Skip to content

Institutul Cantacuzino

Profesionalismul si experienta noastra pentru sanatatea dumneavoastra !
Articole in aceasta categorie:
  • Leptospiroza umana nu trebuie neglijata
  • Basic 2013-2014
  • Basic 2012 – 2013
  • Basic 2011 – 2012
  • Laborator infectii cu transmitere prin vectori si entomologie medicala
  • Ghid pandemie gripa pentru specialisti
  • Laboratorul Colectia Culturi Microbiene
  • Raport tehnic asistenta ASP jud., LAM IC
  • SINTEZA LUCRARII FAZA 2007
  • PROIECT IDEI CNCSIS 219/2007

  • Leptospiroza umana nu trebuie neglijata!

    Dr.Cerc.St. I Nicoleta Andreescu

    Centrul National de Referinta pentru Leptospirozele Umane

    I.N.C.D.M.I. “CANTACUZINO”

    1. Leptospiroza umana trebuie prezumata clinic intr-un numar mult mai mare de cazuri.

    1. Leptospiroza umana trebuie prevenita in locurile de munca cu potential ridicat de contaminare.

    1. Femeile care se pregatesc pentru sarcina trebuie controlate serologic pentru leptospiroza.

    1. Sa ne gandim si la posibilitatea leptospirozei umane de origine alimentara.

    1. Leptospiroza umana trebuie confirmata microbiologic in mod corect.

    1. Raman neprezumate clinic in primul rand, cazurile care se manifesta subclinic, deoarece bonavul nu se alarmeaza si nu se prezinta la medic.In aceasta situatie cazurile respective vor evolua ca leptospioza latenta pana in momentul la care in tesuturi va fi realizat un numar suficient de leptospire care sa determine manifestari clinice evidente.

    In al doilea rand raman neprezumate clinic cazurile non clasic simptomatice, adica cazurile cu manifestari atipice care determina medicul sa nu ia in discutie etiologia leptospirotica, cu sublinierea ca o atenta anamneza ar putea sa conduca spre aceasta.

    Exemple de cazuri atipice intalnite in Centrul Nostru, ca leptospiroza infectie primara sau ca leptospiroza latenta acutizata, cu sublinierea ca febra este invariabil prezenta: uveita anterioara si/sau posterioara; otita medie cu sau fara reactii de vecinatate si otoragie; meningoencefalita seroasa; pseudovirozele cailor respiratorii superioare in sezonul rece; pneumopatia interstitiala primara in toate sezoanele; miocardita si endocardita; simptomatologia digestiva non icterica in toate sezoanele: hemoragia digestiva superioara, abdomenul acut pseudochirurgical, colecistita acuta in competitie sau nu cu o litiaza, sindromul diareic acut in sezonul cald; avortul spontan ovular, embrionar, fetal; boala abortiva; prostatita; adenopatia inflamatorie cu diverse localizari; insuficienta renala cu diureza pastrata urmata spre covalescenta de insuficienta glomerulara cu afectarea diurezei.

    2. Locurile de munca cu potential ridicat de contaminare al salariatilor sunt: fermele de suine, bovine si animale cu blana pretioasa ; fermele agricole, in principal tractoristii si mecanicii ; abatoarele, in principal soferii care transporta animale vii, macelarii si sortatorii de organe interne ; fabricile de mancare cu capacitate mare ; adaposturile comunitare pentru animale ; adaposturile temporare pentru animale ; deratizarea si salubritatea publica ; santierele de constructii si arheologice.

    Lucratorii din aceste locuri de munca trebuie controlati anual prin teste serologice pentru prevenirea cazurilor de leptospiroza infectie primara si a cazurilor de leptospiroza latenta.

    3. Femeilor care se pregatesc pentru sarcina, in contextul mentiunilor de la punctele 1 si 2 precum si din prudenta, este indicat ca medicul de familie sau medicul specialist ginecolog sa le recomande acestora controlul serologic pentru leptospiroza.

    4. Posibilitatea unei leptospiroze umane de origine alimentara.

    Cauze: alimentele neambalate, nespalate, neprelucrate termic, depozitate in locuri accesibile rozatoarelor, cainilor si altor animale, in magaziile din subsoluri, in corturi, in baracile de pe santiere, in bucatariile de vara, ocazii cu care alimentele au putut fi contaminate cu leptospire prin intermediul urinei animalelor; ficatul, rinichii, soricul de porc, neprelucrate termic suficient, laptele de vaca, bivolita nefiert, laptele praf depozitat necorespunzator si nefiert dupa dizolvarea in apa; alimentele depozitate si prelucrate termic corespunzator, dar contaminate ulterior cu ocazia picnicului pe malul apelor, in pajistile de padure, la activitatile campului, la pescuit etc; apa de baut din puturi, din rezervoare cu crapaturi in zidarie, din recipiente casnice neacoperite, contaminata cu leptospire prin intermediul animalelor.

    Particularitati: sunt posibile imbolnavirile din cauzele enumerate mai sus chiar si in sezonul rece; cu toate ca leptospirele sunt sensibile la mediul acid, atunci cand doza infectanta este mare si expunerea este repetata, chiar si persoanele cu aciditate gastrica crescuta (consumatorii de alcool, de bauturi acidulate, de sosuri acide) pot face leptospiroza prin contaminare pe aceasta cale.

    Luand in consideratie prezentarile de la punctele 1-4 estimam ca in tara noastra raman nediagnosticate anual, minimum 400 cazuri de leptospiroza.

    Toate exemplele de mai sus nu sunt sugerate de literatura de specialitate. Ele fac parte din experienta proprie a Centrului nostru, din 1950 pana in prezent, rezultata din activitatile de diagnostic si asistenta tehnica precum si din activitatea de cercetare prin diversele teme contractate cu Academia de Stiinte Medicale in decursul anilor si care se reflecta in cele 152 de lucrari stiintifice publicate si comunicate, in monografiile si capitolele de Tratate medicale concepute de specialistii din Centrul nostru.

    5. Leptospiroza umana trebuie confirmata microbiologic in mod corect deoarece este o boala infectioasa din grupa A: spitalizare obligatorie, declarare nominala la externarea din spital, de catre acesta, Directiei de Sanatate Publica corespunzatoare domiciliului pacientului, efectuarea anchetei epidemiologice.

    In toate tarile, confirmarea microbiologica a leptospirozelor umane se efectueaza numai in Centrele Nationale de Referinta.

    Confirmarea microbiologica se efectueaza in circa 93% din cazurile de leptospiroza prin evidentierea anticorpilor umorali specifici de tip cu Seroreactia de aglutinare (RAM) care se citeste la ultramicroscop si care se efectueaza cu 17 antigene vii de tip, preparate “in house” din tulpini de referinta internationala existente in colectia Centrului nostru si care sunt circulabile in mediul inconjurator. Prelevatul de cercetat poate fi serul sanguin (in vivo) sau diversele exsudate (prelevate post mortem inainte de formolare). Aceste prelevate se pastreaza la frigider, nu la congelator. Efectuarea, citirea la ultramicroscop si interpretarea RAM dureaza maximum doua ore.

    RAM indica: a. o leptospiroza infectie acuta cu precizarea serotipului tulpinii infectante; b. o leptospiroza latenta, indiferent de durata in luni sau ani a latentei microbiene, cu precizarea serotipului tulpinii infectante; c. existenta anticorpilor anamnestici de serotip pe toata durata vietii.

    Evidentierea serotipului tulpinii infectante este importanta pentru:

    1. Medicul specialist terapeut din spital: acesta cunoscand titrul anticorpilor specifici de tip (RAM este o reactie cantitativa) va stabili corect durata tratamentului etiologic in sensul ca, un titru pozitiv mic/moderat va fi corelat cu durata tratamentului etiologic de 21-24 zile, in timp ce un titru pozitiv mare/foarte mare va fi corelat cu o durata a tratamentului etiologic mai scurta, dar nu mai mica de 10-12 zile.

    b. Medicul epidemiolog: acesta stiind serotipul tulpinii infectante va efectua o ancheta epidemiologica eficienta care trebuie sa se adreseze rezervorului natural primar si celui intermediar.

    c. Cercetator/medicul microbiolog din CNR: acesta va cunoaste in permanenta circulatia serotipurilor in natura, aceasta constituind o informatie foarte importanta pentru Centrul European de Referinta pentru Leptospirozele umane si veterinare si totodata pentru preparatorii de vaccinuri destinate animalelor domestice si de ferma.

    d. Pacient: acesta va putea fi informat de catre medicul specialist terapeut si de catre medicul epidemiolog de faptul ca, deoarece prezinta receptivitate pentru aceste microorganisme la care marea majoritate a oamenilor prezinta o puternica rezistenta naturala, va putea pe viitor sa se imbolnaveasca din nou de leptospiroza cauzata insa de un alt serotip, deoarece imunitatea dobadita prin boala (pe termen lung) este de serotip.

    In restul de circa 7% din cazuri, RAM-ul fiind negativa, deoarece in aceste cazuri nu s-a dezvoltat un raspuns imun umoral, serologia trebuie completata cu evidentierea ultramicroscopica a leptospirelor patogene, in vivo in sange si in urina, post mortem in exsudate si fragmente de organe, urmata de evidentierea leptospirelor in culturi din sange, urina, exsudate si fragmente de organe si apoi de evidentierea serotipului tulpinii infectante in RAM, cu ajutorul serurilor hiperimune de tip (preparate pe iepuri conventionali de laborator) sau cu ajutorul anticorpilor monoclonali (preparati pe soareci de diverse specii selectate in laborator); facem mentiunea ca intotdeauna in situatia descrisa mai jos la punctul 2 si variabil in situatia descrisa la punctul 3, nu este posibila evidentierea serotipului tulpinii infectante, luand in consideratie explicatiile formulate la situatiile respective. Pentru evidentierea ultramicroscopica a leptospirelor, prelevatele vor fi mentinute la temperatura camerei pana la examinare, iar cele post mortem vor fi prelevate inainte de formolare. Evidentierea ultramicroscopica a leptospirelor cu cele trei etape, dureaza minimum 72 ore.

    Intalnim cazuri cu non raspuns imun umoral in: 1. leucopenie accentuata, cu mentiunea ca dupa amelioarea acesteia, este indicata repetarea serotestarii; 2. tulpina infectanta a fost o haptena, care pierzand componenta proteica din fractiunile antigenice situate la suprafata celulei bacteriene, nu mai este capabila sa declanseze mecanismul imun umoral; mentionam ca in Centrul nostru a fost identificata o tulpina de Leptospira haptena, confirmata si de Centrul European de Referinta; 3. tulpina infectanta poate prezenta factorul de virulenta Vi care fiind situat la suprafata celulei bacteriene, va impedica dezvoltarea raspunsului imun umoral, prin mascarea totala sau partiala a fractiunilor antigenice situate de asemenea si ele la suprafata celulei bacteriene; si in literatura de specialitate din strainatate sunt comunicate cazuri infectate cu tulpini virulente, care au evolutie clinica grava, dar care sunt lipsite de o reactie imuna umorala; 4. a fost administrat un preparat de tip cortizonic pentru sustinerea functiilor vitale, cu sublinierea ca in aceasta situatie, dupa intreruperea tratamentului respectiv este indicata repetarea serotestarii.

    Evidentierea ultramicroscopica a leptospirelor in sange poate fi inlocuita cu evidentierea ADN-ului bacterian in serul sanguin prin PCR. Pentru aceasta testare prelevatul poate fi congelat. Mentionam ca, in Centrul nostru s-a experimentat in perioada 2009 – 2010 aceasta modalitate de confirmare microbiologica, care este insa limitata de faptul ca, in leptospiroza inca din primele zile se instaleaza acidoza metabolica care poate determina lizarea totala a germenilor. Din aceasta cauza, camerele de numarare a leptospirelor au aratat ca, in plina faza de bacteriemie, leptospirele nu depasesc in majoritatea cazurilor maximum 103 germeni intr-un mililitru de sange, iar producatorii de truse atentioneaza ca evidentierea ADN-ului bacterian nu este posibila daca in prelevat sunt mai putine leptospire decat limita mentionata mai sus.

    Se obisnuieste in toate Centrele Nationale de Referinta din lume, ca pentru o cat mai rapida orientare sa se efectueze initial un serotest de gen, cu un antigen inactivat si concentrat preparat dintr-o tulpina saprofita fragmentata pentru punerea in evidenta a fractiunilor antigenice de gen situate in profunzimea peretelui bacterian, care sunt comune tulpinior saprofite si patogene. Prin serotestul de gen se indica numai daca pacientul are leptospiroza fara a se evidentia serotipul tulpinii infectante.

    Ca serotest de gen, in Centrul nostru se efectueaza Seroreactia de aglutinare macroscopica rapida pe lama (RAR) efectuata cu un antigen preparat “in house” (Brevet de inventie OSIM nr.3/1990) din tulpina saprofita Patoc fragmentata prin congelari si decongelari repetate de scurta durata. RAR prezinta un foarte bun indice de specificitate in jurul valorii de 0,93. Prin RAR se evidentiaza o leptospiroza infectie primara, dar si o leptospiroza latenta de pana la 3 ani, fara a se indica dupa cum am mai spus serotipul tulpinii infectante. In cazul serotestarii prin RAR, nu sunt valabile situatiile descrise la punctele 3 si 4 referitoare la cele 7% cazuri pentru care nu s-a dezvoltat un raspuns imun umoral, deoarece fractiunile antigenice reactive in RAR fiind situate in profunzimea peretelui bacterian, nu sunt supuse mecanismelor descrise la punctele respective.

    Important este de reamintit faptul ca, serotestul de gen pentru leptospiroza, efectuat cu trusele ELISA, indiferent de conjugatul folosit, prezinta un indice de specificitate mic, situat in jurul valorii de 0,70. Aceasta observatie a reiesit din experimentul efectuat de Centrul nostru inca din anii 1980 si apoi in perioada 1998 – 2000, in colaborare cu trei DSP-uri judetene.

