina, inhibitori de canale ionice M2, poate aparea rapid in timpul tratamentului iar studiile de pana acum indica un nivel crescut al procentului de tulpini rezistente fata de ele.

-          Studiile anterioare au aratat  aparitia rezistentei virale si fata de zanamivir si oseltamivir, inhibitori de neuraminidaza, chiar daca este vorba de un procent redus pana in prezent

-          Rezistanta fata de antivirale poate fi monitorizata prin metode fenotipice si prin metode genotipice (secventiere)

-          Testarea prin secventiere este mai raspandita decat analiza fenotipica a susceptibilitatii la inhibitori de neuraminidaza (INA) dar aceasta din urma este necesara pentru evaluarea completa a rezistentei la INA, in primul rand pentru ca pana in prezent au fost descrise doar un numar limitat de mutatii care confera rezistanta la INA si este probabil ca exista si altele care pot aparea.

-          In ce priveste susceptibilitatea la amantadine insa, expertii europeni au concluzionat ca este suficianta utilizarea metodelor de testare genotipica, deoarece ralatia genotip-fenotip a proteinei M2 este absolut predictibila.

-          Esentialul metodologiei folosite de prezentul proiect pentru studierea  profilului molecular al virusului gripal privind rezistenta la antivirale si relevanta clinica a acestuia este:

o   Loturile care se vor constitui vor fi:

§  un lot de pacienti tratat cu amantadina; in acest lot vor fi inclusi doar adulti

§  un lot de pacienti tratat cu oseltamivir; in acest lot vor fi inclusi adulti si copii peste varsta de 1 an;

§  un lot de pacienti tratat cu zanamivir; in acest lot vor fi inclusi adulti si copii paste varsta de 12 ani.

§  un lot de pacienti netratati.

§  optional: un lot cu antiviral nou introdus pe piata

o   Toate datele relevante ale pacientului vor fi consemnate in fisa de supraveghere clinica si vor fi apoi inregistrate intr-o baza de date electronica centralizata, accesibila fiecarui partener, impreuna cu datele virusologice obtinute din testele de laborator.

o   Prelevarea probelor (exudat faringian/nasofaringian) de la pacienti se realizeaza cu ajutorul tamponului faringian/nasofaringian.

o   Probele prelevate vor fi in numar de trei: una la prezentarea la medic, una la 48 ore dupa inceperea tratamentului viral (48 ore dupa prezentarea la medic in lotul martor) si una la 5 zile de la debutul simptomelor gripale.

o   Testele de detectie si monitorizare a susceptibilitatii la antivirale care vor fi utilizate sunt:

§  pentru lotul tratat cu amantadina: secventiere a genei M

§  pentru loturile tratate cu INA: testarea activitatii enzimatice a  neuraminidazei prin metoda bazata pe fluorescenta. Tulpinile care prezinta rezistenta fenotipica vor fi secventiate (NA si HA). Tulpinile cu activitate neuraminidazica redusa vor fi testate prin chemiluminiscenta, care are o limita de detectie mai redusa, urmand ca tulpinile rezistente detectate prin aceasta metoda sa fie secventiate (NA si HA).

§  pentru lotul martor: secventiere a genei M, testarea activitatii enzimatice a  neuraminidazei prin metoda bazata pe fluorescenta.Tulpinile care prezinta rezistenta fenotipica vor fi secventiate (NA si HA). Tulpinile cu activitate neuraminidazica redusa vor fi testate prin chemiluminiscenta, care are o limita de detectie mai redusa, urmand ca tulpinile rezistente detectate prin aceasta metoda sa fie secventiate (NA si HA).

o   Datele clinice, paraclinice, virusologice si genetice vor fi analizate si se vor cauta corelatiile existente intre ele, pentru o mai buna intelegere a fenomenului rezistente virusurilor gripale fata de antivirale in contextul realitatii clinice a infectiei gripale.

Concluzii faza I

• Au fost atins obiectivul acestei faze a proiectului: elaborarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de antivirale
• Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor partiale:
  • analiza datelor din literatura privind susceptibilitatea si rezistenta virusului gripal la antivirale,
  • elaborarea documentatiei referitoare la criteriile de selectie, de formare a loturilor de pacienti tratati cu antivirale (fiecare lot – un antiviral – amantadina, oseltamivir, zanamivir, compusi noi– si un lot martor) si
  • elaborarea fisei de urmarire a pacientilor
  • elaborarea metodologiei de
    • evaluare clinica a pacientilor, recoltare probe biologice si
    • evaluare virusologica a tulpinilor de virus gripal detectate si izolate din punct de vedere al relatiei cu antiviralele.

 

Obiectivele fazei de executie II:

Obiectivul specific: Testarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de antivirale elaborat in etapa precedenta Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor partiale: recoltarea probelor de la pacienti, tratarea pacientilor cu agenti antivirali, izolarea virusurilor gripale pe culturi celulare, caracterizarea antigenica si genetica precum si caracterizarea din punct de vedere fenotipic a izolatelor.

 

Rezumatul fazei II

Faza Il a proiectului a reprezentat testarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de agentii antivirali.

In sezonul epidemic 2007-2008 au fost prelevate probe de la 51 de pacienti (exudat faringian/nasofaringian), s-a izolat virus gripal de la 40 de pacienti (23 infuenza A/H1N1 si 17 infleuenza B) restul de probe (11) au fost negative. La inceputul sezonului epidemic 2008-2009 s-au recoltat probe de la 6 pacienti, toate au fost negative. 

Izolarea virusului  s-a realizeazat pe cultura celulara MDCK (Madin Darby Canine Kidney).

Tiparea si subtiparea antigenica/genetica s-au realizat folosind reactia de hemaglutinoinhibare si  RT-PCR (standard sau real-time).

Testele de detectie si monitorizare a susceptibilitatii la antivirale care au fost utilizate:

-          pentru lotul tratat cu amantadina: secventiere a genei M

-          pentru loturile tratate cu INA:s-a testat activitatea enzimatica a  neuraminidazei printr-o metoda bazata pe chamiluminiscenta. Tulpinile care au prezintat rezistenta fenotipica au fost secventiate (NA si HA). Tulpinile cu activitate neuraminidazica redusa au fost testate prin chemiluminiscenta, care are o limita de detectie mai redusa, dupa care tulpinile rezistente detectate prin aceasta metoda au fost secventiate (NA si HA).

-          pentru lotul martor: secventiere a genei M, s-a testat activitatea enzimatica a  neuraminidazei printr-o metoda bazata pe fluorescenta. Tulpinile care au prezintat rezistenta fenotipica au fost secventiate (NA si HA). Tulpinile cu activitate neuraminidazica redusa au fost testate prin chemiluminiscenta, care are o limita de detectie mai redusa, dupa care tulpinile rezistente detectate prin aceasta metoda au fost secventiate (NA si HA).

 

Concluzii faza II

• A fost atins obiectivul acestei faze a proiectului: testarea modelului de studiu al rezistentei virusurilor gripale fata de antivirale
• Acesta s-a realizat prin atingerea obiectivelor partiale:
  • Testarea cu succes a metodei de screening fenotipic al tulpinilor rezistente la inhibitorii de neuraminidaza.
  • Caracterizare antigenica (prin tipizare HI) si genetica prin amplificare RT-PCR, secventiere si analiza mutatiilor punctiforme.

De asemenea au fost respectate componentele etice ale studiului, obtinadu-se consintamantul informat al pacinetilor pentru participarea la studiu.