Proiect CEEX nr. 158/2006

Descarca Ghid Proiect

Denumirea proiectului : „Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicaţii în dezvoltarea unor sisteme de diagnostic şi terapeutice”

Responsabil de proiect: Dr. Gabriela Oprişan, biolog principal, CS II, goprisan@cantacuzino.ro

CO – INCDMICantacuzino: CSII Dr. Gabriela Oprişan; Camelia Szmal; Sorin Dinu; Ana-Maria Oprişoreanu; Mircea Panait
Parteneri:
P1 – Institutul de Virusologie „Şt. S. Nicolau” – Conf. Dr. Simona Ruţă, CS I; Camelia Sultana; Irina Alexiu; Loredana Manolescu; Gabriela Anton; Camelia Grancea; Ana Neagu; Carmen Sencovici
P2 – Spitalul Clinic de Boli Infecţioase şi Tropicale „Dr. Victor Babeş”: Dr. Graţiela Ţârdei; Petre Iacob Calistru; Adriana Moţoc; Ştefan Lazăr; Camelia Ionescu; Augustina Culinescu
P3 – Universitatea de Medicină şi Farmacie „Carol Davila”: Prof. Dr. Emanoil Ceauşu; Cristiana Cristea; Ghe. Voiculescu
P4 – Institutul de Sănătate Publică „Prof. Dr. Leonida Georgescu” Timişoara: Dana Brehar-Cioflec; Emilian Damian Popovici; Graţiana Chicin; Camelia Claici

 

 Variabilitatea virusului hepatitei virale C pare sã influenţeze performanţele testelor actuale de diagnostic, bazate numai pe antigene provenite din HCV de tip 1. Romania este ţara cu cea mai mare prevalenţã a infecţiei cu HCV din regiunea balcanicã. Sistemele de serodiagnostic curente sunt considerate neadecvate pentru screening-ul unor populaţii infectate cu alte genotipuri decat 1. Prin acest studiu ne-am propus sǎ evaluǎm impactul diversitǎţii genetice asupra capacitǎţii de detecţie a sistemelor de diagnostic actuale. Prin mutaţie şi recombinare noile variante virale pot fi avantajate selectiv şi pot căpăta proprietǎţi noi. Evidentierea acestor fenomene poate contribui atât la înţelegerea biologiei acestui virus şi a patogenităţii sale cît şi pentru ameliorarea diagnosticului şi a tratamentului. Printr-un studiu molecular extins se vor obţine si informaţii epidemiologice legate identificarea căilor de transmitere şi a focarelor de infecţie.

 Obiectivele acestui proiect au fost:

1. Evaluarea genotipurilor/variantelor de virusuri circulante la noi în ţarǎ şi caracterizarea lor molecularǎ (mutaţii, recombinare, ORF decalat)

2. Identificarea cǎilor de transmitere a virusului şi a focarelor de infecţie

3. Evaluarea impactului variabilitǎţi tulpinilor HCV circulante în România asupra diagnosticului (prin teste serologice, kituri de genotipare versus secvenţiere) 

4. Dezvoltarea unor metode care permit identificarea şi caracterizarea unor noi subtipuri/variante HCV şi a tulpinilor recombinante cu risc patogen crescut

5. Aplicarea rezultatelor cercetǎrii în unitǎţile medicale în vederea reducerii numǎrului de infecţii cu virusul hepatitei C

 PLAN DE REALIZARE

 Etapa I. Evaluarea genotipurilor circulante in Romania (Co, P1, P2, P3, P4)

 Termen de realizare a etapei: 01.12.06        

Rezultate :

1. Constituirea unui lot de seruri bine caracterizate

2. Elucidarea cazurilor ce produc rezultate indeterminate in diagnosticul serologic al infectiilor cu HCV

Documente de monitorizare : Chestionar cu date demografice si clinico-epidemiologice;

Raportul reuniunii cu toti partenerii; Raport de experimentare; Raport general de etapa.

Activităţi :

1. Colectare seruri (P2, P4, Co)

-  definirea criteriilor de selectie a serurilor si realizarea unui chestionar cu date demografice si clinico-epidemiologice (P2, P4, Co)

-  realizarea bancii de seruri – 600 seruri  (P2, P4 )

-  realizarea unei banci centralizate de seruri care vor fi analizate si prin biologie moleculara (Co)

2. Testarea serologica a probelor (P1, P2, P3, P4, Co )

- stabilirea algoritmului de diagnostic virusologic pentru prezenta markerilor serologici ai infectiei cu virusuri hepatitice cu transmitere parenterala- teste de triaj si confirmare (P1, P2, P4)

-  testarea anticorpilor anti HBc, anti HBs (P1, P2, P4)

- detectia anticorpilor anti HCV prin tehnici imunoenzimatice ELISA (P1, P2, P3, P4, Co)

3.Testarea moleculara a probelor  (P1, P2,P3)

- evaluarea cantitativa a ARN HCV plasmatic si determinarea valorii predictive a profilului testelor de confirmare de tip Western Blot pt. Prezenta replicarii virale active (P1, P2, P3)

Etapa II. Investigarea variabilitatii genetice a genotipurilor circulante in Romania (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 30.06.07

Rezultate:

1. Ameliorarea sensibilitatii reactiei PCR in vederea diagnosticului in faza de preconversie serologica

2. Evaluarea markerilor moleculari home-made pt. evaluarea variabilităţii tulpinilor din Romania

 Activităţi:

1. Testarea serologica a probelor – conform etapei I.1  (Co, P1, P2, P3, P4)

2. Analiza moleculara a tulpinilor de HCV (Co, P1, P2, P3)

- evaluarea cantitativa a ARN HCV plasmatic (P1, P2, P3)

- optimizarea reactiei PCR in regiunile Core si NS5B si evaluarea sensibilitatii reactiilor PCR pt. detectarea infectiilor in faza de preconversie imunologica (Co)

- genotipare prin RFLP in 5’UTR si secventiere: core si NS5B (sisteme home-made)  (Co)

- genotipare cu kituri comerciale (P1) şi comparare cu genotiparea prin secvenţiere (P1, Co)

- analiza informatica a probelor secventiate: mutatii, recombinare, ORF decalat (Co)

- analiza moleculara a regiunilor genomice responsabile pentru rezultate indeterminate in diagnosticul serologic (design primeri, dezvoltarea si optimizarea reactiei PCR) (Co)

3. Epidemiologie moleculara (Co, P3)

- analiza filogenetica a secventelor obtinute pentru determinarea filiatiei cu tulpini din alte zone geografice si compararea datelor genetice cu datele clinice (Co)

- identificarea unor focare de infectie  si a cailor de transmitere (Co, P3, P4)

 Etapa III:  Analiza moleculara extinsa a regiunilor genomice core/core+1 in vederea dezvoltarii unui nou sistem de diagnostic serologic si a ameliorarii diagnosticului prin PCR  (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 1.12.07

Rezultate :

1. evaluarea prezentei proteinei core+1 la tulpinile din Romania, precum si la alte genotipuri/subtipuri decat 1a prin analiză informatică a secvenţelor

2. clonarea intregii regiuni genomice core si secventierea unui nr. mare de clone pt. evaluarea variabilitatii genomice a regiunii si a potentialului diagnostic al proteinei codificate in cadru de citire decalat (core+1) 

3. selectarea  unor regiuni din core+1 care sa constituie peptidele pe baza carora se va dezvolta sistemul ELISA

4. coroborarea datelor genomice cu datele clinice

 Activităţi:

1. completarea bancii de seruri – 600 de seruri (P2, P4, Co)

2. analiza moleculara a tulpinilor HCV (Co, P1, P2, P3)

- clonarea regiunii core/core+1 (Co)

- secventierea clonelor si a celorlalte regiuni amplificate prin PCR si analiza informatica a secventelor; evaluarea prezenţei core+1 la tulpinile HCV din România; analiza mutaţiilor şi  recombinării (Co)

- realizarea secventei consens pentru regiunea core/core+1, in vederea stabilirii peptidelor pentru detectia anticorpilor anti core+1 in sistem ELISA (Co)

3. epidemiologie moleculara (P1, Co)

- analiza filogenetica a secventelor obtinute in vederea stabilirii circulatiei in Romania a diferitelor genotipuri si variante virale si a surselor de infectie (P1, Co)

 Etapa IV: Analiza sistemului de diagnostic dezvoltat in regiunea core+1 (ELISA) si a sistemului de detectie in faza de preconversie prin PCR; estimarea unor sisteme terapeutice bazate pe core+1 (Co, P1, P2, P3, P4)

Termen de realizare a etapei: 28.06.08

 Rezultate :

1. dezvoltarea unui sistem multicentric de testare a probelor in cadrul consortiului pentru evaluarea, standardizarea si testarea unui sistem de diagnostic home-made a anticorpilor anti core+1;

2. compararea rezultatelor cu sisteme comerciale de dgs. serologic si cu rezultate prin secventierea acelorasi tulpini;

Activităţi:

 1. dezvoltarea şi testare ELISA pentru core+1 cu seruri pozitive şi negative; determinarea sensibilităţii şi specificităţii  ELISA (Co, P1, P2, P3, P4)

- standardizarea si evaluarea reproductibilitatii noului sistem ELISA: comandarea peptidelor selectate din genotipul HCV1, fixarea pe plăci ELISA, identificarea concentraţiei optime a reactivilor  (P1, P2, P3, P4, Co)

2. compararea rezultatelor privind prezenta anticorpilor anti core+1 cu rezultatele serologice si moleculare obtinute pt. aceleasi probe (P1, P2, P3, P4, Co)

 Etapa V: Analiza sistemului de diagnostic dezvoltat si validarea rezultatelor prin comparatie cu testele standard de diagnostic; studii clinice (Co,P1, P2,P3, P4)

 Termen de realizare a etapei: 28.11.08

  Rezultate :

1. evaluarea sistemului de diagnostic precoce prin PCR şi a prezentei unor mutatii specifice pt. rezistenta la tratament sau pt. o anumita patologie, precum si a tulpinilor potential recombinante

2. compararea datelor de epidemiologie moleculara privind circulatia genotipurilor si a variantelor virale in Romania; stabilirea frecventelor de infectie si a cailor de transmitere.

Activităţi:

 1. evaluarea sistemelor moleculare dezvoltate pentru identificarea si caracterizarea unor noi subtipuri/variante HCV circulante (Co, P1, P3)

2. estimarea unor sisteme terapeutice bazate pe core+1; ex. ARN antisens, ARNi (Co, P1, P2, P3, P4)

3. definitivarea algoritmului de diagnostic (Co, P1, P2, P3, P4)

4. transfer tehnologic si de informatie  (Co, P1, P2, P3, P4)

    – stagiu de pregatire in institutia Co pentru insusirea metodologiei secventierii si analizei informatice a secventelor (P3)

    – realizarea unui workshop de tehnici moleculare in diagnosticul si monitorizarea infectiilor cu HCV (P3)

    – realizarea de materiale de popularizare despre riscurile si căile de transmitere a HCV (Co, P1, P2, P3, P4)

 REZULTATE

 In prima faza a proiectului s-au elaborat, cu concursul intregului consortiu, chestionarul asupra factorilor de risc asociati infectiei VHC si algoritmul de testare virusologica a probelor pentru selectia pacientilor. Detectia unei valori a raportului DO/CO mai mare de 3, obţinut la testul imunoenzimatic oferă informaţii valoroase in identificarea pacienţilor infecţioşi. Institutul de Virusologie (P1)  constată că o mai bună corelare a RT PCR şi WB a fost observată la pacienţii cu reactivitate mare în EIA (DO/CO > 3), cele două teste dând rezultate similare între ele la 90.2% dintre pacienti. Prin aplicarea chestionarului unor loturi reprezentative de pacienti de către P3 (UMF) s-au stabilit principalii factori de risc implicati in infectia VHC, contribuind astfel la constituirea unui lot bine standardizat de pacienti, la care partenerii au evaluat implicatia rezultatelor indeterminate in diagnosticul serologic al infectiilor cu HCV şi valoarea predictiva a testelor de confirmare pentru prezenta replicarii virale active. Spitalul V. Babeş (P2) a luat în studiu pacienţi cu urmatoarele date personale, clinice, epidemiologice: nr. stoc ser (pacienţi anonimi), data recoltării serului, regiune geografică, sex, vîrstă, mediu urban sau rural, antecedente personale fiziologice (naşteri, avorturi), antecedente personale patologice, puncţie hepatică, încărcare virala (IU-ml) înainte şi după tratament, stadiul bolii, coinfecţii cu alte virusuri, date epidemiologice (factori de risc), tratament. ISP Timişoara (P4) a trimis 100 seruri pozitive, pozitive cu dubla infectie sau cu rezultate indeterminate precum şi seruri negative (negative pentru orice fel de agent infecţios) pentru constituirea lotului martor. La unii pacienţi riscul de infecţie cu VHC se leagă de transfuzii sau tratamente chirurgicale dar şi de utilizare de droguri. In urma studiului molecular realizat în Institutul Cantacuzino a rezultat că subtipul HCV predominant este 1b. Pe lîngă acesta au mai fost identificate şi alte subtipuri cum este 1a, întîlnit mai ales la utilizatorii de droguri, 2a (în Republica Moldova) dar şi un subtip cunoscut ca fiind endemic în Egipt – 4a.           

 In etapa II, INCDMI Cantacuzino (Co) a proiectat doua sisteme de RT-PCR in regiunile core si NS5B si le-a optimizat. A realizat un screening pe serurile din colectia consortiului prin analiza moleculara in regiunea 5’UTR. Probele cu un profil RFLP care indica un alt genotip sau cu profiluri atipice au fost incluse in analiza moleculara prin cele doua sisteme de RT-PCR home-made (regiunea core si regiunea genomica a polimerazei virale – NS5B). Secventele obtinute au fost analizate cu diferite programe informatice pentru identificarea genotipului, a subtipului sau a variantelor virale. Prin aceleasi metode au fost comparate tulpinile de HCV izolate in Romania cu cele din alte regiuni geografice (secvente din bancile de date Los Alamos, EMBL). Secventele obtinute in regiunea core au fost introduse in banca de date EMBL/GenBank  cu numereIe de acces (AM114084 – AM114101 si AM422808 – AM422831). Institutul de Virusologie  „St S Nicolau” (P1) a evaluat retrospectiv seruri provenite de la pacienti HIV pozitivi, de la care existau date clinice, biochimice (transaminazele, bilirubina, albumina); imunologice (numarul de celule CD4 pozitive) si virusologice (markeri ai replicarii HIV).  Serurile au fost testate  pentru prezenţa markerilor moleculari de detectie a infectiei (COBAS Amplicor, Roche Diagnostics). Probele cu incarcare virala detectabila au fost supuse apoi genotiparii cu un kit comercial – Versant HCV Genotyping, Innogenetics. In Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale Dr. Victor Babes (P2) au fost investigate clinic, histologic si biologic 75 de cazuri cu istoric de infectie cu HCV (serologie de screening pozitiva confirmata prin RIBA). Serurile acestor cazuri au fost testate pentru prezenta ARN-HCV si au fost stocate in vederea constituirii colectiei pentru efectuarea studiilor serologice si de secventiere. A fost constituita o baza de date cu informatii epidemiologice si clinice de la cazurile selectate. UMF (P3) constata ca in lotul studiat pacienţii VHC pozitivi au în antecedente mai frecvent tratamente injectabile multiple, (61,54%), tratamente stomatologice invazive (74,35%) şi transfuzii de sânge (30,76%). Am observat si faptul că majoritatea pacienţilor infectaţi (85,6%) prezintă factori de risc intricaţi, cei mai mulţi asociind chiar trei sau patru factori, ceea ce indică faptul că în România numărul manevrelor parenterale înainte de anul 1989 era extrem de crescut. ISP Timişoara (P4)  a evaluat din punct de vedere serologic markerii pt infectia cu HBV (AgHBs, IgM-HBc, AcHBs), markeri pentru infectia cu HCV (AcHCV) si markeri pt infectia cu HIV (AcHIV).

In etapa III, INCDMI Cantacuzino (Co) a testat secventele din regiunea core (sistem in-house) pentru prezenta proteinei in ORF decalat core+1. A realizat clonarea integrala a genei codificatoare pentru capsida HCV – core din gentipul 4a, izolat in Romania, utilizand primeri situati in zonele adiacente core (5’UTR si E1) si sistemul de clonare TOPO TA Cloning. Au fost secventiate 12 clone (colonii albe) care contineau plasmidul vector pCR®II-TOPO®, cu insertul core, Atit secventele core scurte (de 300 pb) cit si secventele core integral au fost aliniate cu programul clustal W si analizate pentru evaluarea variabilitatii si a prezentei core+1 cu programul BioEdit. Atit secventele obtinute in zona RT-PCR in-house cit si core integral contin si proteina core in ORF decalat. Aceasta prezinta o variabilitate mult mai mare decit proteina codificata in cadru de citire normal. Clonele core sunt foarte asemanatoare intre ele dar nu identice, reflectind prezenta cvasispeciilor la acelasi pacient. Intre subtipurile genotipului 4, izolate in diferite zone geografice, exista diferente importante. De asemenea, secventele clonelor 4° sunt mai scurte (121 aa) decit ale altor subtipuri (4b, 4z si 4r). Din studiul filogenetic realizat de noi in doua zone genomice (regiunea capsidei si a polimerazei virale – NS5B) rezulta ca variantele virale din cadrul genotipurilor circulante la noi (1b, 1a, 3a si 4a) nu formeaza grupuri separate ci se grupeaza cu tulpini de referinta omologe sau se intercaleaza cu tulpini circulante din alte zona geografice.