    Sunt colegi care iau in consideratie numai serotestele de gen catalogandu-le gresit pe acestea ca fiind seroteste de confirmare. Indiferent de rezultatul obtinut la serotestul de gen, acesta trebuie confirmat in Centrul nostru prin efectuarea RAM si la nevoie aceasta trebuie completata cu evidentierea leptospirelor in prelevate si in culturi. Aceasta este modalitatea de lucru in toate Centrele Nationale de Referinta din lume, in acelasi mod trebuind sa se procedeze si la noi.

    Mentionam ca, metodologia care se practica in Centrul nostru si pe care o indicam sa fie respectata, se incadreaza in recomandarile OMS.

    Apasă pentru a descărca:

    Tabel ILI surveillance

    Tabel SARI surveillance

    Basic nr. 1 Basic nr. 2 Basic nr. 3
    Basic nr. 4 Basic nr. 5 Basic nr. 6
    Basic nr. 7 Basic nr. 11 Basic nr. 12
    Basic nr. 13 Basic nr. 14 Basic nr. 16
    Basic nr. 19 Basic nr. 20 Basic nr. 53
    Basic nr. 54 Basic nr. 55 Basic nr. 56
    Basic nr. 57 Basic nr. 58 Basic nr. 59
    Basic nr. 60 Basic nr. 61 Basic nr. 62
    Basic nr. 63 Basic nr. 64

    Apasă pentru a descărca:
    » Weekly News Bulletin – INCDMI “Cantacuzino” National Influenza Center: Influenza Surveillance Week 20/2013
    » Severe Acute Respiratory-tract Infections (SARI) Surveillance – Week 20/2013

    BASIC – Buletin de Actualitati Saptamanale, Centrul National de Gripa
    BASIC Anul XIV / Nr. 46 BASIC Anul XIV / Nr. 47 BASIC Anul XIV / Nr. 47 Bis
    BASIC Anul XIV / Nr. 48 BASIC Anul XIV / Nr. 49 BASIC Anul XIV / Nr. 50
    BASIC Anul XIV / Nr. 51 BASIC Anul XIV / Nr. 52 BASIC Anul XIV / Nr. 53
    BASIC Anul XIV / Nr. 54 BASIC Anul XIV / Nr. 55 BASIC Anul XIV / Nr. 56
    BASIC Anul XIV / Nr. 57 BASIC Anul XIV / Nr. 58 BASIC Anul XIV / Nr. 59
    BASIC Anul XV / Nr. 1 BASIC Anul XV / Nr. 2 BASIC Anul XV / Nr. 3
    BASIC Anul XV / Nr. 4 BASIC Anul XV / Nr. 5 BASIC Anul XV / Nr. 6
    BASIC Anul XV / Nr. 7 BASIC Anul XV / Nr. 8 BASIC Anul XV / Nr. 9
    BASIC Anul XV / Nr. 10 BASIC Anul XV / Nr. 11 BASIC Anul XV / Nr. 12
    BASIC Anul XV / Nr. 13 BASIC Anul XV / Nr. 14 BASIC Anul XV / Nr. 15
    BASIC Anul XV / Nr. 16 BASIC Anul XV / Nr. 17 BASIC Anul XV / Nr. 18
     BASIC Anul XV / Nr. 19 BASIC Anul XV / Nr. 20 BASIC Anul XV / Nr. 21
    BASIC Anul XV / Nr. 22 BASIC Anul XV / Nr. 23 BASIC Anul XV / Nr. 24
    BASIC Anul XV / Nr. 25 BASIC Anul XV / Nr. 26 BASIC Anul XV / Nr. 27
    BASIC Anul XV / Nr. 28 BASIC Anul XV / Nr. 29 BASIC Anul XV / Nr. 30
    BASIC Anul XV / Nr. 31 BASIC Anul XV / Nr. 33
    BASIC Anul XV / Nr. 35
    BASIC Anul XV / Nr. 37 BASIC Anul XV / Nr. 38 BASIC Anul XV / Nr. 39

     

    Tabel ILI surveillance

     Tabel SARI surveillance

    Ghid ILI-ARI

    Ghid SARI

    Basic 1 Basic 2 Basic 3
    Basic 4 Basic 5 Basic 6
    Basic 7 Basic 8 Basic 9
    Basic 10 Basic 11 Basic 12
    Basic 13 Basic 14 Basic 15
    Basic 16 Basic 17 Basic 18
    Basic 19 Basic 20 Basic 21
    Basic 22 Basic 23 Basic 24
    Basic 25 Basic 26 Basic 27
    Basic 28 Basic 29 Basic 30
    Basic 31 Basic 32 Basic 33

     

    Contact Laborator: Tel. 021.3069243 Email:  itv@cantacuzino.ro
    Sef laborator: Dr. Med. Daniela Badescu Tel. 021.3069127 Email:  danielab@cantacuzino.ro
    Loctiitor : Dr. Biol. Alexandru Vladimirescu Tel. 021.3069179 Email: alexandruvladimirescu@cantacuzino.ro

    Colectivul Infectii cu transmitere prin vectori

    Cornelia Ceianu         biolog principal, dr., CS I ; email: ceianu@cantacuzino.ro

    Ani Ioana Cotar          biolog specialist, CSIII, doctorand email: itv@cantacuzino.ro

    Raluca Panculescu    biochimist ,cercetator stiintific email: itv@cantacuzino.ro

    Activitati:

    1. Diagnostic si expertiza microbiologica in domeniul infectiilor transmise prin vectori ( infectii cu Rickettsia, infectii cu Borrelia, infectii virale transmise prin vectori) si, de asemenea, in domeniul infectiilor produse de Coxiella burnetii, Ch. psittacii, Mycoplasma pneumoniae si Legionella pneumophila pentru:

    • Programul national de supraveghere a meningitelor arbovirale
    • Supravegherea pneumoniilor cu Legionella
    • Programul european ENIVD: European Network for Diagnostics of Imported Viral Diseases
    • Pacienti din ambulator – prin contract intern cu Laboratorul de analize medicale
    • Terti: alte laboratoare, unitati hoteliere, alte institutii publice si private

    2. Programe de cercetare: vezi sectiunea Cercetare

    3. Pregatirea rezidentilor si specialistilor de medicina de laborator si epidemiologie

    LISTA TESTELOR

    1. Test ELISA IgM / IgG pentru depistarea borreliozei Lyme

    Descriere : Test imunoenzimatic pentru detectarea anticorpilor de tip IgM si IgG anti-Borrelia;

    Proba : Sânge /ser, LCR;

    Cantitatea: Sânge : minimum 5ml sau

    Ser : minimum 0.6ml;

    LCR : 1-2ml

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    Precizari: se recomanda testarea simultana a serurilor pentru ambele clase de anticorpi (IgM si IgG).

    In suspiciunea de neuroborelioza pentru demonstrarea sintezei  intratecale de anticorpi este obligatoriu testarea LCR-ului in paralel cu  testarea unei probe de ser recoltata in acelasi timp cu LCR-ul.

    2. Test Western Blot IgM / IgG pentru confirmarea borreliozei Lyme

    Descriere : Test de detectare prin imunoblot a anticorpilor de tip IgM si IgG anti-Borrelia;Test de confirmare a rezultatelor ELISA pozitive sau neconcludente

    Proba : Sânge, ser, LCR;

    Cantitatea : Sânge – minimum 5ml;

    Ser, LCR – minimum 0.6ml;

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    Precizari: se recomanda testarea simultana a serurilor pentru ambele clase de anticorpi ( IgM si IgG). 

    In suspiciunea de neuroborelioza pentru demonstrarea sintezei    intratecale de anticorpi este obligatoriu testarea LCR-ului in paralel cu   testarea unei probe de ser recoltata in acelasi timp cu LCR-ul.

    3. Detectare anticorpi IgG în infectia cu Rickettsia conorii (febra butonoasa)

    Descriere : Test de imunofluorescenţă indirectă pentru detectarea anticorpilor IgG anti-Rickettsia conorii;

    Proba : ser; se vor recolta 2 probe la interval de minimum 15 zile

    Cantitatea :   Ser – minimum 1ml;

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    4. Detectare anticorpi  IgM / IgG în infectia cu Coxiella burnetii (febra Q)

     Descriere : Test de imunofluorescenţă indirectă pentru detectarea anticorpilor IgM/ IgG anti-Coxiella burnetii 

    Proba : ser; se vor recolta 2 probe la interval de minimum 15 zile

    Cantitatea :   Ser – minimum 1ml;

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    5. Detectare anticorpi totali in infectia cu Coxiella burnetii (febra Q)

    Descriere : RFC pentru detectarea anticorpilor totali anti-Coxiella burnetii;

    Proba : ser; 2 probe la interval de minimum 15 zile : în faza acută şi în  faza de convalescenţă

    Cantitatea : Ser – minimum 1ml

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    O creştere a valorii titrului anticorpilor de cel puţin 4 ori între faza acută şi convalescenţă este semnificativă pentru diagnosticul pozitiv 

    In viitor se preconizeaza introducerea in activitatea curenta de diagnostic a testului de imunofluorescenta indirecta pentru determinarea prezentei anticorpilor de tip IgM si IgG.

    6. Detectare anticorpi totali in infectia cu Chlamydophila  psittaci (ornitoza)

    Descriere : RFC pentru detectarea anticorpilor totali anti- Chlamydia psittaci.

    Proba : ser; 2 probe la interval de minimum 15 zile : în faza acută şi în faza de convalescenţă

    Cantitatea : Ser – minimum 1ml

    Condiţii transport : Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore; 

    O creştere a valorii titrului anticorpilor de cel puţin 4 ori între faza acută şi convalescenţă este semnificativă pentru diagnosticul pozitiv 

    7. Detectare anticorpi IgM / IgG in infectia cu Mycoplasma pneumoniae (ELISA)

    Descriere : Test imunoenzimatic pentru detectarea anticorpilor de tip IgM / IgG in infectia cu M. pneumoniae 

    Proba : 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la 2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    8. Detectare anticorpi totali in infectia cu Mycoplasma pneumoniae  

    Descriere : RFC pentru detectarea anticorpilor totali anti-Mycoplasma pneumoniae;

    Proba : ser; 2 probe la interval de munimum 15 zile : în faza acută şi în faza de convalescenţă

    Cantitatea : Ser – minimum 1ml ;

    Condiţii transport: Tub secundar în container izoterm la 2°C – 8°C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore

    9. Detectarea prezentei Legionella pneumophila in apa

    Descriere : Izolarea bacteriei Legionella pneumophila in apa prin cultivarea pe medii    specifice (BCYE,GVPC)

    Proba: apa ; SE VA CONTACTA LABORATORUL ANTERIOR RECOLTARII

    Cantitate : 1litru (in containerele speciale puse la dispozitie de laborator)

    Conditii de transport: 6°C -18 °C, protejate de lumina 

     Interval de transport : Maximum 48 ore

    10. Detectarea prezentei Legionella pneumophila in probe clinice (lichid de spalare bronho-alveolar, expectoratie, aspirat traheo bronsic, lichid pleural)

    Descriere : Izolarea bacteriei Legionella pneumophila prin cultivarea pe medii   specifice (BCYE,GVPC) si identificare prin latex aglutinare.

    SE VA CONTACTA LABORATORUL ANTERIOR RECOLTARII PROBELOR.

    11. Teste ELISA pentru determinarea prezentei antigenului urinar Legionella pneumophila si a anticorpilor serici IgM si IgG anti -Legionella pneumophila.

    SE VA CONTACTA LABORATORUL ANTERIOR  TRIMITERII PROBELOR.

     12. Confirmarea infecţiei acute cu virusul West Nile la om

    Descriere : Test ELISA IgM de captură  / IgG anti-virus West – Nile

    Proba : LCR şi 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container  izoterm la  2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    13. Confirmarea infecţiei cu virusul encefalitei de capusa

    Descriere : Test ELISA IgM / IgG in encefalita de capusa

    Proba : LCR şi 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la  2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    14. Confirmarea infecţiei cu Hantavirus in febrele hemoragice

    a. Descriere : Test ELISA  IgM / IgG in infectii cu Hantavirus

    Proba : 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la 2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    b. Descriere: Test IFA IGM plus IgG in infectii cu Hantavirus

    Proba : 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la 2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    15. Confirmarea infectiei in febra Denga (test ce se efectueaza pana in luna septembrie 2009)

    Descriere : Test ELISA  IgM / IgG in febra Denga

    Proba : 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la 2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

    16. Confirmarea infectiei cu virusul Chikungunya

    Descriere : Test ELISA  IgM / IgG in febra Denga

    Proba : 2 seruri la interval de două săptămâni;

    Cantitatea :   Ser – minimum 1 ml;

    Condiţii transport : Tub in cutie stativ pentru transport probe in container izoterm la 2°-8° C;

    Interval de transport : Maximum 24 ore;

     

    Colectivul Entomologie medicala

    Activitati:

    - desfasoara activitate specializata de expertiza entomologica, inclusiv studii epizootologice si environmentale

    - participa la programe nationale si internationale de supraveghere a insectelor vectoare si a bolilor transmise prin acestia

    - participa la programe de cercetare nationale si internationale. Detalii la Sectiunea cercetare.

     


    LABORATORUL COLECTIA CULTURI MICROBIENE

    Sef laborator: Rodica Oancea, Biol. Pr. (microcult@cantacuzino.ro)



    Colectivul laboratorului

    Olguta Dracea, cercetator stiintific biolog (microcult@cantacuzino.ro, olgutza_dracea@yahoo.co.uk )

    Popliceanu Maria – Asist. Medical Principal

    Panduru Gigica – PSV I

    Drulea Eugenia – PSV II

    Domeniu de activitate:

    Laboratorul desfasoara activitate specializata de expertiza microbiologica in domeniul infectiilor micotice

    1. Activitatea de intretinere a colectiei de tulpini de referinta si livrare catre beneficiari (laboratoarele IC,  ASP-uri,  laboratoare private etc)

    Colectia de culturi este constituita din microorganisme de referinta, liofilizate (cca 1550 de tulpini grupate in aproximativ 22 de genuri bacteriene si 14 genuri de fungi – levuri si fungi filamentosi), utilizate in productie, in controlul de calitate al mediilor de cultura; al testarii susceptibilitatii la antibiotice pentru diferiti germeni, cercetare.