Au fost selectate zece peptide care reprezinta epitopi imunodominanti pentru interactia virusului cu limfocitele T pentru a fi utilizate in sistem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core+1. Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale Dr. Victor Babes (P2) a investigat in un număr de 325 pacienţi infectaţi cu HCV sau expusi la HCV. Dintre aceştia, un total de 67 au fost recrutaţi in prezentul studiu, fiind completate chestionare si stocate eşantioane de ser in vederea investigării moleculare. In SVB s-a creat o baza de date si o colecţie de seruri, dintre care doar unele investigate complet din punct de vedere molecular (încărcătură virală HCV si subtip HCV).

In etapa IV in INCDMI Cantacuzino (Co) au fost selectate zece peptide care reprezinta epitopi imunodominanti pentru interactia virusului cu limfocitele T, pentru a fi utilizate in sistem ELISA pentru detectia anticorpilor anti-core (peptid 10) si anti-core+1 specifice pentru genotipurile circulante in Romania (peptidele 1-9). Sistemul ELISA a fost optimizat prin modificarea unor parametrii (cantitatea de peptid utilizata pentru peliculizarea pe placi, marca de placa, dilutiile optime de conjugat si serul de testat, tipul de blocant pentru situsurile nespecifice, timpul de stopare a reactiei, numarul de spalari, etc.). Serurile a doi pacienti (4843 – genotip 1b si 3162 – genotip 1a) au prezentat reactivitate incrucisata fata de 3 nonapeptide core+1 (peptid 4 – 1a; peptid 5 -1a; peptid 7 – 1b/4a). Probele pozitive pentru anticorpii core+1 au prezentat incarcaturi virale de 153.000 (Amplicor) (4843, genotip 1b,), respectiv 293 000 (3162, genotip 1a). Studiile cu noul sistem ELISA confirma prezenta anticorpilor core+1 in serul unor pacienti HCV pozitivi din Romania. Si Institutul de Virusologie „St S Nicolau” (P1) a participat la dezvoltarea şi testarea sistemului ELISA pentru core+1 cu seruri pozitive şi negative. Cele doua echipe au folosit aceleasi peptide dar reactivii ELISA au fost din surse diferite. Sistemul ELISA a fost optimizat prin modificarea unor parametrii (cantitatea de peptid utilizata pentru peliculizarea pe placi, marca de placa, dilutiile optime de conjugat si serul de testat, tipul de blocant pentru situsurile nespecifice, timpul de stopare a reactiei, numarul de spalari, etc.). Rezultatele indica prezenta anticorpilor core+1 in seruri HCV+. De asemenea, serurile net pozitive anti-core+1 prezinta reactivitate fata de toate peptidele testate.  Rezultatele obtinute indica prezenta anticorpilor anti-core+1 la pacientii HCV din Romania si permit validarea acestui sistem de diagnostic nou dezvoltat.

Etapa V. Sistemele de analizã şi genotipare dezvoltate în cadrul acestui proiect de INCDMI Cantacuzino (Co)  s-au dovedit a fi suficient de sensibile pentru identificarea corectã a genotipurilor, a subtipurilor şi a variantelor virale. Rezultatele discordante intre sistemul de genotipare prin RFLP in 5’NCR si secventierea in core, NS5B si HVR1 au condus la concluzia ca exista virusuri cu genom recombinat al caror potential virulent necesita investigatii suplimentare. Este una dintre putinele inregistrari privind recombinarea la HCV, cu posibil impact in evolutia bolii. Genotipul 1b este majoritar dar se constata o diversificare prin aparitia in circulatie a unor noi genotipuri (1a, 3a – legate de utilizarea drogurilor intravenoase si 4a, recunoscut ca fiind endemic in Egipt). Distanta genetică foarte mica între tulpinile româneşti 1a este un indicator al introducerii recente a acestui subtip în România şi circulaţia în populaţia de tineri care utilizează droguri injectabile. Sistemul de genotipare in 5’NCR, prin RFLP sau secventiere este mai putin rezolutiv pentru subtipare. Pentru acest lucru ca si pentru trasarea infectiilor este necesara secventirea unei regiuni cu variabilitate crescuta (ex. HVR1 sau NS5B). Analiza secventelor obtinute in core si NS5B a permis evidentierea unor markeri de rezistenta la tratament. Secventierea unor probe in regiunea hipervariabila 1 (HVR1) a identificat modificari de structura prin deletii sau insertii. Se poate specula ideea unei corelatii intre structura HVR si raspunsul la tratament deoarece tulpini fara modificari in HVR erau prezente numai la pacientii care au eliminat virusul (evaluare la 6 luni de la terminarea tratamentului). In Institutul de Virusologie „St S Nicolau” (P1) s-au realizat in paralel standardizarea si evaluarea reproductibilitatii unui protocol dotblot pentru peptidele VHC, cu peliculizarea peptidelor selectate din genotipul HCV1, fixarea pe membrana de nitroceluloza, identificarea reactivilor necesari si a concentratiei optime de utilizat in reactie. Se poate concluziona in aceasta etapa ca peptidul 10 / core reactioneaza bine cu anticorpii anticore totali din serul pacientilor infectati VHC, indiferent de genotipul implicat, peptidul 5/1a –  reactioneaza cu anticorpii anticore+1  din serul pacientilor infectati cu genotipul 1a VHC, iar peptidul 7 1b/4a reactioneaza cu anticorpii anticore+1 din serul pacientilor infectati cu genotipul 1b sau 4a. Tot in aceasta etapa in Institutul de Virusologie “St S Nicolau” s-au realizat standardizarea si evaluarea reproductibilitatii unui protocol ELISA de blocare pentru peptidele VHC, cu peliculizarea peptidelor selectate din genotipul HCV1 urmata de detectia spectrofotometrica a rezultatului blocarii. Distributia factorilor de risc pe genotipuri indica o prevalenta mare a manevrelor parenterale de tipul interventii chirurgicale, injectii,  manevre stomatologice şi transfuzii de sange la pacientii cu genotip 1b, spre deosebire de cei infectati cu genotipul 1a care in studiul nostru prezinta antecedente de administrare de droguri injectabile, tatuaj si piercing.

Comunicari stiintifice:

1. Echipa IVN. TESTS AND DIAGNOSIS DISCUSSION FOR CHRONIC HEPATITIS C – 2nd Conference of the Romanian Association of Medical Laboratories with International Participation Timisoara, 2006

2. A. Oprisoreanu, C. Szmal, V. Thiers, G. Oprisan. Comparative analysis of three different regions of hepatitis C virus for genotyping Romanian strains. 17th ECCMID / 25th ICC, Munchen, 31 martie-3 aprilie 2007. Poster

3. Simona Ruta. Actualitati in diagnosticul si monitorizarea infectiei cu VHC. UMF Carol Davila; Institutul de Virusologie “St. S. Nicolau” A XI-a Reuniune Anuală de Microbiologie, Mamaia, 24-26 mai 2007, pg.15

4. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Incarcarea virala, marker de prognostic in evolutia postterapeutica a infectiei VHC. Al III-lea Simpozion “Acad. Nicolae Cajal”, Bucuresti, 28-29 martie 2007, pg.56-57.

5. Oprisan Gabriela, Szmal Camelia, Oprisoreanu Ana-Maria, Dinu Sorin.  „Genotiparea virusului hepatitei C prin PCR-RFLP in 5’NCR si importanta pentru terapie” - Al 6-lea Congres National de Medicina de Laborator, Sibiu, 11 – 13 oct. 2007 – prezentare orala

6. Oprisan G, Oprisoreanu AM., Szmal C. “EVALUATION OF MOLECULAR TOOLS IN HEPATITIS C VIRUS EPIDEMIOLOGY ”, al V-lea Congres al Societatii Balkanice de Microbiologie, Budva, Muntenegru, 24-27.10.2007 – prezentare orala

7. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Paul Marinescu, Simona Ruta. Monitorizarea virusologica in cursul tratamentului hepatitei cronice C.  Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, D9, pg 100.

8. Loredana Manolescu, Camelia Sultana, Paul Marinescu, Simona Ruta. Evaluarea utilitatii clinice a metodelor de diagnostic in infectia VHC. Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, D8, pg 99.

9. Simona Ruta, Camelia Sultana, Loredana Manolescu,  Costin Cernescu. Impactul reconstructiei imune asupra evolutiei pacientilor coinfectati HIV-virusuri hepatitice. Zilele Institutului „Prof. dr. Matei Bals” ACTIUNE SI REACTIUNE IN BOLI INFECŢIOASE”, Bucuresti, 8-10 noiembrie 2007, B10, pg 90.

10. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, S. Ruta. Studii preliminare asupra genotipurilor VHC circulante in Romania. Simpozion “In memoriam Acad. Stefan S Nicolau”, Bucuresti, 5 noiembrie 2007, pg.2.

11. ISP Timisoara. Conferinţa Naţională de Sănătate Publică „Oportunităţi şi provocări în sănătatea publică, în contextul integrării României în UE”- Volum, 16-18 Noiembrie 2007, Timisoara

12. Gabriela Oprisan, Camelia Szmal, Sorin Dinu. “Sisteme de PCR in-house utilizabile pentru tipizarea tulpinilor de HCV”. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicolae Cajal”, 26-28 martie 2008, Bucuresti. Comunicare orala.

13. Sorin Dinu, Camelia Szmal, Claudiu Sbarcea, Emilia Lupulescu, Gabriela Oprisan. Evaluarea comparativa a trei tehnici  moleculare pentru analiza virusului hepatitei C. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicolae Cajal”, 26-28 martie 2008, Bucuresti. Poster.

14. G. Oprisan, C. Szmal, S. Dinu, A. Oprisoreanu, V. Thiers.  Molecular epidemiology of hepatitis C virus in Romania. Congresul European de Microbiologie Clinica ECCMID, 19-23 aprilie 2008, Barcelona, Spania. Poster.

15. Gabriela Oprişan, Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicatii în dezvoltarea unor sisteme de diagnostic.  Simpozionul National Viasan-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008. Comunicare orala.

16. Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu, Gabriela Oprişan si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Sisteme home-made pentru identificarea si caracterizarea moleculara a virusului hepatitei C. Simpozionul National Viasan-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008. Poster

17. S. Ruta, C. Sultana, L. Manolescu , G. Tardei, A. Motoc, D. Brehar- Cioflec, C. Szmal, S. Dinu, A.M. Oprisoreanu, G. Oprisan. The Changing Profile of Circulating HCV Genotypes in Romania. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008, 3189.

18. C. Sultana, L. Manolescu, S. Ruta, Evaluation of Early Predictors of Successful Therapy in HCV Infected Patients from Romania. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008,  4712

19. MLC Panait, Oprisoreanu AM, Szmal C, Negrea R, Codita I, Oprisan GR. Phylogenetic Analysis of a Hepatitis C Virus Nosocomial Outbreak. 13th International Congress on Infectious Diseases, Kuala Lumpur, Malaysia June 19 – 22, 2008, .

20. C. Sultana; L.Manolescu; S. Ruta. Genetic diversity of hepatitis C virus: diagnostic implications. Al 7 lea Congres de Medicina de Laborator cu participare internationala, Bucharest; Romania 20-22 octombrie 2008.

21. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Strategii de optimizarea a raspunsului virusologic la tratament in hepatita  cronica C. A XII-a Conferinta de Nationala de Microbiologie cu participare internationala, 30 oct-2 nov 2008, Sibiu, Romania

Publicatii:

1. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruţă – S-AU MODIFICAT FACTORII DE RISC AI INFECŢIEI CU VIRUS HEPATITIC C ÎN ROMÂNIA? – Studii si cercetari de virusologie,  36/ 2006

2. Camelia Sultana, Loredana Manolescu, Simona Ruta. Corelatie intre aspectele histo-patologice si markeri biochimici utilizati pentru monitorizarea infectiei VHC sub tratament. – Studii si cercetari de virusologie, 37 (1), 2007

3. Brosura cu titlul: “Investigarea unor mecanisme moleculare din genomul HCV cu implicatii in dezvoltarea unor sisteme de diagnostic si terapeutice”

Gabriela Oprişan, Camelia Szmal, Sorin Dinu, Ana-Maria Oprişoreanu, Mircea Liviu Cătălin Panait (INCDMI Cantacuzino) si consortiul proiectului CEEX  158/2006. Editura Universitara „Carol Davila”, ISBN nr. 978-973-708-350-0

 

Proiect CEEX 86 / 2006Cercetarea multidisciplinara a circulatiei si emergentei virusurilor zoonotice, agenti ai gripei aviare, ai unor febre hemoragice si ai unor infectii neuroinvazive; un concept inovator privind supravegherea la nivelul unor interfete multiple: sanatate umana/sanatate animala/fauna salbatica/ mediu

Acronim : EVIRNET

Parteneri in consortiu:

CO: Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie „Cantacuzino”

Director Proiect: Dr. Biol. Cornelia Ceianu, CSI, Laboratorul Infectii Transmise prin Vectori

P1: Institutul de Diagnostic şi  Sănătate Animală

Responsabil proiect: Dr. Vet. Ionescu Aurelia

P2: Muzeul Naţional de Istorie Naturală „Grigore Antipa”

Responsabil proiect: Dr. Dumitru Murariu

P3: Institutul de Cercetări şi Amenajări Silvice

Responsabil proiect: Dr. Ing. Ionescu Ovidiu

Scurta prezentare a obiectivelor si a stadiului de desfasurare a proiectului:

Zoonozele virale emergente reprezinta o serioasa amenintare la nivel regional si global, cu impact important  asupra sanatatii umane si economiei din zonele afectate. Situatia aparuta in anul 2005 in urma introducerii gripei aviare in Europa si in tara noastra este exemplul cel mai recent si cel mai relevant. In ultimul deceniu, la nivel global, pe langa virusurile gripale aviare, au fost implicate in episoade epidemice majore si alte virusuri zoonotice emergente (virusul SARS, virusul West Nile,  virusul Nipah etc). Pentru controlul si preventia zoonozelor emergente este necesar un raspuns coordonat al sectoarelor de sanatate publica si animala. EVIRNET este un proiect complex de cercetare integrata a circulatiei si emergentei virusurilor zoonotice ce isi propune sa aduca in consortiu profesionisti din domenii complementare (virologie, medicina umana si veterinara, biologie moleculara, zoologie, managementul faunei salbatice, ecologie) din 4 institutii de nivel national. In cadrul EVIRNET („Emerging VIRuses NETwork”) se desfasoara activitati de cercetare a epidemiologiei unor agenti zoonotici virali in 3 subproiecte verticale: 1. Virusuri gripale animale (inclusiv virusul gripal aviar H5N1); 2. Virusuri ce produc febre hemoragice (hantavirusuri); 3. Virusuri ce produc infectii neuroinvazive (virusul West Nile, virusul encefalitei de capuse, virusul rabiei).

Toate aceste virusuri sunt virusuri ARN, agentii infectiosi cu cea mai rapida capacitate de evolutie, pentru ca ARN-polimeraza lor nu poseda mecanisme de corectare a secventei in cazul incorporarii gresite a nucleotidelor. Aceasta genereaza o populatie de virus diversa, din care oricand se pot selecta variante ce se adapteaza la conditii noi si/sau evita mecanismele de aparare ale gazdei. Aceasta proprietate a ARN-polimerazei face ca virusurile ARN sa reprezinte patogenii cei mai periculosi. Intelegerea evolutiei si a naturii emergentei virusurilor ARN in populatii umane, de animale domestice si de animale salbatice poate ajuta la gasirea unor metode de control a circulatiei acestor virusuri.

Obiectivul proiectului a fost crearea, implementarea si validarea unui model de monitorizare interdisciplinara integrata a zoonozelor virale, cu capacitatea de a detecta fenomenul de emergenta a unor noi virusuri zoonotice si tendintele de evolutie in epidemiologia unor virusuri endemice, cu scopul de a fundamenta stiintific programe eficiente de preventie si control. Pentru indeplinirea acestui obiectiv, pe parcursul celor 5 faze ale proiectului, patru echipe formate din microbiologi cu experienta in domeniul sanatatii publice, entomologi, medici veterinari si zoologi, au desfasurat activitatile prevazute in planul de realizare.

Astfel am implementat o metodologie armonizata si moderna pentru laborator, teren si analiza datelor, un sistem integrat de management a informatiei  si a bazelor de date si un model de monitorizare multidisciplinara a virusurilor zoonotice care a fost validat in urma evaluarii urmatorilor indicatori: acuratetea si calitatea datelor colectate; sensibilitatea si capacitatea de a detecta tendinte si evenimente neobisnuite (emergenta, epidemie) in timp util, capacitatea de a produce date stiintifice fundamentale valoroase pentru cunoasterea virusurilor zoonotice si a eco-epidemiologiei lor; costuri substantial reduse prin utilizarea integrata a probelor si datelor; relevanta datelor obtinute pentru imbunatatirea pregatirii, planificarii si a capacitatii de raspuns in situatii epidemice, precum si pentru monitorizarea si evaluarea parametrilor de interventie. Pe baza rezultatelor obtinute am elaborat o metodologie integrata pentru supravegherea virusurilor zoonotice: virusul gripal aviar H5N1, virusuri care au ca rezervor rozatoare (hantavirusuri), virusuri transmise prin vectori (virusul West Nile, virusul encefalitei de capusa, virusul febrei hemoragice Crimeea-Congo).

Modelul de supraveghere multidisciplinara a virusurilor, validat prin functionarea sa in timp real, a demonstrat capacitatea de a depista circulatia unor virusuri care nu fusesera semnalate pe teritoriul tarii noastre (hantavirusul Dobrava, virusul febrei hemoragice Crimeea-Congo, virusul choriomeningitei limfocitare) si de a detecta modificari/ tendinte in epidemiologia unor arbovirusuri endemice in Romania (virusul West Nile, virusul encefalitei de capusa).

Metodologiile de supraveghere multidisciplinara in sistem integrat elaborate pe baza rezultatelor proiectului vor imbunatati preventia si controlul bolilor zoonotice virale si vor avea impact atat in domeniul sanatatii publice pentru preventia si controlul transmiterii la om a virusurilor zoonotice (virusul West Nile, hantavirusuri, virusul Crimeea-Congo, virusul encefalitei de capusa, virusul gripal aviar), cat si in domeniul sanitar-veterinar in protejarea sanatatii animalelor de interes economic (virusul West Nile, virus gripal aviar). Implementarea acestei metodologii de supraveghere si a masurilor de interventie adecvate va avea impact benefic si asupra faunei salbatice, in special a pasarilor afectate de virusuri (West Nile, virus gripal aviar), contribuind astfel la conservarea biodiversitatii.

Aceste rezultate au fost diseminate prin 2 lucrari publicate si 17 comunicari stiintifice la manifestari stiintifice nationale si internationale.

Rezultatele proiectului vor fi utilizate in domeniul sanatatii publice, cat si in domeniul  sanitar veterinar pentru supravegherea integrata, prevenirea si controlul zoonozelor virale. Impactul economic va putea fi estimat prin reducerea pierderilor si cheltuielilor pe care le provoaca zoonozele virale. Metodologia de supraveghere multidisciplinara elaborata este utilizabila in domeniul sanatatii publice pentru preventia si controlul transmiterii la om a virusurilor zoonotice (virusul West Nile, virusul Dobrava, virusul Crimeea-Congo, virusul encefalitei de capusa, virusul gripal aviar) si in domeniul veterinar in supravegherea sanatatii animale (virusul West Nile, virusul gripal aviar).Rezultatele proiectului valideaza modelul de supraveghere a virusurilor zoonotice la nivelul unor interfete multiple: sanatate publica/sanatate animala/fauna salbatica/mediu. Confirmarea, pentru prima data, a circulatiei virusurilor producatoare de febre hemoragice (Dobrava, Crimeea-Congo) pe teritoriul tarii noastre demonstreaza soliditatea obiectivelor propuse prin acest proiect. Modelul integrat de supraveghere propus de noi a detectat,de asemenea, tendinte noi in eco-epidemiologia unor virusuri endemice in tara noastra. Ca atare, o data aplicat operational, a demonstrat o buna eficacitate. Rezultatele obtinute sunt o baza solida pentru demararea unor noi cercetari privind virusurile nou semnalate pe teritoriul tarii, iar echipa multidisciplinara care s-a format si s-a sudat in cursul prezentului proiect reprezinta o garantie pentru obtinerea unor rezultate valoroase in viitorul proiect in parteneriat privind studiul eco-epidemiologiei agentilor cu transmitere prin vectori.

Proiect CEEX 80/2006 

DIRECTOR DE PROIECT:

Dr. Daniel CIOCA 

UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE VICTOR BABES TIMISOARA

partener:

RESPONSABIL PARTENER

P2

Dr. Crina STAVARU

Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie ‚Cantacuzino’

TITLU:

STRATEGII NOVATOARE DE MODULARE A RĂSPUNSULUI IMUN LA PERSOANELE DE VÂRSTA A TREIA: IMPACTUL TELOMERAZEI ŞI AL APOPTOZEI ASUPRA PROCESULUI DE IMUNOSENESCENŢĂ A LIMFOCITULUI T – SENTAP

Aria tematică S/T cf Anexa 1: 1.1.1. Cercetare completă.

SCOP:

Tematica propunerii noastre este orientata spre fundamentarea unor terapii inovative cu aplicare potenţială în tratarea unor afecţiuni imune specifice vârstei a treia. Prezentul proiect îşi propune să exploreze impactul activităţii telomerazei, enzima-cheie care controlează lungimea telomerelor (structurile specializate situate la capătul cromozomilor), precum şi a procesului morţii celulare programate (apoptoza) asupra senescenţei limfocitului T.

CEEX 6/2005 – PARTENERIAT

DIRECTOR DE PROIECT:

Dr. Cornel URSACIUC

Institutul National de Cercetare-Dezvoltare In Domeniul Patologiei Si Stiintelor Biomedicale “Victor Babes”

partener:

RESPONSABIL PARTENER

P1

CSI Conf. Univ. Dr. Dorel Lucian RADU

Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie ‚Cantacuzino’

TITLU:

DETERMINARI sanguine imunologice si genotoxice IN VEDEREA STABILIRII VALORILOR STATISTIC NORMALE la populatia adulta din Romania

Aria tematică S/T cf Anexa 1: 1.1.1. Cercetare completă. Urmărind stimularea progresului experimental în cercetarea biomedicală, prin imbunătăţirea generării, standardizării, achiziţiei şi analizei datelor

SCOP:

Stabilirea valorilor de referinţă al unor parametri sanguini, imunologici şi genotoxici

Crearea premizelor pentrui constituirea unui registru naţional al valorilor de referinţă care va servi ca un îndreptar de interpretare diagnostică pentru clinicieni cu diverse specialitaţi dar şi pentru ce-i care îşi desfăţoară activitatea în centre de învăţământ sau cercetare.

Importanţa naţională a tematicii ofertate e susţinută de:

Posibilitatea evaluării statusului imun în populaţia clinic sănătoasă de pe teritoriul ţării şi pe grupe de vârstă.

Evaluarea genotoxicităţii la persoane care nu sunt expuse riscului profesional, valorile obţinute putând fi astfel corelate cu datele care servesc la medicina muncii

Rezultatele obţinute vor îmbogăţi baza de date ale instituţiilor acreditate pentru studii privind calitatea vieţii şi a mediului ceea ce justifică impactul economic al unui asemenea studiu.
 

 

Proiect VIASAN CEEX 47/2005

Titlul proiectului: Diagnosticul si managementul sindromului diareic infectios

Director de proiect: Dr. Biol. Maria Damian, CS I

Parteneri:

P1: Universitatea de Medicina si Farmacie „Carol Davila” Bucuresti

Responsabil stiintific: Prof. Dr. Dan Ianulle Steriu

P2: Universitatea din Bucuresti, Institutul de Genetica

Responsabil stiintific: Prof. Dr. Lucian Gavrila

P3: Spitalul Clinic Colentina

Responsabil stiintific: Conf. Michaela Cretu

P4: Spitalul Clinic de Boli Infectioase si Tropicale „Dr. Victor Babes”

Responsabil Stiintific: Dr. Maria Nica

 

Obiectivele proiectului

Boala diareica privita ca entitate infectioasa are multiple etiologii. Studiul prezent si-a propus o abordare complexa a diagnosticului de laborator al acestei patologii umane, tintind bacterii patogene si oportuniste, virusuri si paraziti, atat prin mijloace clasice de analiza microbiologica, cat si prin metode genetice moderne. Cercetarea realizata printr-o stransa colaborare intre parteneri reprezentativi pentru unitati cu activitate academica, unitati de cercetare aplicativa, precum si unitati avand ca principala activitate asistenta de sanatate publica si implementarea rezultatelor ei in practica laboratorului clinic urmaresc cresterea calitatii actului medical si in consecinta a calitatii vietii.

Obiectivele specifice ale proiectului

1. Abordarea complexa a studiului bolii diareice: agenti etiologici bacterieni, virali si parazitari

2. Elaborarea si implementarea in practica a metodelor de biologie moleculara in vederea diagnosti-cului agentilor cu potential patogen;

3. Colaborarea, in consortiu, a specialistilor din Universitati, Institute de Cercetare si Clinici Univer-sitare, implicati in supravegherea si controlul bolilor infectioase;

4. Imbunatatirea diagnosticului de laborator al bolii diareice prin identificarea agentilor etiologici cu incidenta subevaluata la nivel national;

5. Intarirea participarii active in programul “Food and water diseases” care se desfasoara la nivelul Centrului European pentru Prevenirea si Controlul Bolilor Transmisibile (ECDC), ca urmare a armonizarii metodologiilor de lucru la nivel national cu cele existente la nivel european;

6. Imbunatatirea capabilitatilor necesare participarii la proiecte de cercetare in cadrul retelelor internationale de supraveghere a bolilor infectioase;

7. Elaborarea procedurilor operatorii specifice, in conformitate cu cele europene si punerea lor la dispozitia laboratoarelor implicate in diagnosticul si supravegherea de laborator a bolilor infectioase;

8. Prezentarea rezultatelor cercetarii in cadrul workshopurilor organizate de ECDC in cadrul pro-gramului FWD , la manifstari stiintifice interne, precum si publicarea acestora in reviste de specialitate.

Descrierea activităţii

Sindromul diareic acut (SDA) este reprezentat in patologia infectioasa printr-o gama larga de entitati clinice cu particulariati simptomatice si evolutive determinate in primul rand de agentul etiologic bac-terian (Salmonella, Shigella, Yersinia enterocolitica, E.coli patotipurile diareigene, Campylobacter, Vibrio cholerae etc.), parazitar (Giardia, Entamoeba, Criptosporidium etc.) si viral (Rotavirusuri, Enterovirusuri, Norovirusuri etc.).

Sindromul diareic este o entitate clinica ce se caracterizeaza prin scaune frecvente (> 5 / 24 ore), de consistenta redusa (uneori apoasa ) insumand uneori volume mari de pierderi lichidiene (uneori pana la 2o litri / 24 ore) ce pot duce la dezechilibre hidroelectrolitice  insotite de tulburari hemodinamice grave cauzatoare de deces (colaps cardiovascular).

Sindromul febril insoteste adesea sindromul diareic infectios iar fenomenele digestive, inapetenta, greata, dureri abdominale, balonare, flatulenta, sunt prezente in diferite grade de intensitate. Multitudinea agentilor etiologici implicati necesita metodologii diferite aplicate concomitent aceluiasi prelevat. Materiile fecale sunt prelevatul biologic preferat pentru cultivarea patogenilor bacterieni,  parazitari si virali, implicati in etiologia bolii diareice. Ca in toate metodologiile ce se bazeaza pe izolarea si identificarea agentului etiologic, prelevarea produsului patologic, trebuie facuta cat mai aproape de debutul bolii, iar protocolul aplicat trebuie sa fie specific etiologiei tintite. Studiul prezent se refera in special la etiologiile conditionat patogene, cele care necesita conditii speciale de cultivare si in consecinta sunt subevaluate.

Studiile derulate in cadrul proiectului au urmarit:

1. Diagnosticul de laborator de nivel 1 al produselor patologice provenite de la pacienti cu simptomatologie de sindrom diareic infectios

2. Identificarea fenotipica a agentilor infectiosi izolati din produsele patologice prelevate de la pacienti cu simptomatologie de sindrom diareic infectios

3. Diagnostic starii de hipersensibilitate indusa de infectia parazitara (Ig E totale)

4. Diagnostic imagistic al parazitozelor intestinale si tisulare (radiologic, ecografic, CT, RMN)

5. Coroborare cu date clinic- biologice si alergologice

6. Tratament etiologic in sindromul iareic infectios

7. Monitorizare – dispensarizarea pacientilor cu sindrom diareic infectios

8. Identificarea structurilor genetice codante pentru β-lactamaze

9. Identificarea moleculara a agentilor infectiosi izolati din sindromul diareic

10. Tipizarea moleculara a agentilor infectiosi izolati din boala diareica acuta

11. Secventierea genelor bla pentru identificarea tipului de β-lctamaze cu spectru larg de activitate produs de tulpinile de E. coli

12. Realizarea unui algoritm privind diagnosticul si managementul sindromului diareic infectios

Rezultatele stiintifice obtinute in derularea activitatilor, conform planului de realizare, au constituit subiectul unui important numar de lucrari stiintifice publicate si sau comunicate in tara sau in strainatate, iar Maria Damian si Codruta-Romanita Usein au participat la redactarea unui tratat de microbiologie clinica. Ca urmare a faptului ca boala diareica se numara printre bolile prioritare la nivel european, in cadrul ECDC functioneaza un program de supraveghere microbiologica si epidemiologica a toxiinfectiilor alimentare, cauza principala a bolii diareice. Maria Damian este national focal point pentru supravegherea cu laboratorul a infectiilor produse de Salmonella, iar Dorina Tatu-Chitoiu pentru E. coli, Campylobacter si Yersinia. In aceasta calitate participam activ la workshopurile anuale organizate de ECDC pe acest subiect, realizand un dialog permanent cu colegii din alte institutii europene care-si desfasoara activitatea in domeniul tematicii proiectului.

Rezultatele finale ale cercetarii se regasesc intr-o publicatie aflata sub tipar la revista Romanian Archives of Microbiology and Immunology.

Publicatii

1.     Codruta-Romanita Usein, Andi-Marian Palade, Natalia Popovici, Dorina Tatu-Chitoiu, Simona Ciontea, Stefania Ceciu, Maria Damian. Application of Pulsed-Field Gel Electrophoresis to small community outbreaks of Salmonella enterica serovar Typhymurium. Rom. Arch. Microbiol. Immunol., T 64, 1-4, 2005

2.     Ionela Mirela Neagoe, D. Steriu, Mariana Pop, Ioana Cristea, A.C. vasile Bugarin, R.R. Codreanu, Carmen-Michaela Cretu, Lidia Lazar, Suzana Cilievici, Maria Nica, Tatiana Biolan, A. Palade, Codruta-Romanita Usein, Maria Damian. Diagnosticul de laborator in infectiile cu Cryptosporidium sp si Giardia lamblia. Rev. Rom Parazitol. 2007, Xvii, supl., 131.

3.     Usein. C.R., Tatu-Chitoiu D., Palade A.M., Ciontea S., Condei M., Nica M., Damian M. Molecular detection of verotoxin-producing Escherichia coli isolates in stool samples from patients with diarrhea. Rom. Archives Microbiol. Immunol. 67 (1-2), 2008.

4.     Maria Damian, Tatu-Chitoiu Dorina, Usein Codruta-Romanita, Gabriela Oprisan, Palade Andi-Marian, Sorin Dinu, Camelia Szmal, Ciontea Simona Adriana, Ceciu Stefania, Condei Maria, Persu Ana, Baicus Anda, Pop Mariana, Neagoe Ionela, Steriu Dan, Codreanu Radu, Marian Graur, Cretu Michaela Carmen, Suzana Cilievici, Nica Maria, Alexandru Ecovoiu, and Lucian Gavrila. Laboratory Diagnosis of Infectious Diarrhoea Syndrome; a Three Years Study in Two Hospitals of Infectious Diseases. (In press) Rom Arch Microbiol Immunol.

 Comunicari stiintifice la manifestari stiintifice nationale

1.     Maria Damian. Diagnosticul si managementul sindromului diareic infectios. Sesiunea Stiintifica Anuala a INCDMI „Cantacuzino”, 2005, Bucuresti, 13 dec.

2.     Codruta-Romanita Usein, Andi-Marian Palade, Natalia Popovici, Dorina Tatu-Chitoiu, Simona Ciontea. Izolate umane de VTEC nonO157 identificate prin PCR multiplex. Sesiunea Stiintifica Anuala a INCDMI „Cantacuzino”, Bucuresti, 5-6 Dec, 2006

3.     Natalia Popovici, Stefania Ceciu, Andi-Marian Palade, Codruta-Romanita Usein, Maria Cosman. Analiza microbiologica a unui focar de febra tifoida (poster) Sesiunea Stiintifica Anuala a INCDMI „Cantacuzino”, Bucuresti, 5-6 Dec, 2006

4.     Ana-Maria Oprisoreanu, Camelia Szmal, Gabriela Oprisan. Rezultate preliminare privind detectarea prin PCR a norovirusurilor (poster). Sesiunea Stiintifica Anuala a INCDMI „Cantacuzino”, Bucuresti, 5-6 Dec, 2006

5.     Ionela Neagoe, Dan Steriu. Incidenta si diagnosticul de laborator al infectiilor cu Cryptosporidium spp. si Giardia lamblia (poster). A X-a Reuniune Anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Cluj, 21-23 Sept. 2006

6.     Ionela Neagoe, Marian Pop, Dan Steriu. Screening serologic al principalelor parazitoze cu transmitere digestiva (poster) A X-a Reuniune Anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Cluj, 21-23 Sept. 2006

7.     Dorina Tatu-Chitoiu, Adriana-Simona Ciontea, Andrei Popa. Supravegherea rezistentei la antibiotice, in cadrul retelei europene ENTERNET, a tulpinilor de Salmonella izolate din infectii enterice umane in perioada 2005-2006. A X-a Reuniune Anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Cluj, 21-23 Sept. 2006

8.     Maria Damian. Diagnosticul etiologic in sindromul diareic infecłios (referat). Reuniunea anuala a Societatii Romane de Microbiologie Mamaia, 24-26 mai 2007.

9.     Gabriela Oprisan, Ana-Maria Oprisoreanu, Camelia Szmal, Maria Damian. Investigarea moleculară a unor virusuri necultivabile (norovirusuri) responsabile de epidemii de gastroenterite (referat). Reuniunea anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Mamaia 24-26 mai 2007.