    2.  Activitatea de determinare  a  activitatii  fungicide a antisepticelor si  dezinfectantelor in colaborare cu Laboratorul Infectii Micotice conform standardelor:

    -                SR EN 1275:2006 Antiseptice si dezinfectante chimice. Testarea cantitativa a suspensiei pentru evaluarea activitatii fungicide sau levuricide de baza a antisepticelor si dezinfectantelor chimice. Metoda de testare si prescriptii (faza 1)

    -                SR EN 1650 :2000   ”Antiseptice si dezinfectante chimice. Testarea cantitativa a suspensiei pentru evaluarea activitatii fungicide a antisepticelor si dezinfectantelor chimice utilizate în domeniul agro-alimentar, în industrie, în domeniul casnic si în colectivitati. Metoda de testare si prescriptii (faza 2, etapa 1)

    -                SR EN 13624: 2004 “Antiseptice si dezinfectante chimice. Testarea cantitativa a suspensiei pentru evaluarea activitatii fungicide a dezinfectantelor chimice pentru instrumentarul utilizat în domeniul medical. Metoda de testare si prescriptii (faza 2, etapa 1)

    3. Activitate de cercetare

    In ultimii ani activitatea de cercetare de la nivelul laboratorului s-a orientat spre imbunatatirea metodelor de conservare in vederea reducerii la minimum, a modificarilor genetice si verificarea eficientei acestor metode prin caracterizarea fenotipica si genotipica a tulpinilor de referinta.

    Totodata Laboratorul Colectia Culturi Microbiene este implicat in proiecte de cercetare care vizeaza testarea activitatii biologice a unor noi substante chimice cu potentiala actiune antiinfectioasa.

    4. Activitati suport:

    • Preparare de reactivi si medii speciale in-house

    5. Activitate de formare

    -          Participarea personalului laboratorului la cursuri/stagii organizate in tara sau strainatate in  vederea cresterea calitatii activitatii desfasurate in laborator



    CNEMM ZOONOZE

    CNR LEPTOSPIRE

    Raport tehnic asistenta ASP jud., LAM IC, Societati Comerciale

    2008

    ASP

    Nr. probe

    Aglut.

    Aglut.

    Probe

    Serotipul*

    trimise

    rapida

    microsc.

    pozitive

    IH

    C

    P

    G

    W

    Hb

    Sej

    As

    Hj

    cu atg. gen

    cu 9 atg.

    L.Patoc

    vii de tip

    Arad

    20

    20

    20

    4

    2

     

    1

     

     

     

    1

     

     

    Arges

    1

    1

    1

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Bihor

    1

    1

    1

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Botosani

    1

    1

    1

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Braila

    1

    1

    1

    1

     

     

     

     

    1

     

     

     

     

    Brasov

    13

    13

    13

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Bucuresti

    2

    2

    2

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Buzau

    2

    2

    2

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Calarasi

    6

    6

    6

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Constanta

    9

    9

    9

    4

    3

     

     

     

    1

     

     

     

     

    Covasna

    2

    2

    2

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Gorj

    3

    3

    3

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Harghita

    5

    5

    5

    1

     

     

    1

     

     

     

     

     

     

    Neamt

    52

    52

    52

    10

    1

     

     

     

    9

     

     

     

     

    Olt

    33

    33

    33

    3

    2

     

     

     

    1

     

     

     

     

    Prahova

    28

    28

    28

    6

    4

     

     

     

    1

     

     

     

    1

    Sibiu

    24

    24

    24

    2

    1

     

     

     

     

     

     

    1

     

    Tulcea

    27

    27

    27

    7

    3

     

     

     

    3

     

     

    1

     

    Total

    230

    230

    230

    38

    16

    2

    16

    1

    2

    1

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    LAM IC

    193

    193

    193

    13

    6

    1

    1

    2

    1

    2

    2 Societati

    67

    67

    67

    4

     

    1

     

     

     

     

     

    3

     

    Comerciale

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    jud. Tulcea

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    (plata prin

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    factura)

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

     

    Total

    490

    490

    490

    55

    22

    2

    2

    17

    2

    2

    7

    1

    general


    * Legenda serotip: IH – icterohaemorrhagiae, C – canicola, P- Pomona, G – grippothyphosa,

    W – wolffi,  Hb – hebdomadis,  Sej – sejroe, As – australis, Hj – Hardjo.

    Cazuri pozitive sporadice: 45

    Cazuri pozitive  focar:       10 (jud. Neamt, angajatii unei ferme  de suine din com. Basta,

    inundata in perioada ploioasa iulie – august).

    Rezervor primar principal: sobolanul pentru serotipul icterohaemorrhagiae, soarecele de casa,

    camp si padure pentru wolffi, hebdomadis, sejroe, australis si hardjo, cainele pentru canicola,

    porcul pentru pomona.

    Observatii: Asemenea anilor anteriori se situeaza pe primele doua locuri cazurile determinate

    de tulpini din serotipurile gazduite de soarece respectiv sobolan. Se impune deratizarea

    sistematica. Numarul cazurilor canicola si pomona in descrestere anuala evidenta

    se datoreaza vaccinarii gazdelor principale.

    SEF CNR LEPTOSPIRE

    DR. NICOLETA ANDREESCU

    SINTEZA LUCRARII FAZA 2007                                                   

    Director de proiect Dr. Anda Baicus

    PROIECT  Nr. 219

     

     

    Genotiparea tulpinilor de poliovirus izolate in Romania in perioada 2007-2010 de la cazurile cu PAF si contactii sanatosi ai acestora ca obiectiv major al procesului de Eradicare a Poliomielitei”

     

    În mai 1988  cea de-a 41 Adunare Mondială a Sănătăţii a propus Statelor membre ale OMS Eradicarea Globală a Poliomielitei până în anul 2000. Decizia eradicării a fost urmarea succesului enorm al vaccinării (mai ales cu vaccin polio oral VPO). VPO elimină virusul sălbatic din circulaţie (imunitate de grup) pentru că induce şi imunitate locală la poarta de intrare (IgA secretor). VPI (vaccin polio inactivat) protejează foarte bine individul, dar mai puţin colectivitatea. Dezavantajul utilizării VPO îl reprezintă riscul apariţiei cazurilor de poliomielită paralitică asociată vaccinării (VAPP). În 1989  a fost aprobat Planul de Acţiune pentru eradicarea poliomieliteiIn 2003 a fost adoptat Planul Strategic de continuare a Programului de Eradicare Globală a poliomielitei pentru 2004-2008 .

    Obiectivele  Iniţiativei de Eradicare a poliomielitei sînt: dispariţia cazurilor de poliomielită provocate de poliovirusul sălbatic, absenţa poliovirusurilor sălbatice în produse patologice şi în probele prelevate din mediul înconjurător.

    Strategiile adoptate în vederea certificării regiunilor OMS „polio free” vizează :

    a)       Acoperire vaccinala ridicată  :

    ·         Obţinerea şi menţinerea unei acoperiri vaccinale corespunzătoare cu cel putin trei doze de vaccin polio oral trivalent (VPOT) în primul an de viata (la noi prin vaccinarea de rutină este raportată o rată de acoperire vaccinală cu 4 doze VPOT  în primul an de viaţă de peste 90%).

    ·         Vaccinare suplimentară (în ţări cu poliomielită endemică) prin organizarea zilelor naţionale de vaccinare (la noi deşi ultimul caz de poliomielită cu poliovirus sălbatic s-a înregistrat în 1992, în 1996 s-au organizat zile naţionale de imunizare (NIDS ) la toţi copiii sub 6 ani, care au primit câte 2 doze de VPOT, indiferent de numărul dozelor primite anterior şi fără a interfera cu vaccinarea de rutină).

    ·         Vaccinare mop-up/ratissage (din poartă în poartă) – în ţări aflate în faza finală  a întreruperii transmiterii poliovirusurilor sălbatice, constă în administrarea VPOT din casă în casă, tuturor copiilor din zonele cu risc mare (în special acolo unde acoperirea vaccinală este deficitară).

     

         b) Supravegherea cazurilor de paralizie acută flască (PAF)

    • Depistare, investigare de laborator, raportare a tuturor cazurilor de PAF survenite la copii mai mici de 15 ani indiferent de cauză. Prin definiţie, în acest sistem de supraveghere se includ şi toate cazurile de sindrom Guillain-Barre, mielită transversă, ca şi alte îmbolnăviri care produc PAF. Frecvenţa medie a acestora este de 1 caz la 100 000 indivizi sub 15 ani. O supraveghere corectă a cazurilor de PAF trebuie să evidenţieze toate aceste cazuri (1/150 000 sub 15 ani).
    •  Investigarea contacţilor sănătoşi ai cazurilor PAF (5 contacţi /1 caz PAF).

     

    În 1988 răspândită încă epidemic pe toate cele 5 continente, poliomielita provocată de poliovirusurile sălbatice mai este găsită acum numai în părţi din Africa şi Sudul Asiei.

    Progresele făcute din 2000, 2001, 2003, 2006 includ reducerea numărului de ţări polio-endemice de la 20 la 10, 6, 4. Transmisia poliovirusului a fost stopată în ambele Americi şi Pacificul de Vest. Europa a fost certificată  ca “polio free” la reuniunea OMS/EURO din 5 iunie 2002. Riscul major al utilizarii VPO rămâne apariţia cazurilor de poliomielită paralitică asociată vaccinarii (VAPP) şi emergenţa şi circulaţia tulpinilor de poliovirus derivate din vaccin (VDPV). Pentru ca o tulpină Sabin să fie denumită VDPV trebuie să fi acumulat peste 1% mutaţii la nivelul genelor care codifică proteina capsidală VP1.

     

     

     

     

    OBIECTIVE REALIZATE PENTRU FAZA ANULUI 2007

     

    1. STABILIREA PROTOCOLULUI DE LUCRU PRIVIND EXPERTIZA DE LABORATOR A TULPINILOR DE POLIOVIRUS IZOLATE PE TERITORIUL ROMANIEI

     

    Protocol standard

    De la fiecare caz de PAF se recoltează următoarele produse patologice:

    ·         trei probe de materii fecale (recoltate in primele 3-5 zile de la internare – de preferat cât mai aproape de debutul paraliziei )

    ·         un tampon nazo – faringian

    ·         o probă de  LCR (numai când  se impune efectuarea puncţiei lombare)

    ·         o probă de sânge (se separă şi se trimit la laborator atât cheagul cât şi serul)

    ·         o a doua probă de ser obţinut din sângele recoltat la 14-18 zile interval de la prima probă de ser

    În rarele cazuri de deces se recoltează probe la necropsie: fragmente de SNC din zonele afectate frecvent de infecţia cu poliovirus (măduva spinării,  bulbul rahidian, punte, talamus)

    ·         în soluţie Hanks,  pentru investigaţii virologice

    ·         în formol, pentru investigaţii histopatologice

    De la fiecare contact sănătos se recoltează câte 2 probe de materii fecale în două zile consecutive (cât mai aproape de debutul bolii copilului cu PAF).

     

    1.1. EXPERTIZA VIROLOGICA

    ·         Preparare si intretinere linii celulare L20B, RD (testarea puritatii, stabilitatii, autenticitatii)

    ·         Stabilirea sensibilitatii celulare fata de tulpinile de poliovirus izolate dar si tulpinilor Sabin vaccinale                                           

    ·         Izolarea si identificarea tulpinilor de poliovirus prin diagnostic virologic clasic. Izolarea si identificarea  se realizează pe liniile celulare continue recomandate de OMS (WHO Manual 2004):  RD (derivată dintr-un rabdomiosarcom uman) şi L20B  (linie celulară de şoareci modificaţi genetic ce posedă receptorul uman pentru poliovirus) (Mendelsohn CD şi col, 1989l; Pipkin PA şi col, 1993). Mediul de creştere al acestor linii celulare este Dulbecco modificat – Eagle îmbogăţit cu 10% ser fetal de viţel. Odată cu apariţia efectului citopatic suspensia celulară infectată este ingheţată la (–20°C) până când virusul  incriminat  intră în tipizare. Seroneutralizarea stă la baza tipizării virale şi se face cu amestecuri de seruri antipoliovirus   obţinute pe cal, confirmarea făcându-se cu seruri monotip (Furione M şi col, 1993; Georgescu MM şi col, 1997).

    ·         Titrarea tulpinilor de poliovirus izolate in vederea determinarii 100 DCP50

    ·         Titrarea tulpinilor Sabin in vederea determinarii 100 DCP50

     

    PCR-RFLP va fi aplicata tuturor tulpinilor de poliovirus  izolate

    PCR este o metodă rapidă de amplificare enzimatică a unui fragment specific de ADN. Amplificarea enzimatică in vitro  reprezintă metoda prin care se sintetizează  un număr mare de copii ale unui segment dintr-o moleculă de ADN. Un anumit segment de acid nucleic este replicat în mod specific pornind de la doi primeri oligonucleotidici care flanchează fragmentul respectiv de ADN. Procesul are loc în cadrul unor cicluri repetitive de operaţiuni care cuprind: denaturarea termică a ADN, hibridizarea primerilor, elongarea acestora  cu ajutorul unei ADN polimeraze termostabile (Taq. polimeraza)  folosind o matriţă ADN.  Primerii, adăugaţi în exces faţă de  ADN ce trebuie amplificat, hibridizează pe catenele  ADN pe baza complementarităţii de secvenţă, câte un primer pe fiecare lanţ. Ciclurile succesive de amplificare vor dubla de fiecare dată cantitatea de ADN sintetizată în ciclul precedent, rezultând teoretic după 30 de cicluri o amplificare de aproximativ  270  milioane de ori a unui segment de ADN.

                    Evaluarea variaţiei genetice a tulpinilor de poliovirus izolate, va fi  realizată prin analiza polimorfismului segmentelor de ADN provenite dintr-o regiune a genomului (RFLP), ce urmează revers transcrierii (J. Balanant şi col, 1991).