10.  Codruta-Romanita Usein, Andi Marian Palade, Natalia Popovici, Dorina Tatu-Chitoiu, Simona Ciontea, Maria Nica, Maria Condei, Maria Damian. Identificarea tulpinilor de Escherichia coli enteropatogen (EPEC) printre izolatele intestinale provenite de la indivizi cu diaree (comunicare). Reuniunea anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Mamaia 24-26 mai 2007.

11.  Andi Marian Palade, Simona Ciontea, Codruţa-Romaniţa Usein, Natalia Popovici, Maria Condei, Dorina Tatu-Chiţoiu, Maria Damian. Detectarea rapidă a tulpinilor de Campylobacter folosind reacţia de polimerizare în lanţ  (poster). Reuniunea anuala a Societatii Romane de Microbiologie, Mamaia 24-26 mai 2007.

12.  Ionela Mirela Neagoe, Dan Steriu, Mariana Pop, Ioana Cristea, Maria Damian. Diagnosticul de laborator in infectiile cu Cryptosporidium sp si Giardia lamblia. Simpozionil National de Cercetare Stiintificã Medicalã de Excelentã, 2007, Sibiu 25 – 26 octombrie.

13.  Maria Damian. Rolul metodelor moleculare in diagnosticul si supravegherea bolilor infectioase. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicolae Cajal”, Bucuresti, 26-28 martie 2008.

14.  Usein Codruta-Romanita, Tatu-Chitoiu Dorina, Ciontea Simona, Palade Andi Marian, Nica Maria, Condei Maria, si Damian Maria. Argumente in favoarea introducerii diagnosticului microbiologic molecular pentru anumite infectii digestive. Al IV-lea Simpozion „Acad. Nicalae Cajal”, Bucuresti, 26-28 martie 2008.

15.  Sorin Dinu, Gabriela Oprisan, Camelia Szmal, Maria Nica, Carmen Michaela Cretu, Ana Persu, Maria Damian. Investigarea moleculara a unor virusuri recent identificate in Romania (norovirusuri) responsabile de gastroenterite. Simpozionul National VIASAN-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008

16.  Andi-Marian Palade, Codruta-Romanita Usein, Dorina Tatu-Chitoiu, Simona Adriana Ciontea, Maria Condei, Maria Nica, Maria Damian. Implicarea patotipului Escherichia coli enteropatogen in boala diareica a copilului. Simpozionul National VIASAN-CEEX, Sinaia, 28-30 sept. 2008

Comunicari stiintifice la manifestari stiintifice internationale

1.     Szmal Camelia, Oprisoreanu Ana-Maria, Damian Maria, Oprisan Gabriela. Preliminary results on circulation of noroviruses in Romania. Microbiologia Balkanica 2007, 24-27 Oct., Budva, Muntenegru.

2.     Codruta-Romanita Usein, Andi-Marian Palade, Simona Ciontea & Maria Damian. Virulence characteristics of Escherichia coli strains belonging to EPEC serogroups izolated from Romanian subjects. Microbiologia Balkanica 2007, 24-27 Oct., Budva, Muntenegru.

3.     Maria Damian. Extended-Spectrum beta-lactamases in enteric bacteria an increased threat for human Health. Microbiologia Balkanica 2007, 24-27 Oct., Budva, Muntenegru.

4.     Usein Codruta-Romanita. Using PCR to identify genes that are important for the intestinal virulence of Escherichia coli. Bio-Rad Genomics Roadshow, Bucuresti, 7 aprilie 2008.

5.     Palade A M, Usein CR, Ciontea S, Tatu-Chitoiu D, Damian M. Molecular typing of extended-spectrum beta-lactamases-producing Salmonella Typhimurium isolates from children in a paediatric hospital. Al XII lea Congres International de Bacteriologie si Microbiologie Aplicata, Istanbul, 5-9 aug. 2008.

6.     Usein CR, Tatu-Chitoiu D, Nica M, Palade AM, Ciontea SA, Condei M, Damian M. Phylogenetic Background and Virulence Profile of Fluoroquinolone-Resistant Clinical Escherichia coli Isolates from Romanian Patients. Al XII lea Congres International de Bacteriologie si Microbiologie Aplicata, Istanbul, 5-9 aug. 2008.

7.     Carmen-Michaela Cretu, Suzana Elena Cilievici, Lidia Elena Lazar, Dan Ianulle Steriu, Corina Constantin, Ionela Neagoe, Radu Codreanu, Maria Damian. Diarrhoea of parasitic origin:  diagnosis and management.  Al X-lea Colocviul European de Parazitologie, Paris August 2008.

8.     Lidia Elena Lazar, Dan Ianulle Steriu, Carmen-MichaelaCretu, Suzana Elena Cilievici, Ionela Neagoe, Radu R. Codreanu, Corina Constantin, Maria Damian. Neglected intestinal parasites in acute diarrhoeal disease: a case-control study in Romania. Annual Meeting of the Royal Society of Tropical medicine and Hygiene  - International health and tropical medicine, Brighton, UK. 2008.

Tratate / Monografii

1.     Maria Damian. Tehnici bazate pe studiul acizilor nucleici utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a bolilor infectioase. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II. Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, 2008.

2.     Maria Damian, Codruta-Romanita Usein, Marian Negut. Metode moleculare utilizate in diagnosticul si supravegherea microbiologica a patogenilor enterici. Tratat de Microbiologie Clinica, ed II. Dumitru Buiuc si Marian Negut, Ed. Medicala, 2008.

Lectori invitati

1.     Maria Damian. Boli enterice bacteriene. Supravegherea cu laboratorul. Simpozionul „Supravegherea bolilor infectioase prioritare in Romania’, INCDMI „Cantacuzino”, 27 Nov. 2006.

2.     Dorina Tatu-Chitoiu. Supravegherea infectiilor cu Salmonella. Supravegherea cu laboratorul. Simpozionul „Supravegherea bolilor infectioase prioritare in Romania’, INCDMI „Cantacuzino”, 27 Nov. 2006.

3.     Maria Damian. Instalarea unui laborator de biologie moleculara. Simpozion „Metode fenotipice si moleculare de diagnostic al infectiilor cu germeni gram-pozitivi si gram-negativi in Romania”. Simpozion „Supravegherea bolilor infectioase” Ploiesti, 27-30 Nov. 2006.

4.     Maria Damian, Dorina Tatu-Chitoiu. ENTERNET, Praga, 21-23 sept, 2006

Organizare simpozion

1. „Utilizarea secventierii in diagnosticul si epidemiologia bolilor infectioase. Laboratorul de Microbiologie Moleculara INCDMI „Cantacuzino”, 24 Nov. 2006.

 

Rezultatele activitatilor desfasurate in cadrul proiectului, finalizate cu ealborarea unui algoritm de diagnostic in sindromul diareic infectios si proceduri specifice pentru recoltarea, conservatea, transportul si prelucrarea probelor biologice, diagnostic clasic si molecular bacteriologic, virusologic si parazitologic pot contribui la imunatatirea diagnosticului, reducerea numarului de cazuri nediagnosticate, cresterea calitatii vietii printr-o atitudine terapeutica corecta consecutiva unui diagnostic corect.

 

Proiect CEEX 35 / 2005

Titlul proiectului : METODA IMUNOENZIMATICA DE DIAGNOSTIC SEROLOGIC MULTIPLU AL INFECTIILOR CU MYCOBACTERII NETUBERCULOASE LA BOLNAVII IMUNOCOMPETENTI SI IMUNOSUPRESATI / ELISA NE TB/MOTT ELISA 

Director de proiect: Dr.Henriette Stavri, CS I

Parteneri:

P 1: INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU MICROBIOLOGIE SI IMUNOLOGIE “CANTACUZINO”, BUCURESTI

P 2: INSTITUTUL DE PNEUMOFTIZIOLOGIE MARIUS NASTA, BUCURESTI

P  3: SPITALUL DE BOLI INFECTIOASE SI TROPICALE VICTOR BABES, BUCURESTI

P 4: SPITALUL  CLINIC DE URGENTA MILITAR CENTRAL BUCURESTI
P  5: UNIVERSITATEA DE MEDICINA SI FARMACIE CAROL DAVILA BUCURESTI
P  6: INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE IN DOMENIUL PATOLOGIEI SI STIINTELOR BIOMEDICALE VICTOR BABES, BUCURESTI

 

Proiectul urmareste realizarea unei metode imunoenzimatice, de tip ELISA, de diagnostic serologic in cazul bolnavilor infectati cu mycobacterii netuberculoase (atipice, MOTT (Mycobacteria Other Than Tuberculosis), NTM).Unele dintre acestea sint patogene si dificil de diagnosticat. Boala produsa de acestea este denumita micobacterioza. In cazurile de bolnavi imunosupresati, in special la bolnavii cu HIV/SIDA, micobacteriozele reprezinta 90 % din cazuri. Diagnosticul clasic este dificil si de durata (4 – 8 saptamini). Realizarea unui test rapid, serologic care permite diagnosticarea specifica a infectiei cu aceste mycobacterii importante din punct de vedere clinic, utilizind un panel de antigene glicolipidice, obtinute din speciile cele mai des intilnite ( M.avium-intracellulare, M.kansassi, M.xenopi, M.scrofulaceum, M.marinum), purificate prin separare imunomagnetica si lipsite de antigenele commune cu M.tuberculosis ( M.tb), constitue o prioritate absoluta in aceste domeniu.

Proiectul urmareste realizarea unei metode imunoenzimatice de diagnostic serologic rapid, cu sensibilitate si specificitate mari in cazul bolnavilor infectati cu mycobacterii netuberculoase. Rezultatele obtinute cu testele imunoenzimatice comerciale sau descrise in literatura de specialitate pentru diagnosticul infectiilor cu aceste mycobacterii din una sau mai multe specii nu reusesc sa aiba atit sensibilitatea cit si specificitatea mari. Pentru obtinerea unor astfel de rezultate, este extrem de important sa fie folosite seruri anti-mycobacterii netuberculoase, utilizabile ca martori pozitivi, care sa nu mai contina anticorpi comuni cu M.tb.

Metoda propusa utilizeaza pentru prima oara in lume, in acest scop, particule paramagnetice care se vor lega de corpii bacterieni de M.tb pentru a realiza separarea imunomagnetica a anticorpilor din serul martor. In acest fel, serul martor pozitiv va fi specific pentru specia mycobacteriana de interes.

Metoda propusa va putea evidentia rapid specia infectanta, poate fi utilizata ca metoda suplimentara de diagnostic indiferent de localizarea pulmonara sau extrapulmonara a bolii si va permite inceperea tratamentului. Metoda imunoenzimatica nu este dificila si costisitoare si prezinta avantajul ca se pot analiza un numar mare de probe de ser iar rezultatul se obtine in mai putin de 3 ore.

Prin realizarea unui test  de diagnostic serologic a infectiilor cu NTM, proiectul nostru constituie un ajutor important pentru Programul National de Control si Preventie a Tuberculozei cit  si pentru Programul HIV/SIDA, datorita prevalentei extreme de ridicate a mycobacteriozelor la bolnavii imunosupresati, in special a acelora infectati cu HIV. Acest test se poate aplica in orice laborator care poseda echipament de citire ELISA.

Este deosebit de importanta realizarea de teste de diagnostic rapid care sa permita identificarea rapida a speciei bacteriene INTM si initierea unui tratament eficient capabil sa permita eradicarea infectiilor NTM. Dat fiind ca in Romania exista un numar mare de pacienti infectati cu HIV-1, in special copii, susceptibili de infectare nu numai cu M.tb, ci si cu / sau NTM, testul nostrum de diagnostic serologic reprezinta  o metoda utila pentru un diagnostic timpuriu si un tratament eficace.

Astfel, in cele 6 etape au fost desfasurate urmatoarele activitati:

 

Etapa I ( 10.10.2005- 15.12.2005) reparare antigene; selectionare si caracterizare  subiecti

 

a.Preparare antigene glicolipidice izolate din NTM si M.tb H37Rv .

b. Selectionare si caracterizare clinica,radiologica si bacteriologica subiecti, inclusiv HIV +. Subiectii inclusi in acest  proiect sint  imunocompetenti dar si imunosupresati, HIV pozitivi, adulti si copii. Bolnavii selectati au fost impartiti in urmatoarele categorii: 1. cu suspiciune de infectare cu NTM, cu sau faca co-infectie cu M.tuberculosis; 2. cu infectii confirmate de MTM ( martori pozitivi); 3. cu boli respiratorii netuberculoase sau fara vreo infectare cu NTM ( martori negativi). Studiul pe bolnavi a fost aprobat de comitetul local de etica ((IRB #0002508) iar pacientii au acceptat sa participle la acest proiect. Toate probele au fost marcate codificat si pastrate la -70 C pina la testare, Probele au fost testate fara a se cunoaste diagnosticul clinic al fiecarui pacient, dar grupele de studiu nu au fost selectate intimplator, deoarece aceste probe au fost colectate cu scopul précis de a crea o metoda de diagnostic ELISA NTM, de la bolnavi cu suspiciuni de mycobacterioze sau tuberculoza si de la aceia cu alte boli respiratorii. Toti subiectii din acest proiect au fost vaccinati la nastere cu BCG, conform Programului national de imunizare.

c. Diagnostic histopatologic, histochimic si molecular (PCR) in infectiile cu mycobacterii    

 

 

 Etapa II. 15.12.2005- 15.06.2006.  Obtinere seruri specifice si purificare imunomagnetica antigene si seruri specifice. Selectionare, caracterizare clinica,radiologica si bact. bolnavi.

 

a.Obtinere seruri specifice. Producere seruri antiNTM si antiM.Tb si preparare imunoglobuline din seruri . Purificare imunomagnetica antigene glicolipidice.Purificare imunomagnetica  seruri specifice antiNTM

b.Selectionare bolnavi si caracterizare clinica,radiologica si bact.  Recoltare probe biologice   ( seruri  si din  leziuni granulomat ).

c. Testare biochimica tulpini izolate bolnavi.

d. Diagnostic histopatol. histochimic si molecular (PCR)  din probele prelevate prin biopsie de la boln.cu leziuni granulomat

 

Etapa III. 15.06.2006 – 15.12.2006. Realizare trusa ELISA neTB. Testare seruri selectionate.

 

a.Realizare trusa ELISA neTB.Preparare conjugat HRP-SpA si trusa ELISA.

 Testare biochimica tulpini izolate de la bolnavi cu suspiciuni de infectii NTM si/sau mixte, adulti

 b. Selectionare si caracterizare clinica,radiologica si bact. bolnavi. Recoltare probe biologice ( seruri  si din  leziuni granulomat ).

c. Diagnostic histopatol. histochimic si molecular (PCR)  din probele prelevate prin biopsie de la boln.cu leziuni granulomat

 

Etapa IV. 15.12.2006 – 15.06.2007. Efectuarea metodei ELISA neTB, coroborarea datelor clinice si standardizare rezultatelor.

 

       a. Efectuarea metodei ELISA  neTB  la  bolnavii cu suspiciuni inf. NTM si/sau TB,  si  la serurile de bolnavi (M+/ M-) recoltate de P2, P 3, P4 si P5 in etapele I-III Standardizare metoda.Evaluare si interpretare statistica rezultate

       b. Coroborarea datelor clinice si standardizarea rezultatelor. Selectionare si caracterizare clinica, radiologica si bact. Recoltare probe biologice ( seruri  si din  leziuni granulomat ). Evaluare si interpretare rezultate

c. Coroborarea datelor diagn.histochimic si molecular cu rezultatele testului ELISA

 

 

Etapa V . 15.06.2007- 15.12.2007.Aplicarea testului ELISA neTB, standardizare rezultate

 

a.Aplicarea testului ELISA  neTB  la  bolnavii cu suspiciuni inf. NTM si/sau TB,  si  la serurile de bolnavi (M+/ M-) recoltate de P2, P 3, P4 si P5 in etapele I-III Standardizare metoda.Evaluare si interpretare rezultate

b. Coroborarea datelor clinice si standardizarea rezultatelor. Selectionare si caracterizare clinica,radiologica si bact. Recoltare probe biologice ( seruri si din  leziuni granulomat ).

c. Coroborarea datelor diagn.histochimic si molecular cu rezultatele testului ELISA

 

 

Etapa VI. 15.12.2007- 10.10.2008. Aplicarea metodei ELISA  NTM de  catre parteneri, laborator independent, in paralel cu producatorul testului.

Au fost selectionati bolnavi cu suspiciune de infectie NTM, bolnavi cu mycobacterioza, bolnavi cu tuberculoza si persoane cu alte boli respiratorii, inclusiv bolnavi HIV pozitivi. Pacientii de la care s-au prelevat probele au fost evaluati imunologic si virusologic pentru infectia HIV  in vederea stabilirii corelatiei intre gradul imunodepresiei si infectia cu NTM.

Acestor bolnavi li s-au recoltat probe de ser si au fost efectuate investigatiile clinice, radiologice si bacteriologice.Au fost recoltate probe de ser de la donatori de singe, martori negativi. Toate probele de ser recoltate, pastrate la -80 C, au fost testate.

ELISA ne TB a fost efectuata pe 195 seruri de bolnavi, fiecare ser fiind testat simultan cu aceste 5 glicolipide purificate magnetic din speciile de interes (M.avium-intracellulare, M.kansassi, M.xenopi, M.scrofulaceum, M.gordonae) precum si cu glicolipide extrase din M.tuberculosis H37Rv ( ELISA BK).