    Principiul metodei constă în evidenţierea  unui situs de restricţie care a fost creat sau a fost suprimat după apariţia unei mutaţii  prin comparaţie cu numărul de situsuri corespunzătoare  de restricţie ale  tulpinilor vaccinale Sabin. Enzimele de restricţie sunt endonucleaze de origine bacteriană ce au proprietatea de a tăia ADN dublu catenar la nivelul unor situsuri specifice. Produşii de digestie se vizualizează în gel de  agaroză 3% şi se evaluează in raport cu un marker de masă moleculară şi o probă  de ADN  nelizat alături de lizate ale tulpinilor de referinţă. Practic după amplificare şi digestie enzimatică, migrarea în gel de agaroză permite punerea în evidenţă a unei benzi  suplimentare sau a absenţei altei benzi prin comparaţie cu tulpina vaccinală. Profilurile de restricţie ale tulpinilor vaccinale Sabin sunt conservate de-a lungul pasajelor inter- şi intraumane.

    O  tehnică « RT-PCR-RFLP new » pusă la punct în cadrul Institutului Pasteur Paris prevede examinarea  a trei porţiuni din genom  :

    ¨      regiunea VP3-VP1 utilizând amorsele UG24-UC1

    ¨      regiunea VP1-2A   utilizând amorsele UG19-UC13

    ¨      regiunea 3D –3’  utilizând amorsele UG17-UC10

     

    În cadrul acestei tehnici suspensia virală utilizată pentru obţinerea ADNc este diluată 1/10 (S. Guillot şi col, 2000).Protocolul de lucru utilizat pentru realizarea proiectul va fi  cel elaborat de cercetători din  Institutul Pasteur Paris (S. Guillot şi col, 2000) dar va fi optimizata in laboratorul nostru (vor fi testate si alte variante ale concentratiei primerilor si reactivilor)

     

    Tehnica : ARN viral va fi revers transcris  şi ADN complementar va fi  amplificat prin PCR. După terminarea programului pe termociclator  produşii de amplificare se  vor identifica prin electroforeză în tampon TAE 1X, pe un gel de 1,5% agaroză (colorat cu bromură de ethidiu) şi se vizualizeaza cu ajutorul unui transiluminator cu lumină UV. Sunt investigate în acelaşi mod în paralel şi tulpinile vaccinale Sabin.  Enzimele utilizate pentru digestie sunt trei endonucleaze: RsaI, DdeI, Hinf I. Un amestec de 21 ml realizat incubeaza  2 ore la 37 °C. Produşii RFLP se evidenţiaza prin electroforeză  în gel de agaroză 3%, în tampon TAE 1X  şi se vizualizeaza pe transiluminator în lumina UV. Profilurile obţinute în urma  digestiei enzimatice sunt comparate cu cele obţinute pentru tulpinile vaccinale.

    Secventele nucleotidice ale primerilor

    UG24: (1913)-GACACCATGATTCCCCTTAA-(1932)

    UC1: (2881)-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-(2862)

    UG19: (2870)-GACATGGAATTCACCTTTGTGG-(2891)

    UC13: (3648)-TAGTACTTAGCTTCCATGTA-(3629)

    UG17: (6536)-TCAGTGGCCATGAGAATGGC-(6555)

    UC10: (7464)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-(7441)

     

     

    1.2.2. Determinarea secventei acizilor nucleici in regiunea VP1-2A va fi aplicata pentru tulpinile de poliovirus la care  situsuri  de restricţie au fost create sau suprimate după apariţia uneia sau mai multor  mutaţii  prin comparaţie cu numărul de situsuri corespunzătoare  de restricţie ale  tulpinilor vaccinale Sabin. Secventierea altor regiuni ale genomului se va face numai daca profilurile de restrictie in regiunea 3D polimeraza o impun.

     

    Tehnica : Secvenţierea nucleotidică pe un secvenţiator automat (ex. 3100 Avant – Applied Biosystems) se realizeaza in capilare care contin polimer de rezolutie foarte inalta – de tip POP 4 sau POP 6. Principiul constă în migrarea prin capilar a ADN marcat cu 4 fluorocromi diferiţi. Fragmentele de ADN sînt separate în funcţie de mărime şi traversează regiunea din dreptul unui fascicul laser. Laserul excită fluorocromii care emit fiecare un semnal cu lungimi de undă diferite, detectat de o cameră video cuplată cu un spectrograf (CDD). Prin intermediul unor filtre, datele privind intensitatea emisiilor sînt colectate şi conservate sub forma unor semnale electrice. Un program informatic, conectat la secvenţiator, permite analiza automatizată şi convertirea directă a datelor în secvenţe nucleotidice. Secventele se obtin in format ABI (electroforegrame) si in format text. Acestea sunt ulterior analizate cu programe informatice cum sunt BioEdit, Clustal w, Mega. Metoda de secvenţiere folosită în prezent este cea enzimatică, dezvoltată de Sanger. Această metodă se bazează pe utilizarea unor nucleotide modificate, 2′,3′didezoxiribonucleotid trifosfaţi (ddNTP), care joacă rolul de terminatori de lanţ în timpul reacţiei de polimerizare enzimatică a ADN. Datorită acţiunii ADN polimerazelor, ddNTP-urile sunt încorporate în catena în curs de elongare a ADN aşa cum sunt utilizate dNTP-urile normale. Diferenţa constă în faptul că un ddNTP incorporate, marcat cu fluorocromi, declanşează, la un moment dat, blocarea elongării. Dezvoltarea PCR a permis descoperirea şi caracterizarea unor noi ADN polimeraze, cum este Taq polimeraza, care este foarte utilă şi în secvenţiere, în special pentru regiunile cu structuri secundare. Secvenţierea prin PCR, integrată în sistemul automat, neradioactiv (cu fluorocromi), are avantajul că permite atât secvenţierea ADN după clonare într-un vector (ex. fagul M13) ca în celelalte sisteme de secvenţiere dar şi direct, a produsului obţinut prin PCR, fără o clonare prealabilă.

    Pentru secventierea produsilor PCR purificati este utilizat kitul de secvenţiere ciclică a ADN AmpliTaqÒ FS Big Dye TM Terminators (Applied Biosystems).

     

    1.2.3. Analiza secventelor

                    Secvenţele vor fi  aliniate folosind programul Clustal W, versiunea 1.83. Scanarea secvenţelor şi alinierea acestora va fi făcută cu programul Fast A (Gen Bank DNA). Secvenţele transmise de secvenţiator în formă de text  vor fi comparate cu electroforegramele corespunzătoare (pentru detectarea erorilor de citire şi transcriere ale aparatului).

    Analiza filogenetică – alinierea  multiplă a secvenţelor

    Programul Clustal W (Thompson si col 1994) caută alinierile optime folosind toată lungimea secvenţelor, folosind perechi de secvenţe. Secvenţele sunt comparate două câte două, rezultatul fiind un scor de similaritate, care serveşte la realizarea unei dendrograme.

     

     

     

     

    1.3. EXPERTIZA EPIDEMIOLOGICA

    1.3.1. Confirmarea si clasificarea cazurilor de poliomielita

     Definiţia unui caz confirmat ca poliomielită este: “boala acută cu paralizie acută flască, compatibilă cu manifestările clinice ale poliomielitei, la care după analiza neurologică efectuată la 60 de zile de la debut se constată un deficit motor rezidual iar analiza virologică a evidenţiat prezenţa poliovirusului” (Expanded Programme on Immunization,WHO, 1989). Rezultatele investigaţiilor virologice (izolare, identificare, diferenţiere intratipică prin metode imunologice şi/sau moleculare) determină caracterizarea tulpinilor de poliovirus izolate ca fiind  sălbatice, Sabin-like, sau derivate din vaccin (VDPV) (WHO Manual 2004).

    Cazurile de poliomielită confirmate se clasifică ulterior în:

    • cazuri produse de poliovirusul sălbatic (indigene sau importate )
    • cazuri asociate vaccinării (VAPP)
    • cazuri de origine necunoscută

    1.3.2. Clasificarea tulpinilor de poliovirus in functie de omologia secventelor in regiunea care codifica regiunea VP1

    Tulpinile OPV-like (Sabin-like): > 99% omologie a secvenţelor genomului cu tulpinile Sabin vaccinale. Recipienţii imunocompetenţi normal excretă tulpinile pentru o perioadă de 3 până la 6 săptămâni.

    Tulpini derivate din vaccin VDPV : ≤ 99% omologie a secvenţelor  între tulpinile izolate din teren şi cele vaccinale. Numărul mutaţiilor apărute indică timpul de circulaţie în populaţie.  Au fost descrise două categorii de astfel de tulpini: VDPV (de la) imunodeficient (iVDPV ) şi  VDPV circulant (cVDPV).

    Tulpinile VDPV circulante (cVDPV) responsabile de apariţia unor epidemii au fost prima dată depistate cu cVDPV de tip 1 in 2000-2001 în Insulele Caraibe (2 decese înregistrate) şi Insulele Filipine (2001), în Madagascar cu cVDPV de tip 2. Un studiu retrospectiv efectuat în Egipt a demonstrat circulaţia unor tulpini de cVDPV de tip 2 în intervalul 1980-1990. Punerea în evidenţă a emergenţei şi a circulaţiei acestor tulpini ridică probleme majore în cadrul procesului de Eradicare Globală a Poliomielitei.

     

    2. STABILIREA BAZEI DE DATE (Tab.1.)

    In anul 2007 au fost investigate probe de la 22 cazuri  AFP, 42 cazuri FP, si  274 contacti sanatosi.

    In anul 2007  s-a constatat o circulatie foarte scazuta a tulpinilor de poliovirus in populatie dar s-a intensificat circulatia Enterovirusurilor nonpolio si in special ECHO 4 agentul etiologic al meningitelor cu lichid clar aparute in perioada iunie –octombrie 2007  (Tab.2.)

     

    Tab.1.: Date clinice si de laborator pentru contactii polio pozitivi

    Nr. crt

    EPID NR.

    Nr. lab.

    Nume

    Varsta

    Diagnostic

    Data ultimei 

    vaccinari

    Tulpina polio izolata

    1.

    ROMIS07005C1

    25

    Vladeanu

    Petru Ciprian

    0.6

    contact

    sanatos

    VPOT2 – 25.10.06

    PV3

    2.

    ROMBH07009C4

    52

    Lingurar Marius

    2.10

    contact

    sanatos

    VPOT4 – 30.09.05

    PV1+2, PV1

     

    Date de inoculare si pasaj

    25/1 RD I :5.02.07

    ECP: 9.02.07

    T:12.02.07                                PV3

    25/1 L20B I: 5.02.07

    ECP: 8.02.07

    T: 16.02.07                               PV3

    25/2RD I :5.02.07

    ECP: 9.02.07

    T:16.02.07                                PV3

    25/2 L20B I: 5.02.07

    ECP: 8.02.07

    T: 16.02.07                               PV3

    52/1 RD I :8.03.07

    P: 15.03.07

    ECP:19.03.07

    T:9.04.07                                 PV2

    52/1L20B I :8.03.07

    P: 15.03.07

    ECP:19.03.07

    T:9.04.07                                 PV2

    52/2 RD I :8.03.07

    P: 15.03.07                              negativ

     

    52/1L20B I :8.03.07

    P: 15.03.07

    ECP:20.03.07

    T:9.04.07                                 PV1

    I:inoculare

    P:pasaj

    T: data tipizarii tulpinii de PV

     

    Tab.2. Comparatie intre numarul tulpinilor de poliovirusuri izolate in anul 2006 si cele izolate in anul 2007

    Serotipul

    2006

    2007

    Virus polio 1

    7

    2

    Virus polio 2

    17

    1

    Virus polio 3

    5

    2

    Total

    29

    5

     

    3. INTRETINEREA SI PREPARAREA SUSPENSIILOR CELULARE (LINIILE L20B, RD) PENTRU TESTARILE EFECTUATE IN FAZA 2007

     

    Materiale necesare:

    ·         placa de 75 cm2 in care cultura celulara este confluenta (20 000 000 celule)

    ·         versen –tripsina 5ml (incalzita in baie de apa la 370C)

    ·         mediul de crestere Dulbecco modificat – Eagle îmbogăţit cu 10% ser fetal de viţel.

    ·         mediul de intretinere Dulbecco modificat – Eagle îmbogăţit cu 2 % ser fetal de viţel.

    PASAJELE s-au  facut o data pe saptamana

    Tehnica : se indeparteaza mediul de crestere

    ·         se adauga 5 ml versen tripsina se mentine 1 min si se agita putin

    ·         se arunca tripsina din placa

    ·         se adauga 5 ml versen tripsina ( se lasa 3 sec in contact cu monostratul celular)

    ·         se indeparteaza 4 ml de tripsina din placa (placa mentinuta 2-3 min la 370C pentru detasarea celulelor/ tapotare)

    ·         se adauga 9 ml mediu de crestere cu 10% ser fetal+ glutamina +antibiotic

    ·         se spala peretii placii cu ajutorul pipetei de 10 ml cu care s-a adaugat mediul de crestere

    ·         din placa se pot face 9 pasaj pe alte placi cea de-a 10 fiind cea din care se fac pasajele

    Monostratul apare dupa 48 max 80 ore la 370C.

    Prepararea suspensiei pentru tuburi dintr-o placa de 75 cm2 s-a obtinut suspensia celulara  pentru 20 tuburi

    ( 1 000 000 celule/tub ;1ml suspensie/tub)

    Prepararea suspensiei pentru placuta cu 96 de godeuri din placa de 75 cm2 s-a pregatit suspensia celulara  pentru max. 10 placute; (20.000 celule/godeu/100ml suspensie; 2 000 000 celule/placuta cu 96 godeuri) (Tab.3).

     

       Tab.3. Numarul pasajelor  efectuate pentru testarile pe tuburi si  prin micrometoda in placi cu 96 godeuri

    Nr. pasaj / data

    L20B

    RD

    19.10.2007

    P 49

    P135

    24.10.2007

    P50

    P136

    26.11.2007

    P158

    P151

    30.11.2007

    P159

    P152

     

    4. MULTIPLICAREA TULPINILOR DE POLIOVIRUSURI DE REFERINTA

    Multiplicarea tulpinilor de poliovirusuri de referinta (Sabin 1, 2, 3) s-a efectuat pe ambele linii celulare utilizate in laborator (RD si L20B), in flacoane de cultura cu suprafata de 75cm2 .