Au fost testate prin metodele ELISA neTB si ELISA  BK  un numar de 195 seruri recoltate de colaboratori. Serurile proveneau de la bolnavi imunocompetenti sau imunosupresati (majoritatea HIV +): 34 cu infectii NTM, 114 cu TB si 47 cu alte boli respiratorii. 46 de bolnavi au fost HIV +. 9 din cei 34 de bolnavi cu infectii NTM, au fost infectati doar cu o specie de NTM, ceilalti 25 fiind co-infectati cu TB si NTM.

A fost planificata si realizata evaluarea si interpretare statistica a rezultatelor obtinute prin aplicarea testului ELISA neTB la  serurile bolnavilor cu suspiciuni inf. NTM si/sau TB, precum si  la serurile de bolnavi (M+/ M-) recoltate de P2, P 3, P4 si P5 in etapele I-VI. A fost finalizata standardizarea metodei, utilizind ca martori pozitivi, seruri de bolnavi infectati cu diferite NTM, confirmati bacteriologic,clinic si radiologic.  

Au fost calculate urmatoarele date statistice: sensibilitatea, specificitatea, PPV ( valoarea pozitiva predictiva), NPV ( valoarea predictiva negativa), FPR ( rata falsa de pozitivitate), FNR ( rata falsa de negativitate), eroarea si exactitatea

Sensibilitatea a fost definita ca fiind capacitatea ELISA NTM de a detecta cazurile de infectii cu NTM ( sau TB, in cazul ELISa BK). Specificitatea a fost definite ca fiind capacitatea rezultatelor ELISA NTM sa fie negative pentru TB sau alte boli respiratorii ( sau alte boli respiratorii, in cazul ELISA BK ). PPV a  fost definit ca fiind raportul dintre rezultatele in ELISA NTM a bolnavilor cu NTM vs. martori pozitivi, NPV a  fost definit ca fiind raportul dintre rezultatele in ELISA NTM  bolnavilor care nu aveau infectii cu NTM vs. martori negative. FPR = 1- specificitate; FNR = 1 – sensibilitate; exactitatea = raportul dintre bolnavii cu NTM , diagnosticati corect prin ELISA NTM si numarul total de bolnavi cu NTM. Eroarea = raportul dintre bolnavii cu NTM diagnosticati incorect prin ELISA NTM si numarul total de bolnavi cu NTM.

          

Eficienţa testului creşte dacă serurile provin de la bolnavi selectaţi cu suspiciune de mycobacterioza si/sau tuberculoză de către medicul specialist, în prezenţa argumentelor radiologice, corelate cu cele clinice şi epidemiologice.Deoarece diagnosticul unei boli infecţioase nu poate fi stabilit după rezultatul unui singur test şi în cazul infectiilor cu NTM si tuberculozei, rezultatul testului ELISA-NTM trebuie să fie corelat cu toate examenele efectuate, în contexul clinic al bolnavului.

REZULTATE.

 Au fost testate prin metodele ELISA neTB si ELISA BK  un numar de 195 seruri recoltate de colaboratori. Serurile proveneau de la bolnavi imunocompetenti sau imunosupresati (majoritatea HIV +): 34 cu infectii NTM, 114 cu TB si 47 cu alte boli respiratorii. 46 de bolnavi au fost HIV +. 9 din cei 34 de bolnavi cu infectii NTM, au fost infectati doar cu o specie de NTM, ceilalti 25 fiind co-infectati cu TB si NTM.

ELISA BK a avut o sensibilitate de  77 % si specificitate  95,5 %. La cei 85 de bolnavi cu tuberculoza, HIV negativi, sensibilitatea a crescut la 88,5 % in timp ce la 29 bolnavi cu tuberculoza dar infectati HIV, sensibilitatea a fost de doar 46,8 % dar specificitatea a fost de 95,9 %. Aceasta valoare mare a specificitatii se poate datora imunosupresiei severe a bolnavilor respectivi.

ELISA neTB a avut o sensibilitate de 80,9 %, cu valori cuprinse intre 66,6 % (M.scrofulaceum) pina la 100 % (M.kansasii), specificitatea fiind cuprinsa intre 83.8- 89.8%( TB ) si 92.1–100%(alte boli respiratorii),  valori predictive pozitive (PPV): 61.5 -72.7%(TB  ) si  88.8-100%(alte boli respiratorii),  valori predicitve negative (NPV): 98.1- 100 %; rate de falsa pozitivitate (FPR): 7.5-11.6 %;  rate de falsa negativitate (FNR cuprinse intre 0 (M.kansasii) si  33.4%  (M.scrofulaceum) , acuratetea totala 76.5 %, cuprinsa intre 50 (M.scrofulaceum) si  100 %  (M.kansasii) and eroarea 23.5 % cuprinsa intre 0 (M.kansasii) si  50 % (M.scrofulaceum).

 

In concluzie, in cadrul acestui proiect a fost realizat un nou test ELISA multiplu, care permite obtinerea unui rezultat rapid, specific si cu sensibilitate mare in cazul infectiilor cu mycobacterii netuberculoase si chiar a co-infectiilor cu M.tuberculosis pot fi aplicate de mai multi beneficiari din domeniul retelei de penumoftiziologie atit din tara noastra cit si din restul lumii.

 

 

 

In cadrul derularii proiectului, au fost comunicate la congrese internationale, cu comitet de avizare a lucrarilor, un numar de 8 comunicari si a fost trimis spre publicare un articol stiintific la revista  Journal Microbiological Methods, USA, iar un alt articol este sub tipar , urmind a aparea in cursul anului 2009.

 

COMUNICARI:

 

1. “Correlation between  nontuberculous mycobacterial infections and rapid immmunochromatographic serum assay” , autori: Manuela Gheorghiu-Branaru, Henriette Stavri, Matei.Gheorghiu-Branaru, AL XV-lea CONGRES  EUROPEAN DE BOLI RESPIRATORII, MUNCHEN, GERMANIA, 2-6 SEPTEMBRIE 2006

 

2.“Tuberculous cerebral abcess appeared during a tuberculous miliaria in a child having AIDS”, autori: Gh.Murgoci, R.Murgoci, C.Marica, M.Alexe, Henriette Stavri, T.Ciprut, M.Mardarescu, AL XV-lea CONGRES  EUROPEAN DE BOLI RESPIRATORII, MUNCHEN, GERMANIA, 2-6 SEPTEMBRIE 2006

3. Mycobacterial infections detection in HIV positive children using two serologic assays and tuberculin skin test,

Autori:Henriette Stavri^*1, L. Ene², D. Duiculescu², Gh. Murgoci³, O. Moldovan³, M.I. Popa^4,  L Popa⁴

 al XIIlea CONGRES  INTERNATIONAL DE IMUNOLOGIE, RIO DE JANEIRO, BRAZILIA, 21-25 AUGUST 2007

4. The need of a minimal set of tests to identify Mycobacterium species isolated from lower tract respiratory infections

Autori:Loredana Gabriela Popa¹, D. Stavri², Henriette Stavri² and M.I. Popa^1, al XVII-LEA CONGRES ANUAL AL SOCIETATII EUROPENE DE BOLI RESPIRATORII, STOCKHOLM, SUEDIA, 15-19 SEPTEMBRIE 2007

5. Multiple serodiagnosis of nontuberculous mycobacterial infections by enzyme-linked immunosorbent assay

Autori: Henriette Stavri^*, Irina Iorgulescu, D.L.Radu, M.I.Popa, L.G.Popa,

al XVII-LEA CONGRES ANUAL AL SOCIETATII EUROPENE DE BOLI RESPIRATORII, STOCKHOLM, SUEDIA, 15-19 SEPTEMBRIE 2007

6. Diagnostic serologic multiplu al infectiilor cu mycobacterii netuberculoase prin metoda ELISA.

Autori: Henriette Stavri^*, Irina Iorgulescu, D.L.Radu, M.I.Popa, L.G.Popa,

Simpozion CEEX Sibiu, 25-26 octombrie 2007

 

7. Usefulness of ELISA in the multiple serodiagnosis of environmental mycobacteria infections

Henriette Stavri*, Irina Ulea, D.L.Radu,M.Bogdan, Manuela Gheorghiu Branaru, Olga Moldovan,Cornelia Tudose, Marinela Raileanu, D.Duiculescu, Luminita Ene,V.Olar, C.Ionita,M.I.Popa, Loredana Popa, Congres ERS, Berlin, 4-8 oct.2008

 

8. Thin Layer Chromatography characterization of ELISA specific phenolic glycolipids antigens immunomagnetically purified from NTM

 

Irina Ulea, Henriette Stavri, D.L.Radu, Cantacuzino Institute, Mycobacterial Antigens Department, Bucharest, Romania

Congres ERS, Berlin, 4-8 oct.2008

 

 

ARTICOLE STIINTIFICE :

 

I. Articolul trimis spre publicare la revista Journal Microbiological Methods, USA ( Elsevier) :

Usefulness of ELISA in the multiple serodiagnosis of environmental mycobacteria infections

Henriette Stavri^*, Irina Iorgulescu, D.L.Radu, M.Bogdan, Manuela Gheorghiu Branaru, Olga Moldovan,Cornelia Tudose, Marinela Raileanu, D.Duiculescu, Luminita Ene, V.Olar, C.Ionita, M.I..Popa, Loredana Popa,

 

II. Articol  in curs de publicare la Rom.Arch.Microbiol.Immunol, ( 2009) :

Comparison of Tuberculin Skin Test with a whole-blood Interferon Gamma Assay and ELISA, in HIV positive children and adolescents with TB

 

Henriette Stavri¹*, Luminita Ene², Gabriela Loredana Popa³, Dan. Duiculescu², Gheorghe. Murgoci⁴, Constantin Marica ⁴ , Irina Ulea¹, Gabriela Cus¹ and Mircea Ioan Popa³

Tipul Proiectului: Cercetare de excelenta – CEEX 34/2005

Modul: 1

Aria tematica: 1

 

Institutia Contractoare: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie “Cantacuzino”

 

Autoritatea Contractanta: Autoritatea Nationala pentru Cercetarea Stiintifica

 

Titlul proiectului: Cercetari avansate in toleranta imuna cu scopul identificarii de cai terapeutice novatoare in patologia bolilor autoimune de tesut vasculo-conjunctiv (RTI)

 

Director Proiect: Dr. Cristiana MATACHE, CSI

 

Prioada de derulare a proiectului: 2005 – 2008

Buget: 1 455 000 RON

 

Parteneri in Consortiu:

1.      CO: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie si Imunologie Cantacuzino : Dr. Cristiana Matache, csI – cristianamatache@cantacuzino.ro

2.      Partener P2a. Universitatea de Medicina si Farmacie „Carol Davila” prin „Centrului de cercetare in patologia si tratamentul bolilor sistemice reumatismale” – Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Ruxandra Ionescu – ruxandraionescu1@gmail.com

3.      Partener P2b. Universitatea de Medicina si Farmacie „Carol Davila” prin Catedra de Dermatologie I  – Responsabil Stiintific: Prof. Dr. Dan Forsea – aforsea@yahoo.com

4.      Partener P3. Spitalul Clinic de Urgenta „Sf. Pantelimon” – Responsabil Stiintific: Conf. Dr. Cristina Tanaseanu – cristina.tanaseanu@gmail.com

5.      Partener P4. Spitalul Clinic de Nefrologie „Carol Davila” – Responsabil Stiintific: Dr. Sergiu Dumitrache – sergiu_dumitrache@yahoo.com

6.      Partener P5. Institutul National de boli infectioase „Prof. Dr. Matei Bals” – Responsabil Stiintific: Dr. Dan Otelea – dotelea@mateibals.ro

7.      Partener P6. Institutul National de Cercetare-Dezvoltare „Victor Babes” – Responsabil Stiintific: Sef. Lucrari Dr. Eugen Radu, Dr. Gina Manda, csII – imunoc@vbabes.ro

8.      Partener P7. Institutul de Biologie si Patologie Celulara „Nicolae Simionescu” – Responsabil Stiintific: Dr. Felicia Antohe, csI – fantohe@yahoo.com

 

Scopul proiectului: Proiectul vizeza doua directii de importanta egala: (1) cercetare fundamentala, prin care se va studia rolul tolerantei periferice in etiopatogenia bolilor autoimune de tesut vasculo-conjunctiv, (2) cercetare aplicativa pentru stabilirea eficacitatii unei cai terapeutice novatoare care sa redreseze mecanismele perturbate ale tolerantei din aceste patologii.

 

Rezumat :

 

Proiectul propus urmareste elucidarea unor mecanisme implicate in pierderea tolerantei imune periferice cu consecinte asupra etiopatogeniei bolilor de tesut vasculo-conjunctiv. Deoarece celulele T reglatoare si celulele T autoreactive anergice joaca roluri esentiale in mentinerea tolerantei periferice la antigenele self, noi propunem: (1) evaluarea nivelului si starii de activare a celulelor T reglatoare in populatia de celule T periferice ale bolnavilor de Lupus Eritematos Sistemic, Lupus Discoid, Sindrom Sjogren, Sclerodermie, Polimiozita, Dermatomiozita si Boala Mixta de Tesut Conjunctiv; (2) analiza eficacitatii tratamentului cu Rapamycina in scopul restabilirii numarului de celule T reglatoare si a starii de anergie a celulelor T autoreactive la pacientii cu LES, ca prototip al bolilor autoimune sistemice. Proiectul de mare complexitate teoretica si practica, impune implicarea unui numar mare de specialisti in domeniul autoimunitatii dar si in domenii conexe. De aceea, la realizarea acestui proiect vor contribui opt colective de specialisti din universitati si centre de cercetare-dezvoltare care impreuna vor creea primul centru national de cercetare in domeniul tolerantei imune. Informatiile stiintifice ce vor rezulta din acest proiect vor contribui la: (1) cresterea nivelului de cunoastere in etiopatogenia bolilor de tesut vasculo-conjunctiv, domeniu insuficient abordat, (2) introducerea in practica medicala a unei terapii novatoare pentru boli in care pierderea tolerantei joaca un rol decisiv, (3) crearea unei pagini web care sa contina informatii la zi privind cele mai noi metodologii si tehnici de analiza a celulelor T reglatoare si T anergice, (4) constituirea unei platforme tehnologice accesibile tuturor participantilor la proiect si nu numai, (5) cresterea nivelului si calitatii cercetarii biomedicale romanesti in scopul afilierii la programele si platformele tehnologice europene.

 

Obiective planificate:

 

• Punerea la punct a metodologiilor si tehnicilor pentru evaluarea si caracterizarea celulelor T reglatoare si T anergice din populatia de celule T periferice umane;
• Elucidarea rolului celulelor T reglatoare in etiopatogenia bolilor autoimune de tesut vasculo-conjunctiv;
• Evaluarea capacitatii Rapamycinei in restabilirea tolerantei periferice a celulelor T izolate de la bolnavii de LES

 

Rezultatele obtinute:

 

Cercetarile realizate la debutul acestui proiect s-au concretizat in:

Elaborarea de protocoale necesare:

-       caracterizarii fenotipice si moleculare a celulelor T reglatoare periferice umane;

-       caracterizarii starii de activare a celulelor T CD4+ periferice umane – respectiv a dimensiunii si compozitiei microdomeniilor lipidice de la nivelul membranei plasmatice;

-       expandarii ex vivo a celulelor T reglatoare din populatia de celule T CD4+ umane periferice;

-       inducerii starii de anergie a celulelor T CD4+ periferice umane si caracterizarii acestei stari.

Elaborarea unei pagini de web care sa contina toate protocoalele elaborate, pagina de web care a fost pusa la dispozitia participantilor la proiect pe perioada derularii proiectului.

 

Studiile efectuate in scopul elucidarii rolului celulelor T reglatoare in etiopatogenia bolilor de tesut vasculo-conjunctiv au condus la urmatoarele concluzii:

-       Indiferent de patologie, pacientii cu Lupus Eritematos Sistemic, Lupus Discoid, Sclerodermie, Sindrom Sjögren, Dermato- si Polimiozita sau Boala Mixta de Tesut Conjunctiv prezinta un procent redus de celule T reglatoare naturale;

-       Functie de tipul bolii, faza bolii sau terapia administrata, celulele T reglatoare se diferentiaza prin expresia anormala a anumitor markeri fenotipici si moleculari (CD25, CTLA-4, GITR, CD45RO, Foxp3);

-       In unele boli, cum este cazul Sclerodermiei, celulele T CD4+, prezinta la nivelul membranei plasmatice microdomenii cu un inalt continut polipeptidic ceea ce sugereaza starea de hiperactivare celulara. Terapia cu statine a pacientilor cu Lupus Eritematos Sistemic corelata direct cu numarul redus de polipeptide de la nivelul microdomeniilor lipidice sugereaza pe de o parte utilitatea analizei proteomice cel putin in monitorizarea terapiei, iar pe de alta parte eficienta medicamentelor dislipidemice in scopul atenuarii starii de hiperactivare celulara.