    Tehnica : se verifica cultura celulara pentru confluenta si lipsa contaminarii bacteriene

    • se indeparteaza mediul de crestere
    • se inoculeaza 1 ml de antigen
    • se lasa placa la adsorbtie, 20 min. la temperatura camerei
    • se adauga mediu de intretinere (mediu Eagle MEM cu 2% ser fetal de vitel)
    • placile se incubeaza la 36ºC in sistem stationar si sunt urmarite la microscop zilnic pentru aparitia efectului citopatic
    • efectul citopatic 4+ (100%) a aparut, atit pe RD, cit si pe L20B la 48 ore de la inoculare, cind placutele au fost puse la -20ºC

    5.TITRAREA ANTIGENELOR POLIOVIRUSURILOR SABIN

    Titrarea s-a efectuat pe acelasi tip de cultura pe care s-a realizat multiplicarea, prin micrometoda, pe placute cu 96 godeuri .Au fost facute cate 3 determinari pentru fiecare virus, pentru a se obtine o medie a titrurilor cat mai corecta (Tab.4)

    Tehnica :se efectueaza dilutii logaritmice in baza 10 ale virusurilor de testat, de la -1 la –8

    • se repartizeaza in godeurile placilor cite 25 µl mediu Eagle MEM cu 2% ser fetal
    • se inoculeaza dilutiile de la – 3 la – 8, pe cite 16 godeuri fiecare dilutie, 25 µl virus/godeu
    • in fiecare godeu se repartizeaza cite 100 µl celule (RD sau L20B)
    • placile sunt incubate la termostat la 36ºC timp de 4 zile
    • citirea la microscop pentru notarea efectului citopatic se face la 3 si 4 zile

    Calculul titrului se face dupa formula Karber :

                               log CCID50  = L – d (S – 0,5), unde

     

                             L = log celei mai mici dilutii utilizate in test

                             d = diferenta intre log dilutiilor

                             S = suma proportiilor testelor “positive” (godeuri de prezinta efect citopatic)

    Tab.4. Titrurile antigenelor poliovirusurilor Sabin

    Serotipul

                              Titrul virusului (log CCDI50 /25µl)

    L20B

    RD

    Polio 1 Sabin

    6,43

    6,25

    Polio 2 Sabin

    6.02

    6,37

    Polio 3 Sabin

    5,74

    6,30

     

    6.VERIFICAREA IDENTITATII LOTURILOR NOI DE POLIOVIRUSURI DE REFERINTA

    Verificarea identitatii noilor loturi s-a efectuat prin reactia de seroneutralizare, cu seruri neutralizante specifice de tip antipoliovirus, prin micrometoda, pe placute cu 96 godeuri.Se utilizeaza amestecuri de seruri polio astfel : polio 1+2, polio 1+3, polio 2+3, polio 1+2+3. Serotipul poliovirusului este indicat de godeurile unde nu apare efect citopatic.Tulpinile verificate, atit pe RD, cit si pe L20B s-au dovedit a apartin serotipului corespunzator. Loturile de virus astfel obtinute si verificate au fost repartizate in criotuburi si stocate la -20ºC, urmind a fi utilizate ca martori pozitivi in testele moleculare ce vor fi efectuate.

            

    7.TITRARE TULPINILOR DE POLIOVIRUS IZOLATE IN ANUL 2007

    Titrarea tulpinilor de poliovirus izolate in 2007 a fost precedata de multiplicarea acestora  pe linia celulara RD prin pasajul acestora de pe linuia L20B .

     

    Tehnica s-au  efectuat dilutii logaritmice in baza 10 ale virusurilor de testat, de la -1 la –8

    • se repartizeaza in godeurile placilor cite 50 µl mediu Eagle MEM cu 2% ser fetal
    • se inoculeaza dilutiile de la – 5 la – 8, pe cite 20 godeuri fiecare dilutie, 50 µl virus/godeu
    • in fiecare godeu se repartizeaza cite 100 µl celule (RD )
    • placile sunt incubate la termostat la 36ºC timp de 4 zile
    • citirea la microscop pentru notarea efectului citopatic se face la 3 si 4 zile

     

    Calculul titrului se face dupa formula Karber :

                               log CCID50  = L – d (S – 0,5)

     

     

     

    Tulpina

    log CCID50 

    Titrul virusului (log CCDI50

    25/1/07 PV3

    -5,45

    10 5,45/ 0,1ml

    52/2/07 PV1

    -6,75

    10 6,75/ 0,1ml

     

     

    Bibliografie

     

     

    1.        Jiang, P., Faase, J. A. J., Toyoda, H., Paul, A., Wimmer, E., Gorbalenya, A. E. (2007). Evidence for emergence of diverse polioviruses from C-cluster coxsackie A viruses and implications for global poliovirus eradication. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104: 9457-9462 

    2.        Macadam, A. J., Ferguson, G., Stone, D. M., Meredith, J., Knowlson, S., Auda, G., Almond, J. W., Minor, P. D. (2006). Rational design of genetically stable, live-attenuated poliovirus vaccines of all three serotypes: relevance to poliomyelitis eradication.. J. Virol. 80: 8653-8663

    3.        Yakovenko, M. L., Cherkasova, E. A., Rezapkin, G. V., Ivanova, O. E., Ivanov, A. P., Eremeeva, T. P., Baykova, O. Y., Chumakov, K. M., Agol, V. I. (2006). Antigenic Evolution of Vaccine-Derived Polioviruses: Changes in Individual Epitopes and Relative Stability of the Overall Immunological Properties. J. Virol. 80: 2641-2653

    4.        Yang, C.-F., Chen, H.-Y., Jorba, J., Sun, H.-C., Yang, S.-J., Lee, H.-C., Huang, Y.-C., Lin, T.-Y., Chen, P.-J., Shimizu, H., Nishimura, Y., Utama, A., Pallansch, M., Miyamura, T., Kew, O., Yang, J.-Y. (2005). Intratypic Recombination among Lineages of Type 1 Vaccine-Derived Poliovirus Emerging during Chronic Infection of an Immunodeficient Patient. J. Virol. 79: 12623-12634

    5.        Rakoto-Andrianarivelo, M., Rousset, D., Razafindratsimandresy, R., Chevaliez, S., Guillot, S., Balanant, J., Delpeyroux, F. (2005). High Frequency of Human Enterovirus Species C Circulation in Madagascar. J. Clin. Microbiol. 43: 242-249    Shimizu, H., Thorley, B., Paladin, F. J., Brussen, K. A., Stambos, V., Yuen, L., Utama, A., Tano, Y., Arita, M., Yoshida, H., Yoneyama, T., Benegas, A., Roesel, S., Pallansch, M., Kew, O., Miyamura, T. (2004). Circulation of Type 1 Vaccine-Derived Poliovirus in the Philippines in 2001. J. Virol. 78: 13512-13521

    6.        Kilpatrick, D. R., Ching, K., Iber, J., Campagnoli, R., Freeman, C. J., Mishrik, N., Liu, H.-M., Pallansch, M. A., Kew, O. M. (2004). Multiplex PCR Method for Identifying Recombinant Vaccine-Related Polioviruses. J. Clin. Microbiol. 42: 4313-4315

    7.        Oberste, M. S., Penaranda, S., Maher, K., Pallansch, M. A. (2004). Complete genome sequences of all members of the species Human enterovirus A. J. Gen. Virol. 85: 1597-1607

    8.        Liu, H.-M., Zheng, D.-P., Zhang, L.-B., Oberste, M. S., Kew, O. M., Pallansch, M. A. (2003). Serial Recombination during Circulation of Type 1 Wild-Vaccine Recombinant Polioviruses in China. J. Virol. 77: 10994-11005  

    9.        Buttinelli G, Donati V, Fiore S, Marturano J, Plebani A, Balestri P, Soresina R, Vivarelli R, Delpeyroux F, Martin J, Fiore L. Nucleotide variation in Sabin type 2 poliovirus from an immunodeficient patient with poliomyelitis. J Gen Virol. 2003; 84: 1215-21.

    10.      Caro, V, Guillot, S, Delpeyroux, F, Crainic, R. Molecular strategy for ‘serotyping’ of human enteroviruses. J Gen Virol . 2001;  82: 79–91

    11.      Cherkasova  EA, Laassri M, Chizhikov V, Korotkova E, Dragunsky E, Agol VI, Chumakov K. Microarray analysis of evolution of RNA viruses: evidence of circulation of virulent highly divergent vaccine-derived polioviruses. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2003; 100: 9398-403.

    12.      Cherkasova EA, Korotkova EA, Yakovenko ML, Ivanova OE, Eremeeva TP, Chumakov KM, Agol VI. Long- term circulation of vaccine-derived poliovirus that causes paralytic disease. J  Virol.  2002; 76: 6791-9.

    13.      Cherkasova EA, Yakovenko ML, Rezapkin GV, Korotkova EA, Ivanova OE, Eremeeva TP, Krasnoproshina LI, Romanenkova NI,. Rozaeva NR, Sirota L,. Agol VI , Chumakov KM. Spread of vaccine-derived poliovirus from a paralytic case in an immunodeficient child, an insight into the natural evolution of oral polio vaccine. J Virol. 2005; 79:1062-70.

    14.      Combiescu M, Guillot S, Persu A, Baicus A, Pitigoi D, Balanant J, Oprisan G, Crainic R, Delpeyroux F, A Aubert-Combiescu. Circulation of a type 1 recombinant vaccine derived poliovirus strain in a limited area in Romania Arch Virol. 2007;152(4):727-38. Epub 2007 Jan 3

    15.      Cuervo NS, Guillot S, Romanenkova N, Combiescu M, Combiescu AA,. Seghier M, Caro V, Crainic R, Delpeyroux F. Genomic Features of Intertypic Recombinant Sabin Poliovirus Strains Excreted by Primary Vaccinees. J Virology 2001; 75:5740-5751

    16.      Georgescu MM, Delpeyroux F, Tardy-Panit M, Balanant J, Combiescu M, Combiescu AA, Guillot S, Crainic R. High diversity of poliovirus strains isolated from the central nervous system from patients with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Virol. 1994; 68: 8089–8101.

    17.      Georgescu MM, Delpeyroux F, R. Crainic. Tripartite genome organization of a natural type 2 vaccine/nonvaccine recombinant poliovirus. J Gen Virol 1995;76:2343-2348.

    18.      Global Polio Eradication Initiative Strategic Plan 2004-2008.WHO 2003.

    19.      Guillot S, Caro V, Cuervo N, Korotkova E, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Delpeyroux F, Crainic R. Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol 2000; 74: 8434-8443

    20.       Guillot S, Otelea D, Delpeyroux F, Crainic R.Point mutation involved in the attenuation /neurovirulence alternation in type 1 and 2 oral polio vaccine strains detected by site- specific polymerase chain reaction. Vaccine 1994; 12: 503-507.

    21.      Martin J, Odoom K, Tuite G, Dunn G,.Hopewell N, Cooper G, Fitzharris C, Butler K, Hall WW, Minor PD. Long – term excretion of vaccine-derived poliovirus by a healthy child. J  Virol. 2004; 78: 13839-1384.

    22.      Martín J, Samoilovich E, Dunn G, Lackenby A, Feldman E, Heath A, Svirchevskaya E, Cooper G, Yermalovich M, Minor PD. Isolation of an intertypic poliovirus capsid recombinant from a child with vaccine-associated paralytic poliomyelitis. J Virol  2002;  76:10921-10928.

    23.      Oberste MS, Maher K, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Molecular evolution of the human enteroviruses: correlation of serotype with VP1 sequence and application to picornavirus classification. J Virol. 1999b. 73: 1941–1948.

    24.      Oberste MS, Maher K, Flemister MR, Marchetti  G, Kilpatrick DR, Pallansch MA. Comparison of classic and molecular approaches for the identification of untypeable enteroviruses. J Clin Microbiol. 2000 ; 38: 1170–1174.

    25.      Oberste  MS, Schnurr  D, Maher K, al-Busaidy  S, Pallansch  MA. Molecular identification of new picornaviruses and characterization of a proposed enterovirus 73 serotype. J Gen Virol .2001; 82: 409–416.

    26.      Oberste MS, NixWA, Maher K,  Pallansch MA. Improved molecular identification of enteroviruses by RT-PCR and amplicon sequencing. J Clin Virol. 2003;  26: 375–377

    27.      Oberste MS, Peñaranda S, Maher K, & Pallansch MA. Complete genome sequences of members of the species Human enterovirus A. J Gen Virol. 2004d; 85: 1597–1607.

    28.      Oberste MS, Kaija Maher,. Michele SM, Belliot G,  Uddin M, Pallansch MA. Enteroviruses 76, 89, 90 and 91 represent a novel group within the species Human enterovirus A.J Gen Virol. 2005; 86 : 445-451

    29.      Shimizu Hiroyuki, Thorley B, Paladin FJ,. Brussen KA, Stambos V, Yuen L, Utama A, Tano Y, Arita M, Yoshida H, Yoneyama T, Benegas A, Roesel S, Pallansch M, Kew O, Miyamura T. Circulation of Type 1 Vaccine-Derived Poliovirus in the Philippines in 2001. J  Virol.  2004; 78: 13512-13521.

    30.      Shulman LM, Manor Y, Handsher R, Delpeyroux F, McDonough MJ, Halmut T, Silberstein I, Alfandari J, Quay J,Fisher T, Robinov J, Kew OM, Crainic R, Mendelson E. Molecular and antigenic characterization of a highly evolved derivative of the type 2 oral poliovaccine strain isolated from sewage in Israel. J  Clin Microbiol. 2000; 38: 3729-34.

    31.      World Health Organization. Progress towards the global eradication of poliomyelilis, 2002. Wkly. Epidemiol. Rec 2003; 78: 138-144.

    32.      Yang C-F, Naguib T, Yang S-J, Nasr E, Jorba J, Ahmed N, Campagnoli R, van der Avoort H, Shimizu H, Yoneyama T, Miyamura T, Pallansch MA, Kew O. Circulation of endemic type 2 vaccine-derived poliovirus in Egypt from 1983 to 1993. J Virol. 2003; 77: 8366-8377.

    33.      Applied Biosystems Home Page : http://www.appliedbiosystems.com/?abhomepage=eur

    34.      Burkhard Ziebolz and Marcus Droege. 2007. Toward a new era in sequencing. Biotechnol Annu Rev. 2007;13:1-26.

    35.      Darlu P., Tassy P. 1993. Reconstruction phylogénétique. ed. by Masson (Paris, Milan, Barcelone)

    36.      Felsenstein J, 1993. PHYLIP : phylogeny inference package, version 3.5c (computer program). Distributed by the author. Department of Genetics, University of Washington, Seattle, USA.

    37.      Heller C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2001;22(4):629-43

    38.      Page, R. D. M. 1996. Computer Applications in the Biosciences 12: 357-358. TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers.

    39.      Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning : a laboratory manual. New York: ColdSpringHarbor Laboratory Press.

     

     

     

     

    GENOTYPING OF POLIOVIRUS STRAINS ISOLATED IN ROMANIA BETWEEN 2007-2010  FROM AFP CASES AND HEALTHY CONTACTS AS A MAIN OBJECTIF OF THE  GLOBAL POLIO ERADICATION  

     

    Poliomyelitis is an acute paralytic disease caused by three distinct poliovirus serotypes. The goal of the Global Polio Eradication Initiative is to stop the global transmission of poliovirus. The eradication program in most countries needs high routine coverage with at least three doses of oral poliovirus vaccine (OPV). The OPV consists of three live attenuated Sabin poliovirus strains obtained from wild strains by sequential in vitro and in vivo passages . It is safe, induces long-lasting protective systemic humoral and cellular immunity and local mucosal resistance to poliovirus infection, making it the primary tool for poliomyelitis eradication . Extraordinary progress towards eradicating polio has been made. Poliovirus transmission has been stopped in the Americas and the Western Pacific region . Only six countries were still considered endemic by the end of 2003. Europe has been declared “ polio free” since the WHO / EURO meeting on June 5th, 2002.

    However, vaccine-associated paralytic poliomyelitis (VAPP) and the development and circulation of pathogenic vaccine-derived poliovirus (VDPV) strains are the major risks of OPV. During their multiplication in humans, Sabin vaccine strains can undergo genetic variation through single or multiple nucleotide substitutions at various sites in the genome or through natural recombination. These are associated with modifications of the original attenuated phenotype, with the OPV strains acquiring wild-strain characteristics, including high pathogenicity . VAPP has been observed in unvaccinated or incompletely immunised children living in close contact with recently vaccinated children and in the vaccinated individuals. Globally, the rate of VAPP is 1 per 750,000 primary vaccinees and 1 per 12 million recipients of two vaccine doses . The described VAPP cases were most frequently associated with serotype 2 and 3 vaccine strains and rarely with the type 1 vaccine strain . In Romania, the risk of recipient VAPP was found to be higher after the introduction of the OPV in 1961 than generally recorded in OPV-using countries. This high rate was found to be associated with multiple intramuscular injections during the incubation period of the OPV strains, and subsequent measures to reduce these simultaneous injections significantly reduced the VAPP rate . Inactivated polio vaccine IPV has recently been included as the first dose of a combined immunisation (IPV followed by OPV) to reduce the number of VAPP cases further. For more than 25 years, the coverage with OPV vaccine in Romania  has been greater than  95 %.

    The prolonged replication and circulation of VDPVs (OPV strains having more than 1% nucleotide divergence from the original vaccine strains) may also adversely affect the eradication program. Recent outbreaks of poliomyelitis due to circulating VDPVs have been reported in Egypt, Hispaniola, the Philippines and Madagascar These outbreaks occurred in countries with a low vaccine coverage. This may have favoured the multiplication and circulation of OPV strains in unvaccinated children, allowing the genetic and phenotypic drift of vaccine strains towards VDPVs with wild-type poliovirus strain characteristics. The emergence of epidemic and pathogenic VDPVs threaten the final aim of the eradication program, which is the disappearance of poliovirus and the stopping of immunisation. Until now, there is little known about the factors and conditions favouring the emergence and circulation of VDPVs. Therefore, studies to improve surveillance and develop vaccine strategies to limit VDPV spread are urgently needed.

    In 2002 in Romania was isolated and  characterizated of a type 1 VDPV isolated from one acute flaccid paralysis (AFP) case with tetraplegia and eight healthy contacts with low vaccine coverage (~ 50%) from the same socio-cultural group (the Rroma community). Our results show that small populations with a low vaccine coverage living in globally well-vaccinated countries can be the origin of VDPV emergence and circulation. Although this VDPV circulated in at least nine children, only one developed paralytic disease. Host factors, such as age (five months), and genetic factors might have triggered the development of the disease caused by this neurovirulent Sabin 1/Sabin 2/Sabin 1 recombinant strain. All the other children were between one and five years of age, and only one had received two OPV doses .This suggests that surveillance for these strains needs to improve in poliomyelitis-eradicated areas still using OPV. It is often reported that recombinant genomes frequently occur among OPV strains excreted by healthy vaccinated individuals, their contacts in the community, and in patients with VAPP. Genetic recombination appears to be an integral part of poliovirus evolution. Recombination was first observed as part of the natural evolution of polioviruses in vaccine-related isolates with chimeric sequences that were excreted by children exposed to the trivalent OPV. These isolates were detected in healthy OPV recipients and in patients with VAPP. The heterologous sequences of most vaccine-related isolates were derived from the other Sabin OPV strains, with recombinants most frequently being found among serotype 2 and 3 vaccine-related isolates. However, other serotype 1 tripartite Sabin 1/Sabin 2/Sabin 1 intertypic recombinants have been reported, including one found in a case of paralytic poliomyelitis. This suggests that this tripartite arrangement offers a selective advantage to the type 1 virus or that homologous 5’ and 3’ ends are preferred by the type 1 genome and its replication machinery.

    Two reported type 1 VDPVs have been shown to be recombinants of Sabin 1 and non-OPV enteroviruses. We do not know yet whether these genetic features or host factors influence the capacity of a strain to multiply better, to persist in the gut, and/or to circulate. Our results confirm that mutant intertypic recombinants that belong to serotype 1 (with the capsid and antigenicity of Sabin 1) and that are products of genetic exchanges with other OPV strains can circulate for a long time in the population.

    In our study about the molecular  characterization of poliovirus strains by the RT-PCR-RFLP assay  and its use in the active surveillance  for acute flaccid paralysis cases in Romania between 2001-2006 67 PV strains isolated from AFP, FP cases and healthy contacts were investigated by RFLP reactions. The two regions investigated with RT-PCR-RFLP assay were chosen for the detection of recombinant strains and for confirmation vaccinal origin of strains  as for their genotyping. The frequency of appearance and profiles of recombinant genomes in 3D polimerase region for strains investigated  was 44% for S3/S2, 17% for S3/S1, 9% for S2/S1, 9% S2/ S1+S2, 4 % for S1/S2, 17% for S1/S1+S3, S3/S1+S2, S3/S2+S3, S2+S3/S1. The frequency of recombinations was 38% for  type 1 PV, 40% for  type 2 PV and 52 % for type 3 PV. Our study about seroprevalence of antibodies against poliovirus types was showed that the seroprevalence was higher fot type 1 and 2 PV  than of type 3. The implication of less seroprevalence o antibodies agains types 3 PV  (85,7%) was that most of then poliovirus strains isolated were with type 3 and that was created the local conditions for frequents  recombination events between type 3 PV and anothers serotypes. The preferences in the recombination type were  S3-like with S2-like, and S3-like with S1-like. One strain VDPV a recombinant Sabin 1/Sabin 2/Sabin1 was isolated in Romania in 2002.

    The recombination is involved in the natural evolution of Sabin strains and it was obtained the high frequency of recombinant genome in OPV strains, isolated from AFP cases (45%), FP cases (60%) and healthy contacts (26%). In  our study from all VAPP cases only in 2 cases, the RFLP profiles in 3D region were S3/S1, but the profile of  the VDPV Sabin1/Sabin2/Sabin1, triple recombinant strain is one proof  that is very important the site, the type of recombination, association with the mutation in the capsid coding region and the host factors for a strain to be responsible for disease. In this situation the establishment of sensitive surveillance.

    In those parts of the world where the circulation of wild strains of poliovirus has been stopped, the risk of emerging VDPV circulating in routinely OPV-vaccinated populations raises the question of whether immunisation should not be with IPV alone or with a combined IPV/OPV schedule .

    This reaffirms the importance of active surveillance for acute flaccid paralysis and poliovirus in both polio-free and polio-endemic countries and is also a strong argument against continuing to use OPV alone for polio immunisation once circulation of wild polioviruses has stopped.

     

     

     

    Methodology of research-  Materials and methods

    1. Virus isolation and initial characterization.

    Samples collected between 2007-2010 (from about 140 AFP cases   and from their healthy contacts) will be  processed according to a standard protocol for virus isolation and characterization at the NationalReferenceCenter for Enteroviruses in the Cantacuzino Institute, Bucharest, Romania. L20B (a genetically engineered mouse cell line expressing the human poliovirus receptor PVR) and RD cells (derived from a rhabdomyosarcoma) will be  inoculate with the samples, as recommended by WHO for human enterovirus (HEV) detection . L20B and RD will  grow in monolayers in Dulbecco’s modified Eagle’s medium supplemented with 10% foetal calf serum. Once the complete cytopathic effect (CPE) will be obtaine, the infected cells will be  harveste and kept frozen (–20°C) until typing.

    Identification of viral isolates Viruses isolated on L20B cells and on RD cells will be serotype by neutralization with pools of locally produced poliovirus horse antisera and will be  confirme with monotype specific antisera. Our study show that between 2007-2010 can be isolate about 30 poliovirus strains.

    2. Molecular characterization

    The molecular method will be  RT-PCR –RFLP developed by I. Pasteur Paris and  we will try to introduce the WHO technique in the National Polio Laboratory.   The technique will be apply to  30 poliovirus strains and to Sabin strains. It will be investigated 3 genomic regions for detection point mutations and recombination appeareance.

     

    RT-PCR assay

    The viral supernatant diluted 1/10 (2 ml), RNasin 0.5 ml (20 U) and antisense primer 1ml (10 pmol) will be heat at 80°C for 5 min and then annealed by incubation at 50°C for 5 min. A mixture of 4 ml of transcriptase buffer (5X), 1ml of deoxynucleoside triphosphate (10 mM), 1U of avian myeloblastosis virus reverse transcriptase, and distilled water to a final volume of 20 ml will be  add to the annealed template-RNA solution. Transcription will be allow to occur by incubation at 50°C for 30 min. The reverse transcription (RT) products will be  denaturate  at 95°C for 5 min and then immediately placed on ice. The amplified fragment will  name according to the corresponding region of the PV genome. PCR amplification will be  carried out with 20 ml of the transcription product to which will  add 80 ml of the following: 3 ml of Taq buffer 10X with no MgCl2, 1ml (10 pmol) of sense primer, 1.25 U of Taq DNA polymerase, and distilled water to 80 ml. The PCR program have  29 cycles of 95°C for 20 sec, 45°C for 1 min,  and 70°C for 1 min, followed by one terminal elongation cycle of 95°C for 20 sec, 45°C for 1 min and 70°C for 10 min. The primers use are:

    UG24: (1913)-GACACCATGATTCCCCTTAA-(1932)

    UC1: (2881)-GAATTCCATGTCAAATCTAGA-(2862)

    UG19: (2870)-GACATGGAATTCACCTTTGTGG-(2891)

    UC13: (3648)-TAGTACTTAGCTTCCATGTA-(3629)

    UG17: (6536)-TCAGTGGCCATGAGAATGGC-(6555)

    UC10: (7464)-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTC-(7441)

     

    RFLP : restriction fragment length polymorphism (RFLP) assaywill be do for  three different genomic regions amplified by reverse transcription–polymerase chain reaction (RT-PCR) and 3 different rrestriction enzymes  DdeI, HinfI, RsaI. 

     

    Nucleotide sequence analysis- only  for strains with RFLP modified profils

    PCR products will be sequence with the primers used for RT-PCR. Before sequencing, the PCR products will be  purifie either directly after amplification on Qiaquick spin columns (Qiagen) or by isolating bands from low-melting-point agarose gels after electrophoresis using standard techniques The 5′-end of the viral genome will be amplificate  with the 5′/3′ RACE kit (Roche). PCR products will be sequence using the Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit, following the procedure recommend by Applied Biosystems, Perkin-Elmer. Sequences will be aligne using Clustal W software version 1.6 .

     

    Phylogenetic analysis of nucleotide sequences.

    Phylogenetic relationships will be do with the DNADist/Neighbor programs of of PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5

    3.Epidemiologycal examination

    Recommended WHO Case Definitions

    • Suspected case: any case of acute-onset flaccid paralysis (AFP) -including Guillain-Barré syndrome- in a person under 15 years of age for any reason other than severe trauma, or paralytic illness in a person of any age in which polio is suspected. The classification "suspected case" is temporary. It should be reclassified as "probable" or "discarded" within 48 hours of notification.
    • Probable case: a case in which AFP is found, and no other cause for the paralysis can be identified immediately. The classification of "probable case" is also temporary; within 10 weeks of onset the case should be reclassified as "confirmed", "compatible", "vaccine-associated" or "discarded."
    • Confirmed case: a case with acute paralytic illness with or without residual paralysis, and isolation of wild poliovirus from the stools of either the case or its contacts.
    • Polio-compatible case: a case in which one adequate stool specimen was not collected from a probable case within 2 weeks of the onset of paralysis, and there is either an acute paralytic illness with polio-compatible residual paralysis at 60 days, or death takes place within 60 days, or the case is lost to follow-up.
    • Vaccine-associated Paralytic Poliomyelitis: a case with acute paralytic illness in which vaccine-like poliovirus is isolated from stool samples, and the virus is believed to be the cause of the disease. There are two possible types of vaccine-associated paralytic poliomyelitis (VAPP): recipient and contact. A case classified as a recipient is a person who has onset of AFP 4 to 40 days after receiving OPV and has neurologic sequelae compatible with polio 60 days after the paralysis began. A case is classified as a contact VAAP when a person who has residual paralysis 60 days after the onset of AFP had contact 4 to 40 days before the paralysis began with a person who received OPV somewhere between 4 and 85 days before the contact’s paralysis began.
    • Discarded (Not Poliomyelitis): a case with acute paralytic illness for which one adequate stool specimen was obtained within 2 weeks after onset of paralysis and was negative for poliovirus.
    • Vaccine associated paralytic polio (VAPP) is a rare form of poliomyelitis caused by a VDPV.  A VAPP case is defined by acute paralytic illness in which vaccine-like poliovirus is isolated from stool samples, and the virus is believed to be the cause of the disease.