Analiza efectelor Rapamycinei asupra celulelor mononucleare periferice ale pacientilor cu Lupus Eritematos Sistemic au aratat ca:

-       Rapamycina, un antibiotic imunosupresor, flolosit in practica curenta din transplantul renal si implantarea de stenturi, este un compus eficient pentru expandarea celulelor T reglatoare periferice ale bolnavilor cu Lupus Eritematos Sistemic. In acelasi timp, Rapamycina are capacitatea de a restabili starea de anergie a celulelor T CD4+ periferice ale pacientilor cu Lupus Eritematos Sistemic. Rezultatele incurajeaza utilizarea Rapamycinei in terapia pacientilor cu Lupus Eritematos Sistemic in scopul reglarii mecanismelor tolerantei periferice. De asemnea, Rapamycina poate fi utilizata si pentru imbogatirea ex vivo a celulelor T reglatoare care apoi sa fie utilizate pentru terapia celulara. Cum Lupus Eritematos Sistemic este prototipul bolilor autoimune sistemice de tesut vasculo-conjunctiv, atunci rezultatele obtinute prin cercetari asupra eficientei Rapamycinei pot fi extrapolate si celorlalte boli de tesut conjunctiv in care s-au identificat defecte similare.

 

Stadiul realizării obiectivelor planificate:

 

Graficul de realizare a activitatilor a fost respectat in totalitate. Implicarea participantilor a fost echilibrata si conforma nivelului de complexitate a activitatilor. Nu au fost necesare modificari in conceptia proiectului.

 

Publicatii derivate din proiect sau conexe proiectului:

 

-      Quantification and molecular characterization of regulatory T cells in connective tissue diseases. Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Ana-Maria Forsea, Cristina Tanaseanu, Sergiu Dumitrache, Dan Otelea, Isabela Tamsulea, Stefanita Tanaseanu, Cristina Chitonu, Simona Paraschiv, Monica Balteanu, Maria Stefanescu, & Cristiana Matache. Autoimmunity, 2008; 42(1): 41-49.

 

-      Role of cellular immunity in Systemic Sclerosis pathogenesis: update on CD4⁺T cells population studies. Alina Nicoleta Besliu, Leontina Mirela Banica, Ruxandra Ionescu, Denisa Predeteanu, Crina Stavaru, Carmen Maria Marica, Cristina Chitonu, Gina Pistol, Maria Stefanescu, and Cristiana Matache. Romanian Archives of Microbiology and Immunology, 2009, 68 (1): 35-42.

 

Capitole in tratate de specialitate (data aparitiei Iunie 2006 – Iunie 2007)

-      Denisa Predeteanu: Boli inflamatoare musculare. Polimiozita/ Dermatomiozita pp 399-417 in Esentialul in reumatologie, Coordonator Conf. dr. Ruxandra Ionescu Editura medicala Amaltea

-      Mihai Abobului: Boala mixta de tesut conjunctiv pp 418-429 in Esentialul in reumatologie, Coordonator Conf. dr. Ruxandra Ionescu Editura medicala Amaltea

-      Ruxandra Ionescu: Lupusul eritematos systemic pp 348-371 429 in Esentialul in reumatologie, Coordonator Conf. dr. Ruxandra Ionescu Editura medicala Amaltea

-      Ruxandra Ionescu: Sindromul anticorpilor antifosfolipide pp 372-381 in Esentialul in reumatologie, Coordonator Conf. dr. Ruxandra Ionescu Editura medicala Amaltea

-      Daniela Opris: Sindromul Sjogren pp 270-280 in Esentialul in reumatologie, Coordonator Conf. dr. Ruxandra Ionescu Editura medicala Amaltea

 

Participarea la diferite manifestari stiintifice:

 

1.      ELABORAREA METODELOR SI TEHNICILOR DE CANTIFICARE SI CARACTERIZARE A CELULELOR T REGLATOARE DIN POPULATIILE DE CELULE MONONUCLEARE PERIFERICE UMANE. Alina Besliu, Maria Stefanescu, Leontina Banica, Gina Pistol, Crina Stavaru, Felicia Antohe, Luminita Radulescu, Cristiana Matache, Sesiunea Stiintifica Anuala a INCDMI „Cantacuzino”, 15-16 decembrie 2005, Bucuresti.

2.      CBL-B AND GRAIL EXPRESSION IN PERIPHERAL BLOOD T LYMPHOCYTES OF PATIENTS WITH SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS. Cristiana Matache, Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, St. Tanaseanu, Ruxandra Ionescu, Francisc Csobor & Maria Stefanescu . 1^st Joint Meeting of European National Societies of Immunology – 16^th European Congress of Immunology, 6-9 septembrie 2006, Paris, Franta.

3.      NIVELUL SI CARACTERISTICILE CELULELOR T REGLATOARE NATURALE IN BOLI AUTOIMUNE DE TESUT VASCULO-CONJUNCTIV. Cristiana Matache, Alina Besliu, Gina Pistol, Leontina Banica, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Cristina Tanaseanu, Isabela Tamsula, Maria Stefanescu, a 36 a Conferinta Nationala de Imunologie, 21-23 septembrie, 2006, Tg. Mures si Al doilea simpozion stiintific al Programului National de CD VIASAN cu tema “De la medicina moleculara si celulara la medicina clinica”, 27 – 28 octombrie 2006, Bucuresti.

4.      ROLUL UBIQUITIN LIGAZELOR E3 IN ANERGIA LIMFOCITELOR T PERIFERICE ALE BOLNAVILOR DE LUPUS ERITEMATOS SISTEMIC. Leontina Banica, Gina Pistol, Alina Besliu, St. Tanaseanu, Ruxandra Ionescu, D. Otelea, Maria Stefanescu and Cristiana Matache. a 36 a Conferinta Nationala de Imunologie, 21-23 septembrie, 2006, Tg. Mures.

5.      LEVEL AND CHARACTERISTICS OF NATURAL T REGULATORY CELLS IN VASCULAR-CONNECTIVE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Cristina Tanaseanu, Sergiu Dumitrache, Ana-Maria Forsea, Dan Otelea, Maria Stefanescu, Cristiana Matache, VIASAN Symposium, Bucuresti, octombrie, 2006; Sesiunea anuala de comunicari stiintifice a INCDMI “Cantacuzino”, decembrie 2006, Bucuresti.

6.      LEVEL AND CHARACTERISTICS OF NATURAL REGULATORY T CELLS IN VASCULAR-CONNECTIVE TISSUE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Ana-Maria Forsea, Cristina Tanaseanu, Isabela Tamsula, Dan Otelea, Maria Stefanescu, Cristiana Matache, 3^rdMeeting of Young Rheumatologists Across Europe,18 – 21 ianuarie 2007, Reichenau, Austria; publicat in Joint Bone Spine, 74 (2), p.215, martie 2007.

7.      LEVEL AND CHARACTERISTICS OF NATURAL REGULATORY T CELLS IN VASCULAR-CONNECTIVE TISSUE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Ana-Maria Forsea, Cristina Tanaseanu, Isabela Tamsula, Dan Otelea, Maria Stefanescu, Cristiana Matache, 27th EWRR 2007 – European Workshop in Rheumatology Research, 22 – 24 februarie,2007, Florenta, Italia; publicat in Annals of the Rheumatic Diseases, March 2007, vol.66, Supplement 1, A68-A69.

8.      QUANTIFICATION OF REGULATORY T CELLS IN PATIENTS WITH VASCULAR-CONNECTIVE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Maria Stefanescu, Gina Pistol, Alina Besliu, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Cristina Tanaseanu, Stefanita Tanaseanu, Ana Maria Forsea, Sergiu Dumitrache, Dan Otelea, Cristiana Matache, World Immune Regulation Meeting, 11-15 aprilie, 2007, Davos, Elvetia.

9.      CELULELE T REGLATOARE NATURALE SI BOLILE AUTOIMMUNE DE TESUT VASCULO-CONJUNCTIV. Alina Besliu, Leontina Banica, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Ana-Maria Forsea, Cristina Tanaseanu, Sergiu Dumitrache, Dan Otelea, Felicia Antohe, Maria Stefanescu, Cristiana Matache; Al III – lea Simpozion al Acad. Nicolae Cajal, 28-29 martie 2007, Bucuresti.

10.  THE LEVEL OF REGULATORY T CELLS IN VASCULAR-CONNECTIVE TISSUE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Gina Pistol, Alina Besliu, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Cristina Tanaseanu, Stefanita Tanaseanu, Ana Maria Forsea, Sergiu Dumitrache, Dan Otelea, Felicia Antohe, Maria Stefanescu and Cristiana Matache. RSCB at 25 years, Anniversary International Workshop „From Basic to Therapeutic Applications”, 6-10 Junie 2007, Bucuresti.

11.  QUANTITATIVE AND FUNCTIONAL ALTERATIONS OF REGULATORY T LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH CONNECTIVE TISSUE DISEASES. Ana Maria Forsea, Leontina Banica, Ruxandra Ionescu, Maria Stefanescu, Cristina Tanaseanu, St. Tanaseanu, Sergiu Dumitrache, Cristiana Matache. World Congress of Dermatology, 1-5 octombrie 2007, Buenos Aires, Argentina.

12.  DERMATOMYOSITIS AND KABPOSI SARCOMA, CONSIDERATION ON AN UNUSUAL CASE. Ana Maria Forsea, Al. Dumitrescu, C. Giurcaneanu. European Academy of Dermatology and Venerology Congress, 16-20 mai 2007, Viena, Austria.

13.  RETRO-ORBITAL MYOSITIS ASSOCIATED WITH PSYHOSIS IN A SEVERE CASE OF SLE. D. Opris, V. Bojinca, A. Borangiu, D. Predeteanu, R. Ionescu. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

14.  ORGAN INVOLVEMENT-INDUCED DISABILITY IN SYSTEMIC SCLEROSIS. C. Mihai, M. Gorga, R. Ionitescu, L. Burz, R. Sfrent-Cornateanu, R. Ionescu, V. Stoica. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

15.  THE EFFECT OF CYCLOPHOSPHAMIDE TREATMENT ON SKIN CHANGES IN PATIENTS WITH SCLERODERMA INTERSTITIAL LUNG DISEASE. I. C. Oprisan, D. Opris, A. Balanescu, V. Bojinca, F. Berghea, M. Abobului, M. Negru, C. Constantinescu, R. Ionescu, D. Predeteanu. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

16.  CATASTROPHIC ANTIPHOSPHOLIPID SYNDROME – CLINICAL DESCRIPTION AND PRECIPITATING FACTORS. M. Isac, C. Constantinescu, R. Ionescu. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

17.  ASSOCIATION BETWEEN SJÖGREN’S SYNDROME AND NON-HODGKIN’S LYMPHOMA. D. Opris, A. Borangiu, I. Oprisan, D. Predeteanu, R. Ionescu, V. Stoica. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

18.  WHAT DOES THE RHEUMATIC PATIENT DEMAND FROM THE HEALTH SYSTEM – A ROMANIAN PERSPECTIVE. A. Stoica, F. Berghea, M. Minea, D. Opris, D. Predeteanu, V. Bojinca, C. Berghea, R. Ionescu. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

19.  DOES THE GENERAL POPULATION RECOGNIZE THE CLINICAL IMPORTANCE OF SJOGREN’S SYNDROME MANIFESTATIONS? D. Opris, F. Berghea, O. Baltes, V. Bojinca, R. Sfrent Corneteanu, A. Balanescu, D. Predeteanu, R. Ionescu, V. Stoica. Congres EULAR, iunie 2007, Barcelona, Spania.

20.  THE LEVEL OF REGULATORY T CELLS IN VASCULAR-CONNECTIVE TISSUE AUTOIMMUNE DISEASES. Leontina Banica, Gina Pistol, Alina Besliu, Crina Stavaru, Ruxandra Ionescu, Cristina Tanaseanu, Stefanita Tanaseanu, Ana Maria Forsea, Sergiu Dumitrache, Dan Otelea, Felicia Antohe, Maria Stefanescu, Cristiana Matache. “From basic science to therapeutic applications”. Romanian Society for Cell Biology Anniversary Meeting, 7 – 10 June 2007, Bucuresti.

21.  ROLUL CELULELOR T REGLATOARE IN PATOLOGIA BOLILOR AUTOIMUNE DE TESUT CONJUNCTIV. Cristiana Matache, Leontina Banica, Alina Besliu, Gina Pistol, Crina Stavaru, Ruxandra Ionecu, Cristina Tanaseanu, S. Dumitrache, Ana-Maria Forsea, St. Tanaseanu, D. Otelea, Maria Stefanescu, A 37-a Conferinta Nationala de Imunologie, 19-21 septembrie 2007, Iasi.

22.  RESEARCH INTO THE PATHOGENESIS AND IMMUNE DYSFUNCTIONS IN SYSTEMIC LUPUS ERYTHEMATOSUS. Cristiana Matache, Maria Stefanescu, Adrian Onu, Leontina Banica, Alina Besliu, Geza Szegli – Sesiunea Stiintifica Anuala a Institutului National de Cercetare Dezvoltare V. Babes, 31 octombrie – 2 noiembrie 2007, Bucuresti.

23.  MANIFESTARI HEMATOLOGICE IN LUPUSUL ERITEMATOS SISTEMIC. Mihaela Minea, Anca Badica, Mihaela Florea, F. Berghea, Mihaela Chitea, Georgiana Patrascu, Oana Popescu, Oana Voicu, Denisa Predeteanu, Ruxandra Ionescu – Congresul National de Reumatologie, 14-17 noiembie 2007, Brasov.

24.  LUPUS ERITEMATOS SISTEMIC BULOS ASOCIAT CU PROLACTINOM. PREZENTARE DE CAZ. Irina Vaduva, Mihaela, Mihaela Tanase, Cosmin Dascalu, Violeta Bojinca, Denisa Predeteanu, Congresul National de Reumatologie, 14-17 noiembie 2007, Brasov.

25.  A NEW THERAPEUTIC WAY IN AUTOIMMUNE DISEASES – EX VIVO REGULATORY T CELLS EXPANSION. L. Bănică, A. Beşliu, C. Stăvaru, R. Ionescu, C. Tănăseanu, Şt. Tănăseanu, M. Ştefănescu and C. Matache. A 38 a Conferinta a Societatii de Imunologie din Romania. 24-26 Septembrie 2008, Busteni.

26.  EFFECTS OF SOME CELLULAR AND MOLECULAR DEFECTS ON ANTI-DNA TOPOISOMERASE I ANTIBODIES PRODUCTION IN SYSTEMIC SCLEROSIS PATIENTS. M. Stefanescu, L. Banica, A. Besliu, G. Pistol, C. Stavaru, R. Ionescu, A.M. Forsea, C. Tanaseanu, S. Dumitrache, D. Otelea, M. Balteanu, and C. Matache. 6thInternational Congress on Autoimmunity, 10-14 septembrie 2008, Porto, Portugalia.

 

Modul de actiune pentru conectarea la platforma europeana de cercetare:

 

Medicii si cercetatorii din „Centrul de cercetare in patologia si tratamentul bolilor sistemice reumatismale”, Universitatea de Medicina si Farmacie „Carol Davila” impreuna cu cei din „Centrului de Studii Avansate – Laborator Receptori Celulari”, INCDMI Cantacuzino, de o lunga perioada de timp au activitati de cercetare focalizate asupra aspectelor clinico patologice, celulare si moleculare, ale bolilor autoimune. Aceasta activitate s-a concretizat prin publicatii in reviste internationale, ceea ce a condus la afirmarea autorilor pe plan international si la participarea lor la colaborari si proiecte internationale. Domeniul de interes a facut favorabila participarea lor la activitatile EULAR iar, in anul 2007 impreuna cu membrii EUSTAR la elaborarea unui proiect FP 7 dedicat sclerozei sistemice.

Proiect CEEX 28/2005

„Retea (platforma) integrata de patogenomica pentru transferarea rezultatelor cercetarii in biomedicina (microbiologia bolilor infectioase)”-PATGEN-NET

Director proiect: Sef lucrari CS I dr. Irina Codita

Partenerii consortiului:

CO – Institutul National de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiolgie si Imunologie „Cantacuzino”, Bucuresti

P1 – Institutul de Pneumoftiziologie „Marius Nasta”

P2 – SN – Institutul Pasteur Bucuresti S. A.

P3 – Facultatea de Biologie, Universitatea din Bucuresti

P4 – Spitalul de Boli Infectioase si Tropicale „Victor Babes” Bucuresti

P5 – Institutul de Sanatate Publica Iasi

P6 – Institutul de Sanatate Publica Timisoara

P7 – Facultatea de Biologie, Universitatea Babes-Bolyai Cluj

P8 – Institutul de Sanatate Publica Bucuresti

P9 – Institutul de Sanatate Publica Cluj

Obiectivul strategic al acestui proiect are în vedere integrarea şi armonizarea capacităţilor naţionale şi a expertizei umane în aria patogenomicii. Reţeaua (platforma) iniţiată pentru prima dată în Romania, este concepută ca o soluţie complexă pentru concentrarea capacităţilor tehnice naţionale, care vor fi fructificate în comun de către instituţiile naţionale implicate în patogenomică. Rezultatele vor fi transferate eficient către domeniul biomedical prin participarea in proiect a principalilor beneficiari. In acelaşi timp, se urmareste contactarea unor iniţiative din domeniul patogenomicii la nivel european, precum si pregătirea capacităţilor şi a expertizei naţionale pentru proiectele de cercetare europeană PC7.

ESTE PENTRU PRIMA OARA CA SE INITIAZA UN ASTFEL DE PROIECT LA NOI IN TARA SI VOR FI INTRODUSE CEL PUTIN 10 NOI TEHNICI DE GENETICA MOLECULARA PENTRU PRIMA OARA IN ROMANIA.

Din punct de vedere tehnic, unul dintre scopurile principale ale proiectului este sa producă date de tipizare microbiologică precise, transportabile pe suport electronic şi uşor comparabile pentru controlul infectiilor la nivel local si supravegherea nationala si Europeana a microorganismelor sentinela. Acest lucru va fi posibil (i) prin armonizare metodelor de secventiere pentru tipizarea bazata pe secventiere, (ii) prin construirea capacitatii de secventiere ADN in diagnosticul microbiologic, (iii) prin asigurarea controlului si evaluarii calitatii (QC/QA) pentru secventierea ADN in diagnosticul microbiologic, (iv) prin imbunatatirea accesului general la rezultatele tipizarii microorganismelor si transferul datelor la nivel international.

Printr-o mai buna intelegere a mecanismelor de patogenitate, a mecanismelor de rezistenta la antibiotice, a relatiei microorganism – gazda, precum si a modului de raspandire a microorganismelor patogene si/sau a factorilor de rezistenta, medicii pot sa controleze mai eficient bolile infectioase ale pacientilor lor. Epidemiologii si factorii de decizie din domeniul sanatatii publice pot actiona pentru a intrerupe raspandirea diverselor boli sau ar putea adopta masuri preventive de vaccinare a populatiei.

Categoriile profesionale mentionate pot fi coniderate beneficiare ale acestor eforturi, dar in egala masura participa la acest proiect printr-un proces de feed – back, ceea ce intareste compatibilitatea intre aceste retele. Progresul determinat de patogenomica in aparitia unor tehnici noi poate fi transferat altor laboratoare si diseminat catre specialisti in domeniile sanatatii publice si bolilor infectioase.

Reţeaua (platforma) include următoarele obiective specifice:

1. Crearea reţelei (platformei) de instituţii naţionale şi capacităţi tehnice comune în vederea transpunerii rezultatelor din cercetare în domeniul biomedical (microbiologia bolilor infecţioase), precum şi prospectarea patrimoniului naţional de capacităţi şi expertiză în patogenomică.

2. Contactarea Iniţiativei Patogenomice la nivel european şi pregătirea capacităţilor naţionale pentru FP7 din cercetarea europeană.

3. Demonstrarea funcţionalităţii reţelei (platformei) în mediul de sănătate publică, prin conlucrare cu principalii beneficiari şi furnizori de informaţie, precum şi cu instituţii de cercetare similare. Identificarea noilor cerinţe ale pieţii va fi in egală măsură avută în vedere.

Aceste obiective specifice vor fi atinse utilizand experimente orientate pe probleme, cu ajutorul carora vor fi validate metodele armonizate de patogenomica, va fi creat un mediu colaborativ intre institutiile participante si vor fi identificate oportunitatile de extindere a retelei catre alti parteneri reprezentativi, studii collaborative asupra mediului etc.

Metodologia si tehnicile moleculare ce vor fi utilizate:

A. Metode de caracterizare genotipica bazate pe reactia de amplificare enzimatica PCR- sistem multiplex, urmata sau nu de digestia cu endonucleaze de restrictie (Metoda PCR-RFLP)
Metode de tipizare moleculara bazate pe secventierea ADN

- Sistemul MLST (Multi Locus Sequence Typing) & SLST ( Single Locus Sequence Typing)

C. Analiza clonala bazata pe macrorestictia profilelor ( PFGE- pulsed field gel electrophoresis)

D. Tehnica macroarray, care asociaza o reactie PCR cu o hibridizare spoligotyping

Izolatele clinice incluse in experimente vor apartine urmatoarelor specii.

1. Staphylococcus aureus – tulpini rezistente la Meticilina (MRSA) izolate din infectii nosocomiale si infectii comunitare

2. Enterococcus faecium – tulpini multiplu rezistente la antibiotice

3. Streptococcus pyogenes

4. Candida albicans

5. Complexul Mycobacterium tuberculosis

Pentru a atinge obiectivele proiectului in ceea ce priveste armonizarea metodologiei supravegherii de laborator cu cea europeana si chiar cu cea internationala, vom valida/evalua pentru a putea introduce in supravegherea de rutina, urmatoarele metode:

1. Pentru MRSA

– Grup A de metode:

· Detectarea genei mecA , folosind gena rARN 16 pentru controlul intern al reactiei PCR

· Caracterizarea elementului SCCmec (staphylococcal chromosome cassette), folosind gena mecA pentru control intern in reactia PCR

· Detectarea genei lukS-lukF gene, ce codifica pentru leucocidina Panton-Valentine

– Grupul B de metode:

SLST – tipizare gena spa (codifica pentru proteina A) – spa typing

· MLST – Determinarea caracterului alelic bazat pe secventa fragmentelor interne a 7 gene: arcC (carbamate kinase), aroE (shikimate dehydrogenase), glpF (glycerol kinase), gmk (guanylate kinase), pta (phosphate acetyltransferase), tpi (triosephosphate isomerase), yqiL (acetyl-CoA acetyltransferase)

– Grup C de metodelor C: PFGE folosind SmaI

2. Pentru tulpinile Enterococcus faecium

– Grup A de metode:

· Multiple-locus variable-number tandem repeat (VNTR) analysis (MLVA)

– Grup B de metode:

· MLST – Determinarea profilului/ caracterului alelic bazat pe secventa fragmentelor interne a sapte gene : adk (adenylate kinase), atpA (ATP synthase, alpha subunit), ddl (D-alanine:D-alanine ligase), gyd (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), gdh (glucose-6-phosphate dehydrogenase), purK (phosphoribosylaminoimidazol carboxylase ATPase subunit), pstS (phospate ATP-binding cassette transporter)

3. Pentru tulpinile Streptococcus pyogenes

– Grup B de metode::

SLST – Tipizare bazata pe polimorfismul regiunii hipervariabile a genelor emm – codifica proteinele M and M-like (emm sequence typing)

MLST – Determinarea profilului/caracterului alelic bazat pe secventa fragmentelor interne a sapte gene:gki (glucose kinase), gtr (glutamine transporter protein), murI (glutamate racemase), mutS (DNA mismatch repair protein), recP (transketolase), xpt (xanthine phosphoribosyl transferase), yqiL (acetyl-CoA acetyltransferase3).

4. Pentru tulpini Candida albicans

– Grup B de metode:

MLST – Determinarea profilului/caracterului alelic bazat pe secventa fragmentelor interne a sapte gene: aat1 (aspartate aminotransferase), acc1 (acetyl-CoA carboxylase), adp1 (ATP-dependent permease), mpi (mannose phosphate isomerase), sya1 (alanyl-RNA synthetase), vps13 (vacuolar protein sorting protein), zwf1b (glucose-6-phosphate dehydrogenase)

5. Pentru tulpinile complexului Mycobacterium tuberculosis

– Grup D de metode : spoligotyping

6. Pentru HBV

- Grup A de metode : Amplificarea domeniilor B si C ale genei HBV-pol cu reactivi comerciali -

- Grup B de metode: Detectia secventelor specifice de tip in domeniile B si C ale genei HBV-pol cu reactivi comerciali.

Rezumate raportari etape:

Etapa I – 15 Decembrie 2005

Desfasurarea primei etape a confirmat alegerea obiectivelor si experimentelor si nu apreciem ca vor fi necesare modificari privind metodele pe care avem in vedere sa le experimentam, cu exceptia situatiilor in care acest lucru nu se va impune, ca urmare a unor noi decizii de armonizare la nivel european.

Scurta descriere a activitatilor desfasurate

Prin comunicarea intre parteneri, realizata prin mijloace de comunicare conventionale si electronice, dar si in cadul unui atelier de lucru, s-au realizat obiectivele privind:

- elaborarea unei baze de date cu persoane de contact,

- finalizarea solutiei manageriale (schema consortiului, grupuri de lucru etc.).

A fost intreprinsa analiza capacitatilor tehnice, a metodelor utilizate la nivel national si european.

S-a analizat cererea la nivelul sistemului de sanatate publica, privind aplicarea metodelor de patogenomica in supraveghere si controlul unor boli transmisibile prioritizate (infectii nosocomiale si rezistenta la antibiotice, hepatite, tuberculoza, infectii oportuniste la pacienti HIV/SIDA).

Etapa II – 15 iunie 2006

Proiectul a atins integral obiectivele formulate pentru aceasta etapa.

Scurta descriere a activitatilor desfasurate

- Analiza a tehnicilor armonizate la nivel european pentru diferentierea clonala a tulpinilor de MRSA, streptococ de Grup A, Enterococcus faecium, Candida albicans, VHB; documentare privind tehnica spoligotyping ca metoda de electie pentru caracterizarea clonala a C. albicans (CO, P1, P2, P3, P4, P5, P7). Au rezultat 7 referate generale, cu 2 mai mult decat cele planificate. Aceste referate generale au fost comunicate in cadrul work-shop-ului organizat in luna iunie 2006. Sase dintre referate au fost acceptate pentru evaluare spre publicare la revista Societatii Romane de Microbiologie, iar doua au fost deja publicate

- Analiza comparativa a nivelului tehnologic in domeniul patogenomicii pe plan national si mondial: pentru MRSA si Streptococcus pyogenes, acest lucru a fost facilitat de participarea directa a laboratoarelor de referinta din INCDMI „Cantacuzino” in retelele europene seqEU Net, respectiv StrepEuro; analiza efectuata pentru Enterococcus, Mycobacterium tuberculosis, Candida albicans si VHB s-a raportat la date recente de interes european si global disponibile in reviste de specialitate sau in banci de date recunoscute

- Identificare strategii de integrare la nivel european – a fost contactata initiativa PATOGENOMICA – ERA-NET si au fost obtinute recomandari cu privire la posibilitatile de participare in cadrul acestei initiative in viitor;

- Prospectarea oportunitatii de achizitionare de echipamente pentru proiect si/sau pe plan national – CO, partenerii P3 si P4 au achizitionat diferite echipamente: aparat spoligotyping, hota cu flux laminar, balanta analitica etc.

- A fost initiata actiunea de colectare a probelor/tulpinilor de catre partenerii P2, P3, P5, P7; in acest sens, au fost stabilite datele care vor fi cuprinse in formularele de insotire a probelor/tulpinilor si au fost colectate primele tulpini bacteriene, tulpini C. albicans si seruri.

- In cadrul activitatilor de management de proiect au fost organizate 5 intalniri de lucru pe grupe de lucru si a fost organizat un work-shop in care au fost prezentate rezultatele de etapa (referatele generale, fisele de insotire ale probelor etc.)

- Asigurarea reprezentativitatii probelor/tulpinilor incluse in studiu este asigurata prin participarea partenerilor din sistemul de sanatate publica (P5, P6, P8, P9) prin: argumentarea necesitatilor de caracterizare clonala la nivel teritorial, participarea la redactarea buletinelor de insotire a probelor/tulpinilor, prezentarea de referate generale privind aspecte particulare ale circulatiei diferitelor forme de VHB in Romania etc.

Etapa III – 15 decembrie 2006

Prin activitatile desfasurate in aceasta etapa (validare/optimizare metode, transferarea rezultatelor cercetarii prin integrarea experientei in cercetare cu cea a microbiologilor si epidemiologilor din sistemul de sanatate publica, feed-back activ din zona supravegherii epidemiologice curente in cea a cercetarii aplicative, pentru fixarea tintelor si selectarea probelor etc.), proiectul avanseaza in atingerea obiectivului general de armonizare si integrare a capacitatii nationale si expertizei umane in aria patogenomicii.

 scurta descriere a activitatilor desfasurate

In etapa a III-a au fost continuate activitatile din etapa anterioara, care a constat in analiza aprofundata a metodelor de caracterizare genetica a microorganismelor patogene selectate (S.aureus, streptococ Grup A, enterococ, Candida albicans, Mycobacterium tuberculosis, virusul hepatitei B) aplicabile in Romania, achizitionarea de echipamente si reactivi si elaborarea metodologiei pentru demonstrarea functionalitatii modelului demonstrativ al retelei de patogenomica.

Au fost realizate urmatoarele activitati:

1.Incercari pentru validarea/optimizarea solutiilor tehnice selectate la CO, P2, P3, P7, respectiv:

- Metodele de tipizare a MRSA armonizate la nivel european: PFGE, spa typing, MLST

- Tipizarea SLST emm si MLST a Streptococului de Grup A

- Genotiparea VHB

2. Colectare probe insotite de fise insotitoare redactate la nivelul consortiului pentru: S. aureus, Candida albicans, enterococ din infectii nocosomiale, (P3, P4) Mycobacterium tuberculosis (P1), enterococ din probe de apa uzata (P7) si de la animale (P2)

3. Transfer tehnologic si formarea resurselor umane:

- work-shop-uri: Mycobacterium tuberculosis si Candida albicans

- stagiu de 4 zile la P7 a 4 cercetatori din insitutia CO

- work-shop organizat la ASP Ploiesti pentru schimb de experienta

4. Partenerii din C5, 6, 8 si 9 au realizat reprezentativitatea probelor prin corelarea permanenta a necesitatilor existente in supravegherea curenta cu obiectivele programului.

Etapa IV

A fost continuata validarea solutiilor tehnice selectate pe baza modelarii teoretice, expertizei practice a participantilor la proiect si a schimbului de informatie cu punctele de contact de la nivelul platformei(lor)/ programelor europene cu profil de patogenomica

S-a urmarit asigurarea reprezentativitatii probelor (seruri, tulpini) incluse in studiu, care a fost asigurata prin participarea in proiect a partenerilor reprezentativi din sistemul de sanatate publica (institute de sanatate publica regionale, Institutul National de Pneumoftiziologie, un spital de boli infectioase).

Au fost realizate urmatoarele activitati:

1. Continuarea colectarii prelevatelor clinic si/sau mediu: S. aureus, Candida albicans (P4, P6, P9), enterococ din infectii nocosomiale (P3, P4), Mycobacterium tuberculosis (P1), enterococ din probe de apa uzata (P7) si de la animale (P2)

De la partenerii 1, 4 si 9 s-au colectat tulpini bacteriene si fungice si/sau extract ADN total (Mycobacterium tuberculosis), insotite de fise completate cu parametri stabiliti in faza a II-a  a proiectului.

De la partenerul 2 s-au primit izolate de enterococi de la pasari, iar de la P1, 5 probe de ADN extras din tulpini de Mycobacterium tuberculosis.

1. Incercari (testari) in vederea validarii parametrilor de reactie pentru tehnicile de genotipare:
   1. Enterococcus faecium (VNTR si MLST pe tulpini provenite de la om (indivizi sanatosi si cazuri clinice), porc, pasari si din ape uzate
   2. Candida albicans – Incercari (testari) in vederea validarii parametrilor de reactie pattern ADRA, electrocariotipare
2. Mycobacterium tuberculosis – Incercari (testari) in vederea validarii parametrilor de reactie pentru tehnica de spoligotipare

Aceste testari au fost realizate de P2, respectiv P7.

Rezultatele obtinute si posibilitatile de investigare prin metode de patogenomica au fost diseminate prin publicatii si comunicari.

Etapa V – 15 iunie 2008

In aceasta etapa a fost proiectata platforma si s-a initiat reteaua de furnizare de servicii

S-au realizat urmatoarele activitati experimentale pentru demonstrarea functionalitatii platformei:

1. Continuarea colectarii prelevatelor clinice si/sau din mediu (ser, prelevate bacteriologice etc.) si izolarii microorganismelor

2. Obtinerea de date complete (fenotipice si moleculare) pentru cel putin 15 probe, pentru fiecare metoda selectata

3. Simularea testarilor de laborator pentru metodele selectate si demonstrarea reproductibilitatii, preciziei si acuratetei metodelor.

Rezultate semnificative:

1. Configurarea retelei de patogenomica:

1. Rezultate preliminare cu valoare orientativa privind caracterizarea prin metode de patogenomica a microorganismelor selectate pentru experimentele tintite:

- Un procent de 45% dintre cele 65 de tulpini de S. aureus selectate au fost detectate ca fiind S. aureus rezistent la meticilina (SARM), conform antibiogramei difuzimetrice si testului PCR pentru gena mecA; dintre acestea 86,36% s-au incadrat in clasa 3 Tomasz, cu rezistenta de nivel inalt.

- majoritatea tulpinilor de  S. aureus rezistent la meticilina s-au incadrat in tipul spa t030 (date preliminare pe un numar de 34 tulpini tipizate prin compararea secventelor genei spa).

- un numar de 4 tulpini, pentru care a putut fi detectat tipul spa t008, caracteristic tulpinilor de S. aureus de provenienta comunitara cu circulatie intensa in SUA si, recent in Germania, au fost caracterizate suplimentar prin detectarea genelor pentru leucocidina Panton Valentine (lukS/F) si PFGE (date communicate la 18th ECCMID (European Conference of Clinical Microbiology and Infectious Diseases), Barcelona, Spania, 2008.

- Desi au provenit din regiuni geografice diferite, toate cele 15 tulpini de Streptococcus pyogenes tipizate s-au incadrat in serotipul T1, tipul emm 1, tipul ST 28 (profil alelic 4-3-4-4-4-2-4). Ordinea genelor în profilul alelic MLST este următoarea: gki-gtr-murI-mutS-recP-xpt-yqiL

- Trei din cele 9 tulpini de Candida albicans izolate din aspirat bronsic au fost rezistente la Fluconazol, ca si cele 2 tulpini provenite din plagi. Rezistenta la Fluconazol au prezentat si tulpinile izolate din hemocultura si urina (rezultate preliminare pe 19 tulpini identificate prin metode fanotipice si moleculare)

- Din totalul de 15 de tulpini de Mycobacterium tuberculosis analizate, s-au identificat 9 spoligotipuri. Cele mai multe izolate au fost incadrate in Familia M. tuberculosis T1, in care s-au regasit doua spoligotipuri, insa cel mai frecvent a fost spoligotipul 777777777760731 gasit la 6 tulpini. .

- Probele pozitive pentru HBV prin PCR s-au incadrat in genotipul “D”. O proba a prezentat concomitent  si o banda de hibridizare corespunzatoare genotipului “E”, care ar putea indica o co-infectie D/E.

Etapa VI: 15 septembrie 2008

In aceasta etapa a fost finalizata demonstrarea functionalitatii platformei integrate, care a fost validata de catre utilizatori.

Principalele rezultate ale incercarilor (testarilor) prin metode de patogenomica cu valoare

orientativa pentru beneficiarii din sistemul de sanatate publica:

- In cazul tulpinilor incadrate in etapa anterioara in tipul spa t008 si posedand genele lukS/F, care codifica pentru leucocidina Panton Valentine, alelele identificate prin MLST sustin posibilitatea incadrarii tulpinii in tipul ST8. In acest fel este intarita supozitia noastra, bazata si pe datele obtinute la tipizarea SCCmec, ca aceste tulpini, de provenienta comunitara sunt similare tulpinii USA300, care a inceput sa circule si in Europa. (Witte et al – Eurosurveillance, 13, 1-3, 2008).

Astfel, desi proiectul nostru si-a propus intr-o prima etapa demonstrarea functionalitatii platformei, s-au obtinut deja informatii interpretabile epidemiologic foarte utile, cu privire la provenienta tulpinilor de S. aureus implicate in infectii nosocomiale.

- Prin experimentarea PFGE pentru S. aureus a fost demonstrata posibilitatea obtinerii unor rezultate interpretabile din punct de vedere epidemiologic, fiind astfel demonstrata functionalitatea procesului de furnizare a serviciilor in cadul platformei de patogenomica.

- Tulpinile cu spa-type t008 si leucocidina Panton Valentine pozitive, au putut fi incadrate in tipul SCCmec IV, ceea ce confirma supozitiile noastre privind similitudinea acestora cu tulpina „de succes” USA300, care a inceput sa se raspandeasca si in Europa (Witte et al – Eurosurveillance, 13, 1-3, 2008).

- Au fost obtinute si introduse in baza de date internationala profile noi VNTR de Enterococcus faecium.

- S-a demonstrat importanta metodelor de identificare moleculara pentru identificarea corecta a C. albicans

A fost contactata initiativa europeana Pathogenomics, in intentia de a participa la actiunile europene concertate de studiu al bacteriilor patogene.  Intrucat nu este posibila intrarea de noi parteneri in acest moment, coordonatorii initiativei au inclus institutia noastra in lista de corespondenta pentru anuntarea actiunilor initiativei si vor avea in vedere in viitor o posibila colaborare.

Pe baza experientei castigate in cursul proiectului a fost posibila participarea noastra in studiul european SeqEU.net (www.seqnet.org) si introducerea de date in baza de date a acestui grup, continand tipurile spa de stafilococi izolati in cele 26 de tari participante, intre care si Romania. Datele au fost publicate in Eurosurveiilance.

Implementarea cu succes a metodelor de patogenomica de varf, precum si demonstrarea functionalitatii platformei constituie premize pentru posibila angajare a resurselor materiale si umane in domeniul patogenomicii in programe de cercetare/supraveghere europene.

A fost demonstrata posibilitatea obtinerii unor rezultate interpretabile din punct de vedere epidemiologic de catre beneficiarii serviciilor platformei, fiind astfel demonstrata functionalitatea platformei.

Directii de valorificare identificate:

• Directiile de valorificare a platformei pe termen mediu:
  • Utilizarea expertizei si capacitatilor de investigare castigate prin derularea acestui proiect pentru continuarea/aprofundarea cercetarii patogenitatii si particularitatilor epidemiologice ale microorganismelor circulante in Romania prin inaintarea unor propuneri de proiecte de cercetare de sine statatoare, cu privire la:
    • Caracterizarea moleculara complexa a tulpinilor de Staphylococcus aureus rezistent la meticilina in mediu de spital si comunitar
    • Studiul complex al infectiilor de etiologie candidozica la pacienti cu deficite imune sau boli invalidante (ex. HIV/SIDA)
    • Studiul prin metode de patogenomica a microorgansimelor de interfata implicate in patologie umana si animala
    • Metode de patogenomica pentru studiul poluarii microbiene a mediului
    • Caracterizarea moleculara a tulpinilor de Mycobacterium tuberculosis cu rezistenta multipla la antibiotice circulante in Romania
    • Studii de patogenomica pentru caracterizarea tulpinilor de virus hepatic B, in scopul ameliorarii algoritmului terapeutic si supravegherii/controlului hepatitei B in Romania

• • Continuarea colaborarilor europene initiate in cursul derularii acestui proiect si continuarea demersurilor initiate in vederea extinderii contactelor la nivel european cu retele de cercetare/supraveghere a microorganismelor implicate in etiologia infectiilor nosocomiale si a altor boli transmisibile
• Directiile de valorificare pe termen lung:
  • Implementarea investigatiilor moleculare din domeniul patogenomicii experimentate de noi in activitatea de supraveghere curenta, in masura posibilitatilor de sustinere a cheltuielilor aferente de catre beneficiari (sistemul de sanatate publica, spitale), pentru armonizarea cu cerintele programelor de supraveghere europene finantate de Centrului European pentru Controlul Bolilor Transmisibile.
  • Extinderea activitatilor platformei prin implicarea in domenii de cercetare/supraveghere de granita (sanatate umana-sanatate animala-mediu)
  • Cooptarea unor noi parteneri cu capacitati in domeniul patogenomicii la nivel national
  • Dezvoltarea unor activitati de mentinere/cresterea a expertizei nationale prin implementarea unor activitati de instruire in domeniul patogenomicii

Proiect CEEX 1356, VIASAN 173, 2006 – 2008

                                  Director proiect: Dr. Nicoleta Andreescu

                                  Coordonator: I.N.C.D.M.I. CANTACUZINO

 

Titlu proiect: “Creare sistem de expertiza prospectiva si evaluarea riscului populatiei angajate in relatie cu expunerea la agentii biologici.”

Scop: Asigurarea sanatatii populatiei angajate in activitati cu expunere la agenti biologici identificati, care sunt clasificati in “Lista europeana” si care sunt capabili sa produca imbolnaviri ocupationale.

Rezumat. 1- Construirea platformei informationale interinstitutionale pentru validarea diagnosticului bolilor infectioase. 2 – Crearea sistemului de expertiza a riscului biologic si evaluarea calificativului de risc pe baza examinarii clinice si paraclinice a populatiei angajate in ocupatii cu risc biologic. 3 – Cercetarea functionarii locurilor de munca respective in conformitate cu cerintele Ghidului national de biosiguranta. 4 – Construirea bazei de date cu documentatia medicala aferenta si in conformitate cu H.G. in domeniu.

 5 – Diseminarea rezultatelor obtinute si a cunostintelor in domeniu pe plan national si european. 6 – Valorificarea bazei de date si a rezultatelor pe plan national, dar si in perspectiva promovarii acestora pe plan european.

Parteneri: UMF “Carol Davila” Bucuresti, Catedra de Medicina muncii si INCD Protectia muncii “Al. Darabont”.

Responsabili stiintifici: Dr. Rapas Liliana (coordonator) si Prof. Dr. Naghi Eugenia, Biol. Racovita Anca (parteneri).

Etapa 1 (1.09. – 30.11.2006)

Analiza  stadiului actual al reglementarilor legislatiei pe plan european si national privind expunerea la agenti biologici a populatiei angajate.

Realizata astfel: S-au retinut ca necesare urmatoarele: 1 – Legea Securitatii si sanatatii in munca nr. 319/2006. 2 – Directiva CEEX 54/2000. 3 – Lista europeana cu agenti biologici implicati in patologia ocupationala si clasificarea acestora in 4 grupe. 4 – H.G. a Romaniei 1092/2006.

Etapa 2 (1.12.2006 – 31.08.2007)

Cercetare aplicativa in 2 studii pilot (clinica si paraclinica, de mediu, statistica) in scopul elaborarii unei proceduri de evaluare si monitorizare a riscului expunerii profesionale la agenti biologici.

Realizata astfel: 1 – S-au stabilit grupurile profesionale si persoanele care vor fi expertizate medical, prin chestionar si vizite la toate locurile de munca. 2 – Cercetarea aplicativa a cuprins 292 angajati care lucreaza cu agenti biologici clasificati in “Lista europeana” in categoriile 1, 2 si 3. 3 – Expertizarea clinica s-a efectuat la nivelul Cabinetului de Medicina Muncii din Institutul Cantacuzino si la nivelul Catedrei de Medicina Muncii din  UMF “Carol Davila”, iar expertizarea paraclinica s-a efectuat la nivelul Centrelor Nationale de Expertiza din Institutul Cantacuzino si cu ajutorul unor terti stabiliti prin licitatie. 4 – Asimilarea rezultatelor si darea in curs a prelucrarii statistice si a construirii “Bazei de date” la nivelul Cabinetului de Medicina Muncii din Institutul Cantacuzino si a Catedrei de Medicina Muncii din UMF “Carol Davila”, conform cu H.G. 355/2007. 5 – Expertizarea de catre INCD Protectia Muncii in trei sedinte de audit a locurilor de munca in care isi desfasoara activitatea lucratorii expertizati medical, care au fost conforme cu Ghidul national de biosiguranta.

Etapa 3 (1.09. – 30.11. 2007)

Concepere modele integrate a politicii de sanatate si securitate in munca cu expunere la agenti biologici pentru categoriile profesionale cercetate.

Realizata astfel: 1 – S-au definitivat asimilarea rezultatelor si construirea bazelor de date. 2 – S-a dat curs analizei si prelucrarii statistice a rezultatelor. 3 – S-au conceput diverse modele de politica a sanatatii si securitatii in munca cu expunere la agenti biologici, la categoriile profesionale cercetate, in scopul completarii sistemului de expertiza deja derulat din fazele precedente si a clasificarii riscului biologic infectios.

Etapa 4 (1.12.2007 – 30.06.2008)

Valorificarea rezultatelor cercetarii aplicative. Analiza comparativa a rezultatelor pentru fiecare grupa profesionala, clasificarea riscului, stabilirea si diseminarea programului de masuri catre unitatile incluse in sistemul cu expunere la riscul biologic, analiza de catre autoritatile competente in vederea implementarii sistemului de evaluare si gestionare a riscului biologic la nivel national.

Realizata astfel: 1 – A rezultat urmatoarea patologie profesionala conform nomenclatorului national: toxoplasmoza forma anamnestica, toxocaroza, hepatita B si C cu viremie cuantificata, afectiuni cardiovasculare cronice, musculoosoase si dermatologice cronice. In functie de afectiune, expertiza medicala a fost completata cu: scrisoare metodologica catre medicul de familie, consult de specialitate suplimentar, masuri de prevenire selective la locurile de munca retinandu-se faptul ca acestea din urma sunt conforme cu Ghidul national de biosiguranta. 2 – Evaluarea riscului infectios ocupational s-a realizat in functie de clasificarea gravitatii afectiunii (crescuta, serioasa, moderata, scazuta) si a probabilitatii unui agent biologic de a cauza boala (foarte mare, mare, medie, mica). Au rezultat coeficienti (indici) de risc infectios cu valoare pozitiva evident submedie (pe o scara de 1 – 16). Cu cat indicele se apropie de valoarea maxima, cu atat mai mare va fi prioritatea acordata in controlarea riscului. 3 – A fost intocmit de catre INCD Protectia Muncii un Program de masuri profilactice (in extenso) aplicabil in unitatile cu risc de expunere la agenti biologici, analizat si aprobat de INCDMI Cantacuzino si Ministerul Muncii, material care va sta la baza intocmirii “Ghidului de evaluare si gestionare a riscului biologic”. 4 – INCDMI Cantacuzino in calitate de Coordonator, a organizat “Prima Conferinta Nationala a Asistentilor  Medicali de Medicina Muncii” la Institutul de Igiena si Sanatate Publica Bucuresti, in 6 -7 iunie 2008. Toate comunicarile au fost publicate in “Revista romana de Medicina Muncii”  nr. 2/2008.

 Etapa 5 (1.07. – 10.10.2008)

Definitivarea valorificarii rezultatelor cercetarii aplicative.

Realizata astfel: 1 – S-a definitivat conceptual sistemul informational interinstitutional pentru validarea diagnosticului bolilor infectioase profesionale si s-a finalizat infiintarea si dotarea conform procedurilor GMP al unui astfel Centru in Institutul Cantacuzino (Centru de primire si inregistrare la nivel national a prelevatelor biologice, distribuirea catre laboratoarele nationale de expertiza, asimilarea si transmiterea rezultatelor catre beneficiari, prelucrarea si transmiterea rezultatelor catre autoritatile sanitare superioare) si a Cabinetului de Medicina Muncii din Institutul Cantacuzino. 2 – S-a continuat transferarea rezultatelor cercetarii prin conceperea a trei ghiduri care urmeaza sa fie tiparite cu resurse financiare personale de catre autori (coordonator si parteneri) si anume Evaluarea si gestionarea riscului biologic; Prevenirea si diagnosticul hepatitelor virale profesionale; Principii de practica in activitatile cu risc biologic. 3 – Diseminarea rezultatelor si a informatiilor in domeniu care s-a efectuat pe toata perioada derularii proiectului de catre coordonator si parteneri a constat in 11 comunicari stiintifice in tara si strainatate, 2 cursuri postuniversitare sustinute in 4 module, 1 suport curs pentru instruirea inspectorilor de protectia muncii, instruiri la nivelul Inspectoratelor judetene de protectia muncii si DSP judetene. 4 – Redactarea rapoartelor de cercetare-dezvoltare si a rapoartelor stiintifice corespunzatoare finalizarii proiectului.

Proiect CEEX nr. 164/2006

Descarca Ghid Proiect

Titlul proiectului: Controlul transmisiei pe verticală a infecţiilor asociate sarcinii prin testarea gravidelor şi nou-născuţilor aplicând metode şi tehnici moderne de serologie şi biologie moleculară în vederea validării unui algoritm de diagnostic cost-eficient

Parteneri:

· Coordonator: Institutul Naţional de Cercetare Dezvoltare pentru Microbiologie şi Imunologie „Cantacuzino”. Director de proiect: Dr. Mircea Panait (2006-2007) si Prof. Dr. Dan Steriu (2007-2008)

· Partener 1: Institutul de Ocrotire a Mamei şi Copilului „Alfred Rusescu” – Departamentul Obstetrică-Ginecologie Polizu. Responsabil ştiinţific: Prof. Dr. Gabriel Bănceanu

· Partener 2: Spitalul Clinic de Obstetrică Ginecologie „Prof. Dr. Panait Sârbu”. Responsabil ştiinţific: Prof. Dr. Bogdan Marinescu

În prima etapă au fost selectate tehnici şi metode de serologie şi biologie moleculară pentru investigarea unor infecţii asociate sarcinii. S-au analizat specificaţiile tehnice în vederea introducerii noilor metode de biologie moleculară sau identificare serologică pentru investigarea transmisiei pe verticală a unor infecţii asociate sarcinii. Au fost stabilite criteriile de constituire a loturilor de gravide şi nou-născuţi, metodologia de informare şi obţinere a consimţământului scris de la gravide pentru participarea la studiu, precum şi parametrii de urmărire a gravidelor şi nou-născuţilor cu suspiciune de infecţii asociate sarcinii sau perinatale. S-au recoltat si stocat probe biologice (sange matern, lichid amniotic, sange fetal), care au fost supuse investigatiilor de laborator prin aplicarea metodelor si tehnicilor selectate. Au fost identificati si caracterizati factori de risc epidemiologici si clinici pentru infectiile perinatale. Au fost create baze de date cu rezultatele determinarilor efectuate pe probele de laborator. S-au efectuat corelatii statistice intre statusul clinic si incarcarea virala / genotipul viral, intre momentul instalarii infectiilor virale, bacteriene si parazitare si evolutia sarcinii. Au fost stabilite conduitele de supraveghere si terapeutice pentru infectiile cu transmitere pe verticala si potential de aparitie a unor malformatii grave. In final, s-au formulat algoritmi de diagnostic si recomandari pentru fiecare categorie de infectii care au constituit subiectul studiului.

Rezultate obtinute:

Apreciem că, la finalul proiectului, instituţiile implicate în realizarea lui au devenit mai bine dotate material, si sunt deja capabile să funcţioneze într-o reţea care, speram ca se va putea lărgi în viitor la nivel naţional, având ca preocupări principale:

– Depistarea precoce prin metode actualizate, standardizate şi cost-eficiente a infecţiilor asociate sarcinii, care pot pune în pericol soarta produsului de concepţie şi starea de sănătate a copiilor după naştere.

– Continuarea activităţilor de cercetare aplicativă şi precompetitivă, în scopul perfecţionării algoritmului de diagnostic al infecţiilor perinatale.

– Orientarea cercetărilor spre aria tematică europeană de sănătate care urmăreşte asigurarea sănătăţii mamei şi copilului.

Rezultatele proiectului pot fi diseminate către potenţialii beneficiari prin ghidul cu recomandările proiectului, în care va a fost elaborată metodologia de diagnostic al infecţiilor asociate sarcinii, în acord cu standardele internaţionale în uz, pentru a se putea asigura un management corespunzător al gravidelor şi nou-născuţilor cu astfel de afecţiuni.