    Vaccine-derived poliovirus (VDPV) is defined as a live, attenuated strain of the virus contained in the Oral Polio Vaccine which has mutated and reverted to a neurotropic form, capable of causing Vaccine-associated paralytic polio (VAPP).  VDPVs differ from the parental Sabin Strains at 1 to 15% of VP1 nucleotides.  There are three recognized types of VDPVs:

    1.         cVDPVs (circulating vaccine-derived polioviruses) that are associated with sustained person-to-person transmission and considered to be circulating in the environment; 

    2.         iVDPVs (immuno-deficient excretors of vaccine-derived poliovirus) isolated from immunodeficient patients who have prolonged infections after exposure to OPV; and a VDPVs which are clinical isolates from patients with no recognized immunodeficiency and not associated with an outbreak, or environmental isolates whose ultimate source has not been identified.

    PROIECT IDEI CNCSIS Nr. 219

    Durata proiect 36 luni (1.octombrie 2007- 15.septembrie 2010)

    Director de proiect Dr. Anda Baicus

    Sef de lucrari UMF Carol Davila

    “Genotiparea tulpinilor de poliovirus izolate in Romania in perioada 2007-2010 de la cazurile cu PAF si contactii sanatosi ai acestora ca obiectiv major al procesului de Eradicare a Poliomielitei”

    În mai 1988  cea de-a 41a Adunare Mondială a Sănătăţii a propus Statelor membre ale OMS Eradicarea Globală a Poliomielitei până în anul 2000 şi ulterior, ca urmare a evoluţiei circulaţiei tulpinilor de poliovirus sălbatic la nivel global, în 2003 a fost adoptat Planul Strategic de continuare a Programului de Eradicare Globală a poliomielitei pentru 2004-2008. Din iunie 2002 Europa a fost Certificată  “polio free”.

    Acest program cuprinde două componente majore: asigurarea imunizării tuturor copiilor de pe glob şi supravegherea circulaţiei poliovirusurilor pentru a se putea certifica în cunoştinţă de cauză încetarea circulaţiei poliovirusurilor sălbatice. Aceasta se realizează prin funcţionarea la parametri optimi ai unei reţele de laboratoare naţionale acreditate de OMS şi de laboratoare regionale de referinţă la care sunt arondate aceste laboratoare. Eficacitatea supravegherii virologice a circulaţiei poliovirusurilor în populaţiile diverselor zone de pe glob a beneficiat în ultimul deceniu al sec. XX de două inovaţii tehnice majore:

    1. Obţinerea prin manipulare genetică a şoarecilor transgenici în al căror genom a fost inserată gena umană care codifică informaţia pentru sinteza receptorului pentru poliovirus. Pe de altă parte, pornind de la aceşti şoareci s-a realizat o linie celulară transplantabilă în serie pe care, dintre toate enterovirusurile umane, nu se poate multiplica decât poliovirusul. O asemenea linie celulară, L20B, este utilizată obligatoriu de către toate laboratoarele naţionale OMS pentru inocularea tuturor probelor testate pentru prezenta de poliovirusuri.

    2. Generalizarea utilizării tehnicilor moleculare de caracterizare a tulpinilor de poliovirus şi investigarea cu ajutorul lor a tuturor tulpinilor de poliovirus izolate în lume.

    Situatia pe plan national si internationala la nivelul domeniului si a tematicii propuse

    Având în vedere obiectivele Iniţiativei de Eradicare a poliomielitei în România este menţinut un sistem activ de supraveghere a circulaţiei tulpinilor de poliovirus pe întreg teritoriul care corespunde întru totul recomandărilor şi cerinţelor OMS.

    Aspectul evoluţiei poliomielitei în România în  perioada 1927-1960 a fost sporadică şi  epidemică; în anii 1927, 1946, 1953-1959 evoluţia a avut caracter epidemic, în special în anul 1957, când indicele de morbiditate a fost mai mare de 15 0/0000. Introducerea şi utilizarea amplă a VPI (vaccin polio inactivat) în 1957 şi VPO (vaccin polio oral atenuat) în 1961 a fost urmată de eliminarea virtuală a poliomielitei. Incidenţa raportată a poliomielitei paralitice a scăzut de la aproximativ 10 cazuri la 100 000 locuitori în 1949 la 0,1 cazuri la 100 000 locuitori la mijlocul anului 1980.

    Utilizarea VPO pentru vaccinarea populaţiei infantile ridică probleme legate de potenţialul reversiei la neurovirulenţă. Foarte curând după introducerea vaccinării cu VPOT (vaccin polio oral trivalent) au apărut cazurile de poliomielită asociată vaccinării (VAPP) la recipienţii  primei doze de vaccin (1 caz apărut la 750 000 doze administrate) şi la contacţii nevaccinaţi ai acestora; pe de altă parte, s-a demonstrat posibilitatea apariţiei tulpinilor derivate din vaccin VDPV (cu mai mult de 1% mutaţii la nivelul regiunii genomului care codifică proteina capsidală VP1 în comparaţie cu tulpina Sabin homotipică originală). Serotipurile Sabin 2 şi 3 reversează mai uşor la fenotipul neurovirulent în comparaţie cu serotipul 1; nici un serotip nu este genetic stabil. Riscul apariţiei VAPP descreşte pentru fiecare individ cu creşterea numărului de doze vaccinale primite.

    În România frecvenţa apariţiei cazurilor de poliomielită paralitică asociată vaccinării (VAPP) a fost în medie de 1,5 cazuri /an cu începere din 2000, cu alte cuvinte riscul de apariţie al VAPP este în prezent comparabil cu cel întâlnit şi în alte regiuni unde imunizarea antipoliomielitică se face aproape exclusiv cu VPOT. Dar nu este mai puţin adevărat că şi la noi, ca în toate ţările în care s-a reuşit eliminarea din circulaţie a poliovirusurilor sălbatice dar se utilizează încă VPOT pentru imunizarea antipolio, singurele cazuri de poliomielită paralitică ce se mai înregistrează sunt tocmai cele provocate de vaccin (VAPP).

    Apariţia cazurilor VAPP odată cu extinderea utilizării VPOT a impus încă din anii ’60  ai secolului trecut găsirea unor metode care să  permită diferenţierea tulpinilor vaccinale de cele sălbatice; au apărut astfel testele de diferenţiere intratipică, iniţial cu anticorpi policlonali obţinuţi cu scheme particulare de imunizare, apoi cu anticorpii policlonali utilizaţi în testele ELISA-OMS – utilizând seruri RIVM de iepure (Belgia) absorbite încrucişat cu tulpini prototip aparţinând aceluiaşi serotip (tulpina Sabin, respectiv cea parentală sălbatică) şi ulterior cu anticorpi monoclonali. Dar chiar şi aşa s-a constatat că există tulpini care nu pot fi clasate nici ca Sabin nici ca tip sălbatic.

    Toate aceste informaţii legate de mutaţiile apărute la nivelul situsurilor de neutralizare au fost confirmate în momentul apariţiei  metodelor moleculare de investigare a genomului (PCR-RFLP, secvenţiere).

    Aceste tehnici moleculare de investigare a genomului enterovirusurilor, care au intrat în arsenalul curent al laboratoarelor naţionale şi / sau regionale OMS încă din ultimul deceniu al secolului XX, au permis nu numai diferenţierea intratipică fără echivoc a tuturor tulpinilor de poliovirus izolate ci au evidenţiat şi alte două categorii de modificări genomice ale tulpinilor de poliovirus:

    A) tulpini derivate din tulpinile Sabin dar care, în urma circulaţiei un timp mai îndelungat în populaţiile susceptibile (cu grad insuficient de acoperire vaccinală) au acumulat un număr de mutaţii care afectează  peste 1% din totalul nucleotidelor genomului (VDPV); emergenţa tulpinilor VDPV epidemice şi patogene ameninţă „din interior” obiectivul programului de eradicare care constă în dispariţia tulpinilor de poliovirus şi stoparea vaccinării. Condiţiile  implicate în emergenţa acestor tulpini sunt puţin cunoscute, motiv pentru care studierea acestora ca şi dezvolarea unor strategii vaccinale pentru limitarea transmiterii acestor tulpini sunt imperios necesare. Epidemii de poliomielită provocate de VDPV  au fost raportate în Egipt şi, mai recent, în Republica Dominicană, Filipine şi Madagascar.

    B) prezenţa în circulaţie, cu deosebire în populaţiile infantile vaccinate cu VPOT, a unor proporţii apreciabile de virusuri recombinante (între tulpini Sabin de diverse serotipuri, între poliovirusuri Sabin şi tulpini sălbatice fie de poliovirus, fie de enterovirusuri nepoliomielitice).

    Se ştie astăzi că recombinarea genetică pare să joace un rol major în evoluţia naturală a enterovirusurilor. Totuşi, frecvenţa mare cu care se întâlnesc la excretorii de tulpini Sabin  recent vaccinaţi recombinanţi între 2 sau chiar 3 parteneri Sabin poate fi privită ca un efect iatrogen, întrucât administrarea unui vaccin viu trivalent creiază condiţii optime pentru infectarea simultană a unor celule cu două particule cu serotipuri diferite, premiză obligatorie pentru producerea recombinării genetice.

    Mai mult decât atât, nu este exclus ca între producerea de recombinanţi şi apariţia de VDPV în circulaţie să existe o corelaţie, întrucât majoritatea VDPV implicate în producerea de paralizii de tip poliomielitic s-au dovedit a fi recombinanţi inter-Sabin sau Sabin / Sălbatic (polio sau enterovirus non-polio); este posibil ca asemenea recombinanţi să aibe anumite avantaje selective în comparaţie cu populaţiile de tulpini Sabin recombinate, care le permite o persistenţă mai bună în populaţiile de indivizi susceptibili, şi ca urmare duce la acumularea în timp a numărului de mutaţii caracterisitice tulpinilor VDPV (peste 1% în raport cu tulpina originală Sabin).

    In studiul pe care l-am efectuat pe o perioada de 6 ani  (2001-2006) si care a facut obiectul tezei mele de doctorat  privind „ Diferentierea intratipica a tulpinilor de poliovirus izolate de la cazurile cu PAF (paralizie acuta flasca ) si contactii sanatosi ai acestora prin metode imunologice si moleculare” am prezentat rezultatele de laborator ale investigaţiilor virologice şi moleculare ce au vizat toate tulpinile izolate pe teritoriul României stabilind astfel un profil epidemiologic al circulatiei acestora.

    Au fost investigate virologic în cadrul CNRE din INCDMI Cantacuzino,  produse patologice provenind de la un număr de 430 de cazuri  (214 PF şi 216 PAF)  şi de la 2150 contacţi sănătoşi. Au fost izolate în total 68 de tulpini de poliovirus după cum urmează : de la cazuri de PAF : 21 (30%), de la cazuri de PF( paraliziilor faciale): 5 (7%) şi de la contacţi sănătoşi : 42 (63%).

    În ce priveşte frecvenţa de izolare a poliovirusurilor aparent de două ori mai mare la cazurile de PAF în comparaţie cu cazurile de PF şi cu contacţii sănătoşi, aceasta se datoreşte în special vârstelor mai mici ale majorităţii copiilor cu PAF, şi ca atare şanselor mai mari de a-i fi surprins în perioada excretării de virusuri vaccinale după dozele de VPOT primite. Oricum, frecvenţele de izolare a poliovirusurilor (Sabin-like) de la cazurile de PAF (fără VAPP), PF şi de la contacţii sănătoşi nu diferă semnificativ între ele; ele trădează de fapt nivelul de circulaţie al tulpinilor Sabin de poliovirus într-o populaţie imunizată aproape exclusiv cu VPOT.

    In anul 2005 am reusit cu ajutorul suportului asigurat de Institutului Pasteur Paris – Centrul Colaborator OMS pentru studierea Enterovirusurilor  transferul tehnologic si realizarea unui minilaborator de biologie moleculara in cadrul Centrului National de Referinta pentru Enterovirusuri asigurand astfel o rapiditate  a confirmarii originii vaccinale sau derivate din vaccin a tulpinilor de poliovirus izolate folosind tehnica RT-PCR-RFLP, dar se impune extinderea si a tehnicii de secventiere a genomului tulpinilor  de poliovirus. Existenta unor zone cu risc in care acoperirirea vaccinala este scazuta impune in conditiile izolarii unei tulpini rapiditate diagnostica in vederea eventualei instituiri a alertei epidemiologice in focar.

    Ţările în care vaccinarea intensă a determinat eradicarea poliomielitei produsă de poliovirusul sălbatic sunt expuse importului acestuia din ţări endemice sau emergenţei tulpinilor derivate din vaccin. Acest lucru a fost confirmat cu ocazia recentelor epidemii cu poliovirus sălbatic importat care au apărut în Yemen şi Indonezia deoarece nu s-a persistat în menţinerea unei acoperiri vaccinale corespunzătoare. Astfel s-a realizat implantarea unui virus de import şi circulaţia lui în populaţia respectivă. Nu putem fi de acord cu termenul de “epidemie de import” apărut în unele publicaţii, deoarece ceea ce este importat este virusul ce determină apariţia bolii la primul caz, răspândirea virusului fiind apoi favorizată de condiţiile locale.

    Episodul Babadag 2002 şi studierea acestuia demonstrează că în grupuri mici populaţionale care trăiesc în condiţii socio-economice  particulare în cadrul unei ţări certificate “ polio –free” pot apărea şi circula tulpini derivate din vaccin (VDPV). Elucidarea acestui episod a fost un exemplu extrem de ilustrativ al eficacităţii sistemului de supraveghere virologică introdus de OMS la nivel naţional şi regional.

    Izolarea unei tulpini tip 1 PV din materiile fecale şi exudatul faringian ale unui pacient cu paralizie acută flască, a crescut îngrijorarea deoarece tipul 1 este foarte rar  întâlnit în producerea cazurilor VAPP şi deci era justificată suspectarea originii sălbatice a tulpinii izolate. Acest lucru a stat la baza clasificării ca « fierbinte » (“hot“) a cazului respectiv, conform criteriilor OMS.

    Factorii şi condiţiile ce au  favorizat emergenţa şi circulaţia tulpinii VDPV în România trebuie foarte bine înţelese. Acoperirea vaccinală cu 4 doze TOPV în primul an de viaţă, raportată în România este peste 90%. Cu toate acestea  în comunitatea rromă din rândul căreia făcea parte şi cazul PAF analizat , acoperirea vaccinală era scăzută (<50%). Densitatea populaţională ridicată (în special pentru comunităţile ce trăiesc în condiţii socio-economice şi sanitare precare), combinată cu acoperirea vaccinală scăzută, poate crea condiţii locale ce determină circulaţia interumană a tulpinilor vaccinale care pot suferi modificări genetice (mutaţii, recombinări) urmate de emergenţa VDPV. Populaţia rromă reprezintă aproximativ 30% din totalul locuitorilor oraşului Babadag (11000 locuitori). Acest lucru sugerează că tulpinile din OPV pot găsi suficienţi indivizi susceptibili la infecţie în aceste grupuri, tulpinile putând circula în populaţie şi achiziţiona caractere de patogenitate. Cu toate acestea nu putem exclude faptul că o tulpină pre-VDPV a pătruns în rândul comunităţii din exterior. Tulpinile VDPV nu au fost izolate de la alţi copii spitalizaţi în Babadag, mulţi dintre ei neaparţinând comunităţii rrome sau de la copii din alte oraşe aparţinând unor grupuri cu risc crescut la infecţia cu poliovirus. Caracterizarea moleculară a tulpinii izolate de la cazul PAF şi a unora din tulpinile de tip 1 izolate de la contacţi sănătoşi a arătat că în comparaţie cu tulpina Sabin vaccinală tip 1, rata substituţiei nucleotidice a fost ± 1.2%. Cu aproape 1% substituţie nucleotidică pe an, multiplicarea şi circulaţia acestor tulpini de poliovirus este calculată la aproximativ 14 luni înaintea izolării.
    Una din tulpini are în comun numai 50% din substituţii cu altă tulpină VDPV, demonstrând că divergenţa a două grupuri de tulpini s-a produs aproximativ la jumătatea intervalului de circulaţie (cu aproximativ 7 luni înaintea izolării. Aceasta sugerează că au existat două lanţuri de transmisie independente în Babadag pentru câteva luni. Secvenţierea genomului a trei tulpini VDPV a demonstrat că erau triplu recombinante intertipic Sabin 1 / Sabin 2 / Sabin 1 cu localizarea situsului de recombinare la nivelul regiunii care codifică proteinele virale 2A şi  2C. Aceasta indică originea dintr-un strămoş comun a tulpinilor VDPV izolate.

    Genomurile recombinante apar frecvent la tulpinile excretate de recipienţii de vaccin, contacţii sănătoşi ai acestora şi la pacienţi cu VAPP. Recombinarea este recunoscută astăzi ca fiind parte naturală a evoluţiei poliovirusurilor. Aceste tulpini au fost detectate prima dată la recipienţi de vaccin şi pacienţi VAPP (Cammack N şi col, 1988; Blomqvist S şi col, 2003;  Furione M şi col, 1993; Guillot S şi col, 2000; King AMQ şi col, 1988; Martín J şi col, 2002).

    Alt poliovirus de serotip 1 recombinant intertipic tripartit Sabin 1 / Sabin 2 / Sabin 1 a mai fost raportat în Rusia fiind şi el implicat în producerea unui caz de poliomielită paralitică (Cherkasova EA şi col, 2002). Aceasta sugerează că acest aranjament tripartit oferă avantaje selective pentru tipul 1, fie la nivelul interacţiunii cu receptorii celulari, fie la nivelul eficienţei replicării virale.

    Un procent redus de tulpini cu profil recombinant prezintă secvenţele capsidale derivate din tulpinile vaccinale Sabin şi secvenţele non capsidale derivate din alte enterovirusuri (poliovirusuri sălbatice sau enterovirusuri non polio) (Georgescu MM, Delpeyroux F, Crainic R, 1995). Acest aspect este prezent mai ales în cazul tulpinilor VDPV implicate în epidemii (Kew OM şi col, 2002; Yang C-F şi col, 2003; Shimizu Hiroyuki şi col, 2004; Rousset D şi col, 2003). Au fost raportate două situaţii când tulpini VDPV tip 1 au fost recombinanţi între Sabin 1 şi enterovirusuri non polio (Kew OM şi col, 2002 ; Shimizu Hiroyuki şi col, 2004).  Nu se ştie încă dacă aceste trăsături genetice ale virusului sau anumiţi factori ai gazdei influenţează capacitatea unor tulpini recombinante de a se multiplica mai bine, de a persista mai mult timp în intestin şi / sau de a circula mai mult timp în populaţii susceptibile. Rezultatele noastre confirmă că recombinanţii intertipici care aparţin serotipului 1 PV (cu antigenitate capsidală Sabin 1) şi care au apărut prin schimburi de secvenţe între tulpinile vaccinale VPO pot circula pentru o lungă perioadă de timp în populaţie .

    Deşi această tulpină VDPV a fost izolată din intestinul a 9 copii, numai unul a dezvoltat boala paralitică.  Factorii gazdei, vârsta (5 luni) şi factorii genetici au favorizat apariţia bolii în urma infecţiei intestinale cu tulpina neurovirulentă recombinant Sabin1 / Sabin 2 / Sabin 1.  Din cei 8 contacţi cu vârste cuprinse între 1 şi 5 ani numai unul fusese vaccinat anterior cu 2 doze de TOVP. Cazul de la Babadag s-a confirmat caz de poliomielită produs de o tulpină VDPV, dar întrucât această tulpină, deşi a circulat în populaţie, nu a mai produs nici un alt caz de paralizie, clasificarea cazului a fost făcută împreună cu experţii OMS, ca fiind VAPP.

    Riscul emergenţei şi circulaţiei tulpinilor VDPV rămâne o problemă pentru populaţia vaccinată de rutină cu VPO, chiar şi în acele părţi ale lumii în care circulaţia tulpinilor de poliovirus sălbatic a fost stopată; el este favorizat mai ales de existenţa unor grupuri mici populaţionale care trăiesc în condiţii socio-economice şi igienice precare şi la care acoperirea vaccinală nu este corespunzătoare.

    Una câte una ţările care în anii 60-70 au vaccinat predominent sau exclusiv cu VPOT au renunţat la utilizarea acestui vaccin şi au trecut la imunizarea cu VPI fie direct, fie adoptând tranzitoriu o schemă de vaccinare succesivă VPI-VPOT (SUA) urmată de vaccinarea numai cu VPI. Ideea vaccinării succesive este că VPI conferă protecţie individuală tuturor vaccinaţilor (min. 2 doze) iar administrarea ulterioară a una sau 2 doze VPOT completează imunitatea cu componenta ei locală intestinală, reducându-se foarte mult riscurile apariţiei cazurilor VAPP.   Importanţa menţinerii unei supravegheri active a cazurilor de paralizie acută flască (PAF) şi a circulaţiei tulpinilor de poliovirus pe teritoriul României, confirmarea originii vaccinale/derivate din vaccin prin tehnicile de biologie moleculara precum şi menţinerea unei acoperiri vaccinale foarte ridicate prin utilizarea fie a VPI, fie a VPOT, fie a unei scheme VPI + VPOT  în rândul populaţiei infantile, cel puţin până când circulaţia tulpinilor de poliovirus sălbatic va fi fost stopată la nivel global ramane un obiectiv strategic al Planului Global de Eradicare a Poliomielitei.

    Bibliografie

    • Balanant J, Guillot S, Candrea A, Delpeyroux F,  Crainic R (1991) The natural genomic variability of poliovirus analyzed by a restriction fragment length polymorphism assay. Virology 184: 645-654
    • Combiescu M, S Guillot, A Persu, A Băicuş, D Pitigoi, J Balanant, G Oprisan, R Crainic, F Delpeyroux, AA Combiescu. (2007). Circulation of a type 1 recombinant vaccine-derived poliovirus strain in a limited area in Romania Archives of Virology
    • Cherkasova EA, Korotkova EA, Yakovenko ML, Ivanova OE, Eremeeva TP,Chumakov KM, Agol VI (2002) Long- term circulation of vaccine-derived poliovirus that causes paralytic disease. J  Virol 76: 6791-9
    • Cherkasova EA, Laassri M, Chizhikov V, Korotkova E, Dragunsky E, Agol VI, Chumakov K (2003) Microarray analysis of evolution of RNA viruses: evidence of circulation of virulent highly divergent vaccine-derived polioviruses. Proc Natl Acad Sci USA 100: 9398-403
    • Cherkasova EA, Yakovenko ML, Rezapkin GV, Korotkova EA, Ivanova OE, Eremeeva TP, Krasnoproshina LI, Romanenkova NI,. Rozaeva NR, Sirota L, Agol VI , Chumakov KM (2005) Spread of vaccine-derived poliovirus from a paralytic case in an immunodeficient child, an insight into the natural evolution of oral polio vaccine. J Virol 79: 1062-70
    • Guillot S, Otelea D, Delpeyroux F, Crainic R (1994) Point mutation involved in the attenuation /neurovirulence alternation in type 1 and 2 oral polio vaccine strains detected by site- specific polymerase chain reaction. Vaccine 12: 503-507
    • Guillot S, Caro V, Cuervo N, Korotkova E, Combiescu M, Persu A, Combiescu AA, Delpeyroux F, Crainic R (2000) Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus strains in humans. J Virol 74: 8434-8443
    • Rousset D, Rakoto-Andrianarivelo M, Razafindratsimandresy R, et al (2003) Recombinantvaccine-derived poliovirus in Madagascar. Emerg Infect Dis 9: 885-7
    • World Health Organization (1997/2004) Polio laboratory manual WHO/IVB/04.10 World Health Organization, Geneva, Switzerland
    • World Health Organization. Expanded Programme on Immunization (1988) Global eradication of poliomyelitis by the year 2000. Weekly Epidemiological Record 63: 161-162World Health Organization (2003) Progress towards the global eradication of poliomyelilis, 2002

    Obiectivele proiectului

    Obiectivele Iniţiativei de Eradicare Globala a poliomielitei sunt: dispariţia cazurilor de poliomielită provocate de poliovirusul sălbatic, absenţa poliovirusurilor sălbatice în produse patologice şi în probele prelevate din mediul înconjurător.

    Obiectivele studiului sunt:

    Evaluarea variaţiei genetice a tulpinilor de poliovirus izolate, prin analiza polimorfismului segmentelor de ADN provenite dintr-o regiune a genomului (RFLP), ce urmează revers transcrierii conform protocolului elaborat de Institutul Pasteur Paris  (S. Guillot şi col, 2000).

    Secvenţierea prin PCR, integrată în sistemul automat cu fluorocromi ce  permite secvenţierea directă a produsului obţinut prin PCR, fără clonare prealabilă. ca procedeu folosit  pentru caracterizarea moleculară a tulpinilor  ce vor prezenta profiluri RFLP modificate raportate la profilurile tulpinilor Sabin vaccinale

    Analiza secventelor si analiza filogeneticăalinierea multiplă a secvenţelor

    Implementarea in practica a tehnicii de secventiere in vederea extinderii studiului si asupra tulpinilor de enterovirusuri non polio izolate de pe teritoriul Romaniei

    Imbunatatirea capacitatilor necesare participarii la proiecte internationale

    Formarea de noi specialisti in domeniu

    Implicarea tinerilor studenti in cercetarea stiintifica fundamentala in vederea formarii lor ca si cercetatori

    Prezentarea rezultatelor privind progresele facute de Romania la reuniunile OMS, cele ale Grupului de Studiu Pentru Enterovirusuri din cadrul Retelei Institutelor Pasteur si Institutelor Asociate , la manifestari stiintifice interne si internationale , publicarea rezultatelor in reviste de specialitate


    link medline Baicus A


    Baicuş A, Combiescu M, Persu A, Aubert-Combiescu A.

    Immune status to polioviruses in the child population of Romania between 2002-2005 as indicated by serological investigation in cases of acute flaccid paralysis (AFP) and facial paralysis (FP) and its use as a “national reference value” to evaluate the vaccination coverage in particular groups of healthy children.

    Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2006 Oct-Dec;110(4):1004-11.

    PMID: 17438916 [PubMed - indexed for MEDLINE]

     

    Baicus C, Baicus A.

    Spirulina did not ameliorate idiopathic chronic fatigue in four N-of-1 randomized controlled trials.

    Phytother Res. 2007 Jun;21(6):570-3.

    PMID: 17335116 [PubMed - indexed for MEDLINE]

     

    Combiescu M, Guillot S, Persu A, Baicus A, Pitigoi D, Balanant J, Oprisan G, Crainic R, Delpeyroux F, Aubert-Combiescu A.

    Circulation of a type 1 recombinant vaccine-derived poliovirus strain in a limited area in Romania.

    Arch Virol. 2007;152(4):727-38. Epub 2007 Jan 3.

    PMID: 17195957 [PubMed - indexed for MEDLINE]

     

    Băicuş C, Boloşiu HD, Tănăsescu C, Băicuş A.

    [Fever of unknown origin: 1. Etiology. A prospective multicenter study of 164 patients]

    Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2003 Jul-Sep;107(3):545-50. Romanian.

    PMID: 14756059 [PubMed - indexed for MEDLINE]

     

    Băicuş C, Boloşiu HD, Tănăsescu C, Băicuş A.

    [Fever of unknown origin in Romania. II. Diagnostic Procedures. Prospective multicenter study of 164 patients]

    Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 2003 Oct-Dec;107(4):772-80. Romanian.

    PMID: 14756018 [PubMed - indexed for MEDLINE]

     

    Baicus C, Bolosiu HD, Tanasescu C, Baicus A.

    Fever of unknown origin-predictors of outcome. A prospective multicenter study on 164 patients.

    Eur J Intern Med. 2003 Jul;14(4):249-254.

    PMID: 12919841 [PubMed - as supplied by publisher